摘 要：為探索DNA條形碼對(duì)渤海灣部分魚類物種鑒定的有效性并進(jìn)行相關(guān)的遺傳分析，對(duì)天津渤海灣10種海水魚類共177條線粒體COI基因序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序和比對(duì)分析。結(jié)果表明，10種海水魚類COI基因T、C、A和G堿基平均含量分別為30.0%、27.9%、24.1%、18.0%，具有堿基偏倚性，177個(gè)基因序列共檢測(cè)到70個(gè)單倍型。遺傳多樣性分析顯示，總體的單倍型多樣性為0.432 7～0.947 4，核苷酸多樣性為0.000 8～0.006 3，其中焦氏舌鰨（Cynoglossus joyneri）的變異位點(diǎn)、單倍型數(shù)和單倍型多樣性最高。遺傳距離結(jié)果顯示，種間遺傳距離為0.237 5～0.357 5，其中種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的77倍。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)具有明顯的分化譜系，與形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果相吻合。研究結(jié)果表明，DNA條形碼技術(shù)可以對(duì)天津近岸海域常見(jiàn)的10種魚類進(jìn)行有效鑒定，相關(guān)遺傳分析可為天津渤海灣魚類資源保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；COI基因；遺傳多樣性；魚類

中圖分類號(hào)：S917.4 """"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-6755（2025）01-0025-07

我國(guó)海洋生物資源豐富，海洋生物多樣性是檢測(cè)生態(tài)系統(tǒng)健康的一個(gè)重要指標(biāo)。魚類作為其中的重要組成部分，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)了關(guān)鍵地位。在傳統(tǒng)的魚類物種鑒定中，多以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)進(jìn)行分類鑒定，不僅難以準(zhǔn)確辨別形態(tài)相似性很高的物種，同時(shí)還必須在樣本完整的前提下完成。而DNA條形碼技術(shù)可以利用生物體DNA中的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化短遺傳標(biāo)記來(lái)識(shí)別其屬于特定物種[1-2]。DNA條形碼在2003年被引入作為動(dòng)物生物物種識(shí)別的方法，Hebert等[3]建議將線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基1（COI）基因的650 bp左右片段作為動(dòng)物物種全球生物學(xué)鑒定的通用標(biāo)記或“DNA條形碼”。目前該技術(shù)已成為一種高效的分子分類工具，越來(lái)越多的研究表明其可快速、準(zhǔn)確地鑒定魚類物種并進(jìn)行遺傳多樣性分析[4-5]。

天津海域位于半封閉的渤海灣頂部，所轄海域面積約2 146 km2，海岸線北起天津河北行政區(qū)域北界線與海岸線交點(diǎn)（澗河口以西約2.4 km處），南至歧口，全長(zhǎng)153.2 km。其自然條件優(yōu)越，基礎(chǔ)餌料豐富，曾是渤海灣多種經(jīng)濟(jì)洄游魚、蝦類產(chǎn)卵場(chǎng)，潮間帶更是蘊(yùn)藏著豐富的貝類生物資源，歷史上有“天然漁場(chǎng)”之稱。

據(jù)近幾年的漁業(yè)資源調(diào)查結(jié)果顯示，天津渤海灣漁業(yè)資源無(wú)論是種類還是數(shù)量上，都明顯少于歷史調(diào)查數(shù)據(jù)[6]。全面了解天津近岸海域經(jīng)濟(jì)海洋水產(chǎn)生物資源和生態(tài)環(huán)境狀況是開(kāi)展水生生物資源養(yǎng)護(hù)，合理開(kāi)發(fā)和利用海洋漁業(yè)資源的前提。本研究在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上對(duì)天津渤海灣10種魚類177條線粒體COI基因序列進(jìn)行分析，探討COI基因序列作為DNA條形碼在天津渤海灣魚類分類中的應(yīng)用，建立條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，了解和掌握天津渤海灣魚類分布規(guī)律，為制定合理的漁業(yè)資源保護(hù)措施提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)海岸線的走向及其包括的海域，共設(shè)8個(gè)站點(diǎn)，均勻分布于整個(gè)渤海灣（見(jiàn)圖1）。租用247 kW漁業(yè)生產(chǎn)船只，使用單拖網(wǎng)（網(wǎng)口寬12 m，囊網(wǎng)網(wǎng)目20 mm），在設(shè)定的站位拖網(wǎng)0.5 h，拖速2～3 kn，對(duì)游泳動(dòng)物進(jìn)行采樣。每個(gè)種類樣本數(shù)量見(jiàn)表1，剪取鰭條組織放入裝有無(wú)水乙醇的離心管中，對(duì)樣本進(jìn)行編號(hào)，放入低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品分類

