摘要：為探究低溫真空長時煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白結構和特性的影響，選取豬背最長肌為實驗對象，進行不同煮制時間下羰基含量、總巰基含量、SDS-PAGE、微觀結構及蛋白質二級結構的測定與分析。隨著熱處理時間的增加，肌原纖維蛋白的羰基含量呈現上升趨勢（Plt;0.05），總巰基含量呈現先上升后下降的趨勢（Plt;0.05）。凝膠電泳結果顯示，煮制時間為30 min時，肌原纖維蛋白肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈條帶顏色更淺。由掃描電鏡結果可知，60 min時，肌原纖維蛋白聚集形成大量小顆粒聚集物，其破壞程度加深。隨著熱處理時間的增加，α螺旋相對含量減少，β折疊相對含量先下降后上升，β轉角相對含量增加，無規(guī)則卷曲相對含量先上升后下降，蛋白質的二級結構由有序向無序轉變。結果表明，隨著熱處理時間的增加，煮制60 min時肌原纖維蛋白結構的氧化與降解明顯，煮制30 min時蛋白結構變化相對較小。該研究為低溫真空長時煮制工藝提高豬肉產品品質提供了理論依據。

關鍵詞：豬肉；肌原纖維蛋白；低溫真空長時煮制；煮制時間；蛋白結構

中圖分類號：TS251.51 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）01-0078-07

Effect of Low-Temperature Vacuum Long-Time Cooking Time on Structure and Characteristics of Pork Myofibrillar Protein

DU Wen-qing^1，2，ZHANG Jia-min¹，LIU Yan-yan^1，2，TANG Li^1，2，BAI Ting¹，REN Chun-ping³，JI Li-li^1*

（1.College of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China; 2.Key Laboratory of Meat Processing in Sichuan Province， Chengdu University， Chengdu 610106， China; 3.Sichuan Goldkinn Industry Group Co.， Ltd.， Suining 629000， China）

Abstract： In order to investigate the effect of low-temperature vacuum long-time cooking time on the structure and characteristics of pork myofibrillar protein， the longest dorsal muscle of pigs is selected as the experimental object， and the carbonyl content， total sulfhydryl content， SDS-PAGE， microstructure and protein secondary structure are determined and analyzed under different cooking time. With the increase of heat treatment time， the carbonyl content of myofibrillar protein shows an increasing trend （Plt;0.05）， and the total sulfhydryl content shows a trend of firstly increasing and then decreasing （Plt;0.05）. The results of gel electrophoresis show that the color of myofibrillar protein myosin heavy chain and myosin light chain bands is lighter when the cooking time is 30 min. According to the scanning electron microscope results， myofibrillar protein aggregates to form a large number of small particle aggregates at 60 min， and the damage degree is deepened. With the increase of heat treatment time， the relative content of α helix decreases， the relative content of β folding firstly decreases and then increases， the relative content of β angle increases， the relative content of random coil firstly increases and then decreases， and the secondary structure of protein transforms from ordered to disordered. The results show that with the increase of heat treatment time， the oxidation and degradation of myofibrillar protein structure are obvious when being cooked for 60 min， while the change of myofibrillar protein structure when being cooked for 30 min is relatively small. This study has provided a theoretical basis for improving the quality of pork products through low-temperature vacuum long-time cooking technology.

Key words： pork; myofibrillar protein; low-temperature vacuum long-time cooking; cooking time; protein structure

收稿日期：2024-07-04

基金項目：國家農業(yè)產業(yè)技術體系四川生豬創(chuàng)新團隊（scsztd-2024-08-07）；川菜工業(yè)化四川省高等學校工程中心開放基金（GCZX22-35）

作者簡介：杜汶清（2000—），女，碩士研究生，研究方向：農產品加工與安全。

*通信作者：吉莉莉（1982—），女，副教授，博士，研究方向：畜產品加工與質量控制。

低溫真空長時煮制（low-temperature vacuum long-time cooking，LTLT）工藝是一種將原料經過真空包裝后低溫煮制的新型加工工藝，相比于傳統烹飪方式，對肉類產品具有提高嫩度、消除高溫蒸煮產生的有害物質、減少營養(yǎng)成分流失等優(yōu)勢^[1]。低溫真空長時煮制工藝在實際生產應用中會受到多種因素的影響，如溫度參數設定、熱處理時間、包裝材料的真空度等^[2]。其中，熱處理時間對產品的口感與品質具有極大影響，在確保足夠的熱處理時間使食材中心完全達到所需溫度的同時，也要確保產品獲得最佳的品質。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是一種重要的結構蛋白，占肌肉總蛋白的55%～60%，具有水結合能力、乳化特性、凝膠形成能力等，對肉品的色澤、保水性和質地等具有關鍵作用^[3]，在一定程度上能引起蛋白質功能特性的變化^[4]。其中，肌原纖維蛋白凝膠形成能力可直接影響肉制品的質構、持水性與感官特性。而在影響肌原纖維蛋白凝膠形成能力的因素中，溫度尤為關鍵^[5]，原因在于肌球蛋白變性溫度約在40～55℃，肌動蛋白變性溫度約在70～85℃^[6]。

