摘" 要：在測序過程中，熒光因具有激光照射下的可區(qū)分性和良好的生物相容性，其修飾的核苷酸在核苷酸測序等多種實驗中被廣泛使用。但強光的光漂白以及堿基的熒光猝滅大大增加測序產(chǎn)品開發(fā)的難度?；诖?，該文通過使用醚鍵雜烷基結構對羅丹明和箐染料進行修飾。該方法有助于提高序列的特異性，測序過程中的熒光強度增強10%～15%，測序性能提升4%～5%。為測序產(chǎn)品的開發(fā)提供新思路。

關鍵詞：熒光修飾；醚鍵修飾；羅丹明；箐染料；熒光淬滅

中圖分類號：O69" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2095-2945（2025）03-0078-05

Abstract： Fluorescent modified nucleotides have been used in various experiments such as nucleotide sequencing. Fluorescence during sequencing requires both distinguishability under laser irradiation and good biocompatibility. However， the strong light bleaching and fluorescence quenching of bases greatly increase the difficulty of sequencing product development. By using ether bond heteroalkylation structures to modify fluorescent rhodamine and indigo dyes to improve sequence specificity， the optical intensity of fluorescence during sequencing can be enhanced by 10%～15% and sequencing performance can be improved by 4%～5%， providing new ideas for the development of sequencing products.

Keywords： fluoresce ncemodification; ether bonds modification; rhodamine; cyanine dye; fluorescence quenching

隨著醫(yī)學科技的快速發(fā)展，DNA測序技術的檢查能深入到微小的分子和基因組信息，醫(yī)療人員根據(jù)這些信息的細微不同來對診療手段進行適當?shù)恼{整和改變。目前市面主流測序方法為二代測序（熒光修飾的dNTP），其原理是用不同顏色的熒光標記4種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種熒光修飾dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定程序，從而獲得待測DNA的序列信息。

碳菁類熒光和羅丹明已經(jīng)被廣泛應用于DNA測序。然而這2類熒光具有某些缺點，核苷標記樣品的熒光淬滅[1]是成像時遇到的主要問題之一。由于光源和共振能量[2-5]的轉移尤其是激光作為光源具有更強的功率和聚焦更準確的光束，與普通熒光顯微鏡相比，標本的光減弱和光漂白作用更為明顯。為了減少堿基淬滅[6-10]、增強熒光強度[11]和提高熒光基團的光學性能[12]，近年來不同公司都致力于測序試劑中熒光基團的修飾。

基于此，本文使用醚鍵雜烷基在連接臂中增加醚鍵或PEG結構，對熒光羅丹明[13-16]和碳菁類熒光進行結構修飾并應用于測序研究中。醚鍵雜烷基結構的引入可提高熒光與核苷酸堿基之間的序列特異性，增強熒光強度，提高熒光基團在強光源下的穩(wěn)定性，減少不同核苷酸堿基對熒光基團的淬滅效用。經(jīng)過醚鍵雜烷修飾的核苷酸可提高熒光在測序過程中的光學性能，降低核酸測序的研發(fā)成本。

1" 實驗部分

1.1" 實驗儀器和試劑

主要儀器：梅特勒FE28電子天平， 鄭州長城科工貿有限公司HWCL-1型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器， SHZ-D（III）循環(huán)水真空泵、R3001旋轉蒸發(fā);浙江星星冷鏈集成股份有限公司BCD246GA冰柜，鄭州思昆生物工程有限公司Sikun2000原理機和測序儀、安捷倫 1260 AB質譜儀和1260制備液相。

主要試劑：羅丹明6G、BOP、TSTU、N-甲基-4-氨基丁酸、花氰染料cy5、 DIEA等均購置于上海阿拉丁試劑有限公司，DMF、三乙胺、乙腈購置于國藥集團化學試劑有限公司，TEAB為自制。