根據(jù)《天津水域魚類資源種類名錄及原色圖譜》[7]進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒定，177個(gè)樣品個(gè)體歸屬于4目，8科，10屬，10種（表1）。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用醋酸銨沉淀法提取基因組DNA[8]，NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增引物為魚類DNA條形碼擴(kuò)增的通用引物[9]，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為Fish11F：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC；Fish11R：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為50 μL，含5 μL 10×Buffer，5 μL dNTP（10 mmol/L）、正反向引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板2.5 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL ，ddH2O 35 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 序列分析

將測(cè)序結(jié)果用BioEdit 7.0.5軟件進(jìn)行編輯校正。用MEGA v11軟件[10]進(jìn)行同源比對(duì)，確定序列長(zhǎng)度，并統(tǒng)計(jì)DNA序列的堿基組成。統(tǒng)計(jì)得到序列堿基分布及變異情況，計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，經(jīng)過(guò)1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)的Bootstrap值表示樹(shù)上各分支的置信度。用DNAsp v6軟件[11]計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列分析與單倍型分布

測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)校正和比對(duì)分析，獲得10種魚類177個(gè)個(gè)體的COI基因序列，長(zhǎng)度為631 bp。MEGA 7.0軟件分析結(jié)果顯示，序列的T、C、A和G堿基平均含量分別為30.0%、27.9%、24.1%、18.0%，A+T含量（54.1%）略高于G+C含量（45.9%）。其中G+C在密碼子第1位點(diǎn)的含量最高（55.4%），除C以外，其余3個(gè)堿基在密碼子第1、2、3位點(diǎn)分布都不平均（表2）。COI基因密碼子的變異統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，共有不變位點(diǎn)509個(gè)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)（69個(gè)）多于顛換位點(diǎn)（52個(gè)），轉(zhuǎn)換與顛換比為5.36（表3），說(shuō)明在序列中轉(zhuǎn)換多于顛換。10種魚類177個(gè)個(gè)體，共檢測(cè)到70個(gè)單倍型，單倍型Genebank序列號(hào)見(jiàn)表4。

2.2 遺傳多樣性分析

10種魚類的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，所比對(duì)序列中共檢測(cè)出保守位點(diǎn)370個(gè)、多態(tài)性位點(diǎn)261個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)260個(gè)、單突變位點(diǎn)1個(gè)?？傮w的單倍型多樣性為0.972 1，核苷酸多樣性為0.193 1。其中焦氏舌鰨的變異位點(diǎn)、單倍型數(shù)和單倍型多樣性均最高，斑尾刺蝦虎魚的最低（表5）。

2.3 種內(nèi)距離與種間距離

對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)所收集的177條COI序列，利用MEGA v11軟件，基于K2P雙參數(shù)模型，計(jì)算出177條魚的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離（見(jiàn)表6）。結(jié)果顯示，10種魚類的種內(nèi)平均遺傳距離為0.003 8，并且10種魚類的種內(nèi)遺傳距離均小于DNA條形碼規(guī)定的最小種內(nèi)遺傳距離0.020 0。其中焦氏舌鰨的種內(nèi)遺傳距離最大，為0.006 8；斑尾刺蝦虎魚的種內(nèi)遺傳距離最小，為0.002 1。