低溫真空長時煮制工藝的應用目前已十分廣泛，其對鵝肉、雞肉、牛肉與豬肉^[7-10]等肉制品品質的影響已有一定的基礎研究。但針對該工藝對肉制品肌原纖維蛋白變化規(guī)律影響的研究較少，因此，本實驗以豬背最長肌為實驗對象，探究低溫真空長時煮制工藝下不同熱處理時間對豬肉肌原纖維蛋白結構與特性的影響，為低溫真空長時煮制工藝下肉類產品的品質變化與工藝優(yōu)化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

豬背最長?。核拇ǜ呓饘崢I(yè)集團股份有限公司。

1.1.2 實驗儀器

GY-2B-6202真空包裝機 江西贛云食品機械有限公司；BQPJ-Ⅰ切片機、BZZT-Ⅳ-150蒸煮桶 嘉興艾博實業(yè)股份有限公司；HHS-11-4恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FleA-200酶標儀 杭州奧盛儀器有限公司；5977A-7890B氣相色譜-質譜聯用儀、PAL-RSI-85型CTC多功能自動進樣器、DB-WAX色譜柱（30 m×250μm×0.25μm）、57347-U萃取頭（50/30μm DVB/CAR/PDMS） 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

將購買的豬背最長肌置于－4℃冰箱中冷藏12 h，順著肌纖維生長方向分割成長、寬、高為6.0 cm×1.5 cm×1.5 cm的豬肉條，于室溫25℃下完全解凍后進行低溫真空長時煮制。

1.2.2 工藝設置

設置真空熱封時間1.8 s、抽氣時間17～18 s、真空度0.09 MPa，隨后放入67℃恒溫水浴鍋中加熱60 min。

1.2.3 取樣時間點位確定

使用溫度計監(jiān)測煮制過程中溫度的變化，根據溫度變化曲線，取未熱處理0 min（X）、煮制2.5 min（Y_2.5）、13 min（Y₁₃）、30 min（Y₃₀）、45 min（Y₄₅）、60 min（Y₆₀）6個時間點觀察豬肉的變化。

1.2.4 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白的提取參考Xiong等^[11]的方法。

1.2.5 肌原纖維蛋白羰基含量測定

取0.1 g各組肌原纖維蛋白樣品，使用蛋白質羰基含量檢測試劑盒測定其在412 nm處的吸光度。

1.2.6 肌原纖維蛋白總巰基含量測定

取0.1 g各組肌原纖維蛋白樣品，使用總巰基含量檢測試劑盒測定其在370 nm處的吸光度。

1.2.7 肌原纖維蛋白SDS-PAGE

參考Laemmli^[12]的方法并稍作修改。配制5%濃縮膠與12%分離膠，并組裝電泳槽后，將膠固定于槽內，緩慢加入電泳緩沖液，按照Marker、X、Y_2.5、Y₁₃、Y₃₀、Y₄₅和Y₆₀的順序依次加樣。通電開始電泳，其中濃縮膠電泳條件為60 V、45 min，分離膠電泳條件為100 V、1.5 h，電泳結束后關閉電源。取出膠片置于考馬斯亮藍溶液中染色1 h，隨后置于搖床，用UP水過夜脫色，最后將膠片置于BLT圖像工作站成像并觀察。

1.2.8 肌原纖維蛋白微觀結構測定

稱取適量膏狀肌原纖維蛋白，使用梯度乙醇溶液各脫水10 min，然后冷凍干燥36 h，噴金，在適當SEM倍數下觀察，拍照^[13]。

1.2.9 肌原纖維蛋白二級結構測定

將冷凍干燥的蛋白樣品與溴化鉀（KBr）以1∶100的比例混合，在紅外燈下用瑪瑙杵和研缽將上述混合樣品研磨成細粉并均勻分散在模具內，對其施加16 MPa的壓力，保持1 min，將最終制成的透明片上機測試。光譜掃描范圍為400～4 000 cm^-1，分辨率設置為4 cm^-1，掃描32次，用OMNIC 8.0 對紅外圖譜進行基線校正和標峰，并用Peakfit V4.12軟件對1 600～1 700 cm^-1范圍內的酰胺Ⅰ帶圖譜進行去卷曲、二階導和曲線擬合^[14]。再對各二級結構對應的波長進行定位，根據每個峰的積分面積計算肌原纖維蛋白二級結構的相對含量^[15-16]。

