摘要 以“安砂小葉薯”組培苗為試驗(yàn)材料，研究4種抗氧化劑（檸檬酸、抗壞血酸、植酸、硝酸銀）和2種吸附劑［活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）］在褐苞薯蕷組培繼代培養(yǎng)過(guò)程中的抗褐化效果及其對(duì)增殖和生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，4種抗氧化劑均不適合用作抗褐化劑，2種吸附劑中，PVP 0.2" g/L抗褐化效果最佳，褐化指數(shù)降低，有效芽率提高?；钚蕴繉?duì)降低褐化指數(shù)效果不顯著，但可以減輕褐化危害，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高有效芽率。

關(guān)鍵詞 褐苞薯蕷；組織培養(yǎng)；褐化；抗褐化劑

中圖分類(lèi)號(hào) S632.1" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A" 文章編號(hào) 0517-6611（2025）03-0025-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.005

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Different Antioxidants and Sorbents on Tissue Browning of Dioscorea persimilis

LI Li hong，HUA" Shu mei，CHEN" Zhi hua et al

（Sanming Academy of Agricultural Sciences /Fujian Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Innovative Utilization for Mountain Area， Sanming， Fujian" 365051）

Abstract The tissue cultured seedlings of Dioscorea persimilis cv.AnSha was used as experimental material to study the effects of four antioxidants （citric acid， ascorbic acid， phytic acid，silver nitrate） and two adsorbents （activated carbon （AC），Polyvinylpyrrolidone acid （PVP）） on anti browning，growth and multiplication of subculture propagators in tissue culture.The results showed that four antioxidants were not suitable for use as anti browning agents. The optimum dosage of PVP was 0.2" g/L" in the two treatments of adsorbents， the explants browning index were significantly decreased and the effective germination rate were increased.The activated carbon had no significant effect on decreasing browning index， but it mitigated the harm of browning， promoted the growth and effective rate of bud.

Key words Dioscorea persimilis；Tissue culture；Browning；Browning inhibitors

基金項(xiàng)目 三明市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021-N-9）。

作者簡(jiǎn)介 李麗紅（1980—），女，河南焦作人，副研究員，碩士，從事植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究。

收稿日期 2024-03-11

褐苞薯蕷在南方各地俗稱(chēng)“薯仔”“小薯”等，在福建、廣西、海南等地被作為山藥的地區(qū)習(xí)用品，藥用與食用由來(lái)已久。山藥為營(yíng)養(yǎng)繁殖，長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖，許多優(yōu)良品種出現(xiàn)病害加重、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降現(xiàn)象。生產(chǎn)上一般采用零余子繁殖的方式提純復(fù)壯山藥品種，但褐苞薯蕷具有不結(jié)實(shí)零余子的特性，無(wú)法通過(guò)這種方式達(dá)到復(fù)壯的目的。筆者所在課題組前期研究結(jié)果表明，通過(guò)植物組織培養(yǎng)的方法可以達(dá)到提純復(fù)壯褐苞薯蕷種薯的效果^［1］，但由于褐苞薯蕷在組培過(guò)程中容易褐化，有效增殖效率低。因此，如何減輕褐化危害，提高有效增殖率是一項(xiàng)迫切需要解決的技術(shù)。

褐化又稱(chēng)褐變，是由于植物材料在組織培養(yǎng)過(guò)程中受到傷害，體內(nèi)分泌的酚類(lèi)物質(zhì)在酚氧化酶作用下被氧化成褐色的醌類(lèi)物質(zhì)^［2］，而醌類(lèi)物質(zhì)對(duì)植物材料產(chǎn)生毒害作用，影響其生長(zhǎng)和分化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致組織死亡。目前科研工作者對(duì)不同類(lèi)型山藥組培的研究較多^［3-7］，但有關(guān)其褐化原因及如何控制褐化的研究較少，在防褐化劑試驗(yàn)中前人研究了山藥不同外植體褐化情況以及幾種某一濃度的防褐劑對(duì)