10種魚類的種間平均遺傳距離0.293 6，是種內(nèi)平均遺傳距離的77倍。其中銀鯧和斑鰶的種間遺傳距離最大，為0.357 5；銀鯧和藍(lán)點(diǎn)馬鮫的種間遺傳距離最小，為0.237 5。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

通過(guò)鄰接法NJ（Neighbor-Joining）構(gòu)建了10種魚類70個(gè)單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），結(jié)果顯示同種魚類的不同單倍型均聚為一支，具有明顯的分化譜系，與形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果相吻合。

3 討論

天津渤海灣位于渤海西部，是眾多魚、蝦、蟹、貝等海洋生物的產(chǎn)卵場(chǎng)、索餌場(chǎng)和育肥場(chǎng)，素有“天然魚池”之稱，在我國(guó)漁業(yè)水域中占有非常重要的地位。近年來(lái)，由于海洋污染和過(guò)度捕撈等因素的影響，渤海灣的漁業(yè)資源量曾經(jīng)歷顯著下降。有研究表明2019年和2020年的游泳動(dòng)物平均密度和生物量均低于2015年和2016年，種群特征顯示生物多樣性水平并不高[6]。近幾年通過(guò)開(kāi)展人工增殖放流、投放人工魚礁、設(shè)立禁漁期等多項(xiàng)措施，監(jiān)測(cè)評(píng)估漁業(yè)資源正在逐步恢復(fù)。在大多數(shù)硬骨魚中，COI基因序列的AT含量均高于GC含量，具有一定的AT偏倚性[12]。本研究結(jié)果A+T含量（54.1%）略高于G+C含量（45.9%），與已有研究結(jié)果一致。其中密碼子的第一位點(diǎn)堿基GC分布頻率最高，為55.4%，這與劉凱瑩[13]研究結(jié)果相似。在分子進(jìn)化研究中，轉(zhuǎn)換顛換比值可以體現(xiàn)DNA序列的進(jìn)化方向和物種間的關(guān)系，同時(shí)也可反映進(jìn)化頻率[14]。本研究中堿基變異的轉(zhuǎn)換與顛換比為5.36，轉(zhuǎn)換多于顛換，說(shuō)明序列可能在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了較少的突變。

遺傳多樣性是評(píng)估種群資源狀況的一個(gè)重要依據(jù)，因此加強(qiáng)魚類遺傳多樣性的保護(hù)和研究具有重要意義[15]。遺傳多樣性指的是物種群體內(nèi)所有遺傳信息的總和，魚類遺傳多樣性是魚類生存、適應(yīng)和進(jìn)化的基礎(chǔ)，對(duì)于維護(hù)水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定具有重要意義。一般遺傳多樣性較高的物種，具有更強(qiáng)的適應(yīng)生存能力和進(jìn)化潛力。遺傳多樣性主要包括線粒體DNA的單倍型多樣性和核苷酸多樣性指標(biāo)[16]。Grant等[17]研究結(jié)果表明，單倍型多樣性的臨界值為0.5，核苷酸多樣性的臨界值為0.005。兩者的值越高，遺傳多樣性程度就越高。本研究中的10種魚類總體的單倍型多樣性達(dá)到0.972 1，除斑尾刺蝦虎魚和黃鯽的單倍型多樣性較低（0.432 7和0.5000 ）外，其他9種魚類的單倍型多樣性都在0.5以上，其中斑鰶（0.781 8）、焦氏舌鰨（0.947 4）、髭縞蝦虎魚（0.867 6）和梭魚（0.875 0）的單倍型多樣性相對(duì)更高。從渤海灣漁業(yè)資源近年來(lái)的調(diào)查中可以看出，斑鰶、焦氏舌鰨和髭縞蝦虎魚為優(yōu)勢(shì)種[6]，具有較強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境能力和進(jìn)化潛力，而梭魚的高多樣性可能與天津市開(kāi)展的增殖放流工作有關(guān)。核苷酸多樣性結(jié)果顯示總體的核苷酸多樣性為0.193 1，焦氏舌鰨最高（0.006 3），其余9種魚類的核苷酸多樣性均較低，在0.000 8～0.002 8之間。在10種海水魚中，焦氏舌鰨的單倍型多樣性大于0.5，核苷酸多樣性大于0.005，屬于高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性類型，說(shuō)明該種群中存在多種遺傳變異，具有較高的遺傳多樣性。這些變異可能是由一個(gè)大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間歷史演化所導(dǎo)致，也可能是被兩個(gè)不同系群的種群二次接觸影響產(chǎn)生的結(jié)果[18]。其余9種魚類均屬于高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性類型，說(shuō)明這些種群曾經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)后，發(fā)生了種群的快速擴(kuò)張與變異的不斷積累[19]。