實驗中用到的其他試劑均為分析純，所用蒸餾水為高純水，所用無水溶劑均按照有機溶劑純化手冊進行處理。

1.2" 熒光修飾核苷酸的設計與合成

本文以醚鍵雜烷基結構修飾羅丹明和箐染料，采用含有醚鍵的雜烷基結構-（CH2）m-O-（CH2）n-作為連接結構將連接基-COR-引入至核苷酸分子中，合成系列新型核苷酸化合物D1—D6（圖1、表1），利用質譜進行表征。核苷酸化合物D1、D3、 D5未使用醚鍵修飾，核苷酸化合物D2、D4、D6使用醚鍵雜烷基結構修飾，對比后可發(fā)現(xiàn)醚鍵修飾可提高核苷酸在核酸測序中的性能。

新型核苷酸化合物D1—D6的合成路線如圖2所示。

1.2.1" 化合物2的合成

熒光羅丹明6G酸（210 mg，0.5 mmol）溶于DMF（4 mL）中，室溫下加入卡特縮合劑（1H-Benzotriazol-1-yloxytris（dimethylamino）phosphonium Hexafluorophosphate、BOP）（220 mg，0.5 mmol）和N，N-二異丙基乙胺（N，N-Diisopropylethylamine、DIEA）（400 mg，3.1 mmol），反應體系室溫攪拌5 min 后加入N-甲基-4-氨基丁酸（90 mg，0.8 mmol），混合物室溫反應3 h。反應停止后，先將混合物蒸干。將得到的固體用乙腈溶解，再用CH3CN/TEAB（三乙基碳酸氫銨）（0.1M）柱純化。在得到含有目標產(chǎn)物的洗脫液之后，蒸干溶劑，真空干燥，得到目標產(chǎn)物紅色固體260 mg，產(chǎn)率：51%。MS：理論值515.3；實驗值516.3 [M+1]。

1.2.2" 化合物4的合成

熒光2（103 mg，0.2 mmol）溶于DMF（5 mL）中，室溫下加入2-琥珀酰亞胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯（N，N，N'，N'-Tetramethyl-O-（N-succinimidyl）uronium Tetrafluoroborate、TSTU）（120mg，0.4 mmol）并攪拌10 min，DIEA（260 mg，2 mmol）和化合物3（220 mg，0.6 mmol）加入后室溫攪拌過夜。

TEAB（5 mL，0.1 M）加入后攪拌1 h，再使用制備液相純化。在得到含有目標產(chǎn)物的洗脫液之后，蒸干溶劑，真空干燥，得到目標產(chǎn)物紅色固體78 mg，產(chǎn)率：45%。MS：理論值864.4；實驗值865.4 [M+1]。

1.2.3" 化合物D1的合成

產(chǎn)物4（170 mg，0.2 mmol）溶于DMF（5 mL）中，室溫下加入TSTU（120 mg，0.4 mmol）并攪拌10min，DIEA（260 mg，2 mmol）和化合物5（350 mg，0.6 mmol）加入后室溫攪拌過夜。

TEAB（5 mL，0.1 M）加入后攪拌1 h，再使用制備液相純化。在得到含有目標產(chǎn)物的洗脫液之后，蒸干溶劑，真空干燥，得到目標產(chǎn)物紅色固體0.12 mol，產(chǎn)率：60%。MS：理論值1 422.4；實驗值1 423.3 [M+1]，712.2 [M+2]/2。