褐化率的影響，未見(jiàn)對(duì)增殖和生長(zhǎng)的影響，而最理想的抗褐化劑是既能控制褐化又不影響植物的正常生長(zhǎng)^［8］。且在前期研究中筆者發(fā)現(xiàn)，褐苞薯蕷比薯蕷、參薯、山薯等其他山藥類(lèi)型組培褐化危害問(wèn)題更嚴(yán)重，組培過(guò)程中易出現(xiàn)因褐化造成新芽生長(zhǎng)停滯甚至死亡的現(xiàn)象。因此，筆者通過(guò)在培養(yǎng)基中添加不同濃度的抗褐化劑，統(tǒng)計(jì)其褐化指數(shù)、增殖系數(shù)、有效芽率，并記錄生長(zhǎng)情況，篩選出既能較好地控制組培苗褐化，又不影響其生長(zhǎng)的抗褐化劑及適宜濃度，減輕褐化危害，為實(shí)現(xiàn)褐苞薯蕷組培苗規(guī)模化生產(chǎn)以及組培復(fù)壯技術(shù)的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年在三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種苗繁育中心進(jìn)行，供試山藥品種為福建地方優(yōu)良品種“安砂小葉薯”，以安砂小葉薯繼代培養(yǎng)1年的組培苗為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的不定芽接種到MS+KT 1.0" mg/L+6-BA 0.3" mg/L +NAA 0.05 mg/L+蔗糖30" g/L+瓊脂5.5 g/L的繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的4種抗氧化劑（檸檬酸、植酸、抗壞血酸、硝酸銀）和2種吸附劑（活性炭、PVP），具體使用濃度見(jiàn)表1，以不添加任何抗褐化劑的處理為對(duì)照?？箟难岷拖跛徙y采用過(guò)濾滅菌法加入培養(yǎng)基以防止其受熱分解，其他防褐劑直接加入培養(yǎng)基中進(jìn)行高壓滅菌。培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，培養(yǎng)條件為溫度（25±2）℃，光照時(shí)數(shù)14 h/d，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。每處理接種3瓶，每瓶接種10 株，重復(fù)3次。

根據(jù)材料周?chē)囵B(yǎng)基褐化顏色和褐化半徑（褐色物質(zhì)的溢出半徑），將褐化程度分為6級(jí)，分別用0、1、2 、3 、4、5表示。0級(jí)，無(wú)褐化，培養(yǎng)基半透明狀；1級(jí)，切口褐色，周?chē)囵B(yǎng)基仍半透明；2級(jí)，切口有淡褐色物質(zhì)滲出，材料周?chē)睆?.5 cm范圍內(nèi)淺褐色，輕度褐化;3級(jí)，褐化加重，材料周?chē)囵B(yǎng)基呈現(xiàn)褐色或直徑大于0.5 cm小于1.0 cm范圍淺褐色;4級(jí)，嚴(yán)重褐化，材料周?chē)囵B(yǎng)基呈黑褐色或者褐色直徑達(dá)1.0 cm以上;5級(jí)，材料褐化死亡。褐化指數(shù)計(jì)算公式：褐化指數(shù)=∑（褐化級(jí)別×該級(jí)別的株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100％，增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后瓶?jī)?nèi)總芽數(shù)/接種時(shí)的總芽數(shù)，有效芽率=有效芽數(shù)/增殖后瓶?jī)?nèi)總芽數(shù)×100%，有效芽標(biāo)準(zhǔn)為高度≥2.0 cm，新芽無(wú)褐化跡象，葉片舒展。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2013、DPS v7.65軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對(duì)褐苞薯蕷組培苗褐化及生長(zhǎng)的影響

2.1.1 不同濃度檸檬酸對(duì)褐化指數(shù)與生長(zhǎng)的影響。

由圖1可知，不同濃度檸檬酸處理在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中褐化指數(shù)均高于對(duì)照，培養(yǎng)21 d時(shí)褐化程度基本達(dá)到4級(jí)，之后趨于平穩(wěn)。說(shuō)明添加檸檬酸不僅未抑制褐化作用，反而在前期會(huì)加重褐化，加快褐化進(jìn)程。