通過(guò)對(duì)天津渤海灣10種魚類的COI基因進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)不同物種之間COI基因序列組成有很大的差異性，說(shuō)明該基因在不同物種之間有一定的代表性。利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種分類和鑒定的關(guān)鍵在于兩點(diǎn)，一個(gè)是不同物種在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上可以檢測(cè)到物種的單系性，本研究中的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明同種魚類的不同單倍型均聚為一大支；另一個(gè)是物種之間的遺傳距離應(yīng)明顯大于物種內(nèi)的遺傳距離，而且種間的遺傳距離約為種內(nèi)的遺傳距離的10倍以上。Hebert等[3]分析研究了一萬(wàn)多個(gè)物種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)物種的種內(nèi)距離低于0.01。本研究的10種海水魚類，種內(nèi)的遺傳距離在0.002 1～0.006 8，均小于0.01；而種間的平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的77倍，結(jié)果證明COI基因可以對(duì)天津近岸海域常見(jiàn)的10種海魚類進(jìn)行有效鑒定。

本研究利用DNA條形碼技術(shù)中COI基因?qū)μ旖虿澈车?0種海水魚類進(jìn)行了物種分子鑒定可行性和有效性的測(cè)定，結(jié)果顯示鑒定結(jié)果快速有效。同時(shí)我們也初步掌握了渤海灣部分魚類的遺傳數(shù)據(jù)信息，為后續(xù)的魚類遺傳多樣性的保護(hù)和研究奠定基礎(chǔ)，為天津渤海灣魚類資源保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。

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Identification and genetic analysis of fish resources in Tianjin Bohai Bay based on DNA barcodes

HE Xiaoxu， BAI Xiaohui， WANG Xiaoyu， MENG Yigeng

（Tianjin Fisheries Research Institute， Tianjin 300221，China）

Abstract：In order to explore the effectiveness of DNA barcode on the identification of some fish species in the Bohai Bay and conduct relevant genetic analysis， an amplified sequencing and comparison analysis were carried out on a total of 177 mitochondrial COI gene sequences of 10 species of marine fish in Bohai Bay， Tianjin.The results showed that the average content of bases T， C， A， and G of COI gene of 10 kinds of marine fish was 30.0%， 27.9%， 24.1%， and 18.0% respectively， with base bias， and a total of 70 haplotypes were detected in 177 gene sequences. Genetic diversity analysis showed that the overall haploid diversity was 0.432 7～0.947 4， and the nucleotide diversity was 0.000 8～0.006 3， among which Cynoglossus joyneri had the highest mutation sites， haplotypes， and haploid diversity. The results of genetic distance showed that the genetic distance between species was 0.237 5～0.357 5， of which the average genetic distance between species was 77 times that of the average genetic distance within the species. The systematic evolutionary tree also had an obvious differentiation spectrum， which coincides with the morphological identification results. The results of this study showed that DNA barcode technology can effectively identify 10 species of fish commonly found in the coastal waters of Tianjin， and relevant genetic analysis can provide data support for the protection of fish resources in Tianjin Bohai Bay.

Key words：DNA barcode; COI gene; genetic diversity; fish

（收稿日期：2024-09-24）