化合物D2—D6的合成路線參考化合物D1的合成路線。

1.3" 熒光修飾核苷酸的性能表征

20 ℃下測量醚鍵修飾核苷酸前后的熒光強度，將熒光修飾核苷酸分別配制成相同濃度的溶液（0.5 μM）充入測序芯片中測量強度值。

不同溫度熒光修飾核苷酸的強度值，熒光修飾核苷酸在芯片上成簇后，測量簇在不同溫度下的熒光強度值。

緩沖液試劑盒中使用合成的核苷酸T替換為原有全部核苷酸的T，其他保持不變，替換濃度為5 μM。在SiKun2000原理機和SiKun2000測序儀上進行測試。

2" 結果與討論

2.1" 熒光強度

熒光修飾核苷酸分別配制成相同濃度的溶液（0.5 μM），充入測序芯片中測量強度值，以單獨熒光基團的強度為100 計具體數(shù)據(jù)，如圖3所示。

由圖3可看出，采用醚鍵修飾的熒光核苷酸D2、D4、D6與未采用醚鍵修飾的熒光修飾核苷酸D1、D3、D5相比，使用醚鍵修飾的熒光核苷酸強度比未采用醚鍵修飾的熒光核苷酸強度高出10%，通過以上3個系列熒光對核苷酸T修飾的數(shù)據(jù)可以看出，醚鍵修飾的熒光強度明顯地強于未使用醚鍵修飾的熒光強度，尤其是對于熒光強光下降較多的箐染料。

2.2" 不同溫度下對熒光強度的影響

檢測修飾的熒光核苷酸（D1—D6）溶液隨著溫度升高熒光強度的衰減比率，選取溫度為20、40、60℃，以20℃時強度為100 計，測量方式為熒光修飾核苷酸在芯片上成簇后測量不同溫度下的強度值（表2）。

對于修飾的熒光核苷酸，同一種熒光醚鍵修飾前后的數(shù)據(jù)值進行分析，采用醚鍵修飾的熒光核苷酸D2與未采用醚鍵修飾的熒光修飾核苷酸D1相比，測序溫度（60℃）下使用醚鍵修飾的熒光核苷酸強度比未采用醚鍵修飾的熒光核苷酸強度高出15%；D4與未采用修飾的D3相比，工作溫度下熒光強度高出10%， D6與未采用醚鍵修飾的核苷酸D5相比，工作溫度下使用醚鍵修飾的熒光核苷酸強度比未采用醚鍵修飾的熒光核苷酸強度高出10%（圖4—圖6）。

從不同溫度下醚鍵修飾前后的熒光強度分析可以看出，采用醚鍵修飾的熒光核苷酸與未采用醚鍵修飾的熒光修飾核苷酸相比，工作溫度下使用醚鍵修飾的熒光核苷酸（D2、D4、D6）熒光強度比未采用醚鍵修飾的熒光核苷酸（D1、D3、D5）強度衰減少，強度超出未修飾核苷酸熒光強度的10%～15%。以上結果表明，醚鍵修飾的熒光核苷酸，其熒光強度在高溫下優(yōu)勢明顯。

2.3" 測序性能的影響

緩沖液試劑盒中熒光修飾的核苷酸T被全部替換為合成的核苷酸T，其他3種核苷酸不變，替換濃度為核苷酸T（5 μM），常用的測序質量評估標準測Q30數(shù)據(jù)見表3。

由表3統(tǒng)計結果可知，采用醚鍵修飾的熒光核苷酸與未采用醚鍵修飾的熒光核苷酸相比，測序性能中堿基質量值整體提升4%～5%，有醚鍵修飾的熒光在作為核苷酸的熒光標記時，能夠提高測序質量和結果的準確性。

3" 結論

核苷酸的熒光性能直接影響到測序檢測的準確性，熒光強度低會導致測序準確性降低。本文利用低成本醚鍵修飾技術對核苷酸進行修飾，主要得出以下結論。

醚鍵修飾的熒光核苷酸強度比未修飾的熒光核苷酸強度提高10%。

探索了溫度對醚鍵修飾的熒光核苷酸性能的影響，高溫下使用醚鍵修飾的熒光核苷酸強度比未修飾的熒光核苷酸強度提高10%，整體測序性能提升5%。

采用醚鍵修飾核苷酸，可有效提高熒光核苷酸在測序過程中的性能，并增加了熒光的選擇面，降低了核酸測序試劑的研發(fā)成本。

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