從表1可以看出，當(dāng)檸檬酸為0.1 g/L時(shí)，褐苞薯蕷生長(zhǎng)基本正常，但增殖系數(shù)和有效芽率均顯著低于對(duì)照。當(dāng)檸檬酸濃度為0.5 g/L時(shí)，葉色開(kāi)始變黃，并隨著檸檬酸濃度的增加，對(duì)生長(zhǎng)和增殖的不良影響越嚴(yán)重，有效芽率顯著下降。試驗(yàn)結(jié)束后30 d發(fā)現(xiàn)檸檬酸2.0和3.0 g/L的處理植株出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，說(shuō)明對(duì)褐苞薯蕷而言，添加檸檬酸非但沒(méi)有降低褐化作用，反而會(huì)加重褐化，抑制生長(zhǎng)，因此檸檬酸不適宜用于控制褐苞薯蕷組培褐化。

2.1.2 不同濃度植酸對(duì)褐化指數(shù)與生長(zhǎng)的影響。

由圖2可知，在轉(zhuǎn)接后7～21 d，不同濃度植酸處理的褐化指數(shù)均高于對(duì)照，培養(yǎng)21 d時(shí)，0.5和1.0 g/L植酸處理與對(duì)照的褐化指數(shù)相當(dāng)，但0.1、1.0、2.0 g/L植酸處理仍高于對(duì)照，35 d時(shí)對(duì)照和各植酸處理褐化指數(shù)基本相同，因此植酸對(duì)抑制褐苞薯蕷的褐化無(wú)作用，反而會(huì)加快褐化進(jìn)程。

由表2可知，當(dāng)植酸濃度在0.1～1.0 g/L時(shí)，增殖系數(shù)略有下降但與對(duì)照差異未達(dá)顯著水平，當(dāng)植酸用量達(dá)2.0 g/L時(shí)，增殖系數(shù)顯著低于對(duì)照，說(shuō)明高濃度的植酸不利于增殖。加入植酸，植株的葉色黃，生長(zhǎng)較差，有效芽率顯著降低，故植酸不能用來(lái)抑制褐苞薯蕷組培過(guò)程中的褐化。

2.1.3 不同濃度硝酸銀對(duì)褐化指數(shù)與生長(zhǎng)的影響。

由圖3可知，當(dāng)硝酸銀濃度為1.0 mg/L時(shí)，褐化指數(shù)與對(duì)照相接近外，其他處理均低于對(duì)照，說(shuō)明硝酸銀具有一定抑制褐化的效果。其中50和100 mg/L處理效果較好，褐化指數(shù)為52.5%和55.5%，褐化程度多數(shù)在三級(jí)左右。

從表3可以看出， 1.0～10.0 mg/L硝酸銀對(duì)增殖系數(shù)和有效芽率無(wú)顯著不良影響，但50.0和100.0" mg/L硝酸銀會(huì)造成增殖系數(shù)和有效芽率顯著降低，因此，低濃度的硝酸銀對(duì)增殖和生長(zhǎng)影響不大，但高濃度的硝酸銀雖然降低褐化指數(shù)的效果較好，但降低增殖系數(shù)和有效芽率，因此對(duì)褐苞薯蕷而言，硝酸銀也不是合適的抗褐化劑。

2.1.4 不同濃度抗壞血酸對(duì)褐化指數(shù)與生長(zhǎng)的影響。

由圖4可知，7 d時(shí)抗壞血酸處理與對(duì)照褐化指數(shù)相同，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不同濃度抗壞血酸處理的褐化程度逐漸高于對(duì)照，其褐化程度和濃度之間無(wú)明顯規(guī)律，35 d時(shí)，褐化程度與對(duì)照基本相同。因此，不同濃度抗壞血酸對(duì)抑制褐化均無(wú)明顯作用。

從表4可以看出，添加0.1～200.0 mg/L的抗壞血酸對(duì)褐苞薯蕷的生長(zhǎng)未造成不良影響，但除抗壞血酸0.1" mg/L處理有效芽率和對(duì)照差異不顯著外，1.0～200.0 mg/L處理的有效芽率顯著低于對(duì)照。因此，抗壞血酸不適宜作為褐苞薯蕷組培的防褐劑。

2.2 不同吸附劑對(duì)褐苞薯蕷組培苗褐化及生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同濃度PVP對(duì)褐化指數(shù)與生長(zhǎng)的影響。

PVP 是一種酚類(lèi)物質(zhì)專(zhuān)用吸附劑，通過(guò)氫鍵與酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)合，減少酚類(lèi)物質(zhì)的毒害，起到減輕褐化的作用。從圖5可以看出，添加PVP可以顯著降低褐化指數(shù)，有效減輕褐化程度，說(shuō)明PVP具有明顯的抑制褐化的作用，但其抑制褐變的效果隨PVP的濃度增加呈降低趨勢(shì)，以0.2～1.0" g/L PVP效果更好。

由表5可知，PVP各處理對(duì)增殖系數(shù)無(wú)顯著影響，但隨著PVP濃度的增加，其有效芽率呈降低趨勢(shì)，表現(xiàn)為芽小，生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明高濃度的PVP有一定抑制生長(zhǎng)的作用。綜合褐化指數(shù)與生長(zhǎng)情況，以PVP 0.2 g/L為最佳處理，可以作為褐苞薯蕷的防褐化劑。

2.2.2 不同濃度AC對(duì)褐化指數(shù)與生長(zhǎng)的影響。

AC 具有吸附特性，在試管苗繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，添加0.1和0.5 g/L的活性炭在前期褐化指數(shù)與對(duì)照相近，但后期褐化指數(shù)則會(huì)低于對(duì)照，說(shuō)明添加活性炭具有一定減輕褐化的作用（圖6）。由于活性炭用量大于1.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黑色，無(wú)法記錄褐化程度，造成數(shù)據(jù)缺失。

從表6可以看出，添加活性炭作為防褐劑，褐苞薯蕷的增殖系數(shù)明顯降低，但有效芽率顯著高于對(duì)照，說(shuō)明活性炭對(duì)生長(zhǎng)有利，但對(duì)增殖不利。原因可能是活性炭具有無(wú)選擇吸附性，它在吸附培養(yǎng)基中醌類(lèi)等有害物質(zhì)的同時(shí)，還吸附生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)增殖造成影響。因此添加活性炭作為防褐劑時(shí)應(yīng)少量添加或者在添加的同時(shí)提高培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度。

3 結(jié)論與討論

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，添加抗褐化劑是控制褐化現(xiàn)象發(fā)生的常見(jiàn)方法，最理想的抗褐化劑是既能控制褐化又不影響植物的正常生長(zhǎng)。研究認(rèn)為在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可以明顯減少褐變發(fā)生^［9］。該研究結(jié)果表明，4種抗氧化劑均不適宜用于控制褐苞薯蕷的組培褐化，2種吸附劑PVP和AC則明顯優(yōu)于抗氧化劑。但在蘭花春劍花梗組織培養(yǎng)研究中，郭翠娥^［10］研究表明，抗氧化劑中抗壞血酸和檸檬酸防褐化效果好，吸附劑PVP和AC的防褐化效果不理想，甚至加劇外植體褐變，與該研究結(jié)果相反。說(shuō)明不同植物對(duì)抗氧化劑和吸附劑的反應(yīng)差別較大。

褐苞薯蕷在轉(zhuǎn)接后3 d左右材料切口處變褐，7 d左右傷口處開(kāi)始溢出淡褐色物質(zhì)，隨時(shí)間推移，褐色逐漸加深或不斷擴(kuò)散至整個(gè)培養(yǎng)基。褐苞薯蕷的褐化率在7 d后基本達(dá)100%，添加防褐化劑并不能降低褐化率，只能在一定程度上減輕褐化程度。該試驗(yàn)中檸檬酸非但沒(méi)有降低褐化指數(shù)，減輕褐化程度的效果，反而會(huì)加重褐化，且隨濃度增加對(duì)增殖和生長(zhǎng)均產(chǎn)生不利影響。植酸會(huì)加速褐化進(jìn)程，添加植酸后，葉色會(huì)變黃。在銀杏愈傷組織防褐化研究中，邵菊芳等^［11］也認(rèn)為植酸無(wú)論是抗褐化效果還是對(duì)愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)都不理想，且隨著濃度的增加，銀杏愈傷組織中其葉綠素含量減小，與該試驗(yàn)中的現(xiàn)象相吻合，研究結(jié)果相一致。但秦衛(wèi)東等^［12］研究表明，一定范圍內(nèi)，隨植酸濃度的增大，銀杏愈傷組織的褐變程度減輕，生長(zhǎng)量提高，當(dāng)濃度超過(guò)0.1%時(shí)，愈傷組織褐變程度略有增加，生長(zhǎng)量也有所降低?？梢?jiàn)同一種植物，不同品種對(duì)同一防褐劑的反應(yīng)也不同。

該試驗(yàn)中，硝酸銀對(duì)降低褐化指數(shù)具有一定作用，并以高濃度的硝酸銀效果最好，但高濃度的硝酸銀會(huì)降低增殖系數(shù)和有效芽率。原因可能是當(dāng)硝酸銀濃度高時(shí)，Ag+會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地進(jìn)入葉綠素分子內(nèi)，改變其結(jié)構(gòu)，使其功能喪失，蛋白質(zhì)的合成也相應(yīng)地受到抑制，進(jìn)而抑制生長(zhǎng)^［13］。陳琴芳等^［14］研究表明12～15 mg/L AgNO3可以有效抑制葉片褐化，但不定芽分化率明顯降低，與該研究結(jié)果基本一致。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，添加硝酸銀的培養(yǎng)基其褐化物質(zhì)能較好地向周?chē)鷶U(kuò)散，一定程度上降低了褐化程度，而添加檸檬酸和植酸的培養(yǎng)基，褐化物僅聚集在材料附近，基本不擴(kuò)散，褐化顏色近乎黑色，故褐化及危害程度更重?？箟难釋?duì)抑制褐苞薯蕷的褐化無(wú)明顯效果，且隨著濃度增加培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，褐化指數(shù)還會(huì)高于對(duì)照。在紫山藥莖尖和莖段培養(yǎng)過(guò)程中，王碧琴等^［5］研究表明添加抗壞血酸沒(méi)有抑制褐化的效果，反而對(duì)培養(yǎng)基凝固有負(fù)作用，與該研究結(jié)果基本一致。

蔡建榮^［3］研究表明，150 mg/L PVP能有效抑制“寸金薯”外植體褐化，褐化率最低，效果最好，但未見(jiàn)其對(duì)增殖和生長(zhǎng)情況的報(bào)道。雖然試驗(yàn)材料不同，但該試驗(yàn)中PVP對(duì)控制褐化也明顯的作用，對(duì)增殖系數(shù)無(wú)影響，但隨著濃度的升高，有效芽率降低，考慮到控制褐化與兼顧生長(zhǎng)，PVP的濃度以0.2 g/L最合適。該研究中，活性炭對(duì)降低褐化指數(shù)具有一定效果，但隨著活性炭使用量的增加，增殖系數(shù)會(huì)顯著降低，但添加活性炭可有效促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)，提高有效芽率， 因此，添加活性炭有減輕褐化危害、促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中防褐化技術(shù)研究中劉真華等^［15］、王立婭等^［16］也有同樣的觀(guān)點(diǎn)。

添加防褐劑，無(wú)論是抗氧化劑還是吸附劑，均會(huì)在一定程度上影響培養(yǎng)基的性質(zhì)和培養(yǎng)物的質(zhì)量，即使是合適劑量，若長(zhǎng)期使用也會(huì)產(chǎn)生不良影響，如在枇杷胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)中，如果連續(xù)多代使用AgNO3，不但會(huì)抑制愈傷組織分化，而且愈傷組織褐變也會(huì)嚴(yán)重^［17］，因此，使用防褐劑

時(shí)既要根據(jù)植物本身的特點(diǎn)選擇合適類(lèi)型和濃度的防褐劑，又要把握好使用次數(shù)。在使用活性炭控制褐化時(shí)，則應(yīng)注意調(diào)整活性炭與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等培養(yǎng)基成分的用量，使兩者協(xié)同發(fā)揮作用。

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