1.2.10 數據統計與分析

所有實驗均重復3次，采用Microsoft Excel 2019制表，SIMCA 14.1、TBtools v1.098769和Origin 2021制圖，采用IBM SPSS Statistics 26.0對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 低溫真空長時煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響

在低溫真空長時煮制條件下，不同煮制時間下豬肉肌原纖維蛋白羰基含量的測定結果見圖2。

由圖2可知，隨著煮制時間的增加，各樣品羰基含量總體呈上升趨勢（Plt;0.05）；煮制2.5 min和13 min、煮制30 min和45 min樣品之間的羰基含量無顯著性差異（P＞0.05）；與煮制0 min的生鮮豬肉相比，煮制2.5，13，30，45，60 min的樣品羰基含量分別增加了1.2，1.4，2，2.1，2.6倍，說明不同煮制時間下蛋白質的氧化變性程度不同，其中煮制60 min時樣品的羰基化程度最劇烈，這與Roldan等^[17]研究真空烹調羊里脊蛋白質氧化情況的結果相似。此外，Y₆₀組的羰基含量比Y_2.5、Y₁₃、Y₃₀和Y₄₅組分別高59.19%、47.97%、18.57%、14.81%，說明隨著煮制時間的延長，生肉變成熟肉，樣品之間的羰基含量差異逐漸減小，這與Traore等^[18]研究水煮豬肉蛋白氧化情況的結果相似。

2.2 低溫真空長時煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

巰基是蛋白質的重要基團，蛋白質在熱氧化過程中易被氧化成二硫鍵及多種硫氧化合物，使得巰基含量降低。不同煮制時間下豬肉肌原纖維蛋白總巰基含量的測定結果見圖3。

由圖3可知，隨著煮制時間的增加，總巰基含量呈先上升后下降的趨勢（Plt;0.05），煮制時間為45 min時，總巰基含量最高，為59.56μmol/mg prot。煮制前期總巰基含量上升可能是由于蛋白質受熱變性，使蛋白質內部巰基基團暴露在外，導致總巰基含量上升^[19]。但隨著煮制時間的繼續(xù)增加，蛋白分子內部暴露出來的巰基基團進一步被氧化成二硫鍵^[20]，導致總巰基含量降低。

2.3 低溫真空長時煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響

低溫真空長時煮制（0，2.5，13，30，45，60 min）下肌原纖維蛋白的SDS-PAGE電泳圖見圖4，可反映豬肉在低溫真空長時煮制不同階段肌原纖維蛋白的降解情況。

由圖4可知，煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白的降解和變性有顯著影響（Plt;0.05）。隨著煮制的開始，肌原纖維蛋白發(fā)生熱變性，出現不同程度的降解和聚集，形成新的蛋白條帶，同時部分蛋白條帶顏色變淺或消失。

位于43 kDa和35 kDa處的肌動蛋白（Actin）和原肌球蛋白（TM）條帶隨著煮制時間的增加逐漸變寬、顏色加深，表明隨著煮制時間的增加，提高了肌原纖維蛋白的降解程度，使之發(fā)生明顯的擴散現象，促使豬肉肌原纖維蛋白溶出并降解，最終導致蛋白質分子質量改變^[21]。Y₃₀、Y₄₅和Y₆₀組都在60 kDa處形成了新的蛋白條帶，表明隨著煮制時間的延長，肌原纖維蛋白發(fā)生不同程度的變性與降解，導致新條帶產生，這與孔保華等^[22]的研究結果類似。對比6個泳道的肌球蛋白重鏈（MHC）條帶，除Y₃₀組外，其他組別所呈現的條帶寬度與顏色區(qū)別并不顯著，這與吳利芬等^[23]的研究結果類似。同時，Y₃₀組相比于其他5組條帶寬度明顯更細，可見煮制30 min時蛋白降解程度相比于其他時間更低。

2.4 低溫真空長時煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白微觀結構的影響

低溫真空長時煮制下豬肉肌原纖維蛋白會發(fā)生不同程度的變性，導致蛋白質的結構遭到破壞。對不同低溫真空煮制時間下肌原纖維蛋白的微觀結構進行掃描電鏡觀察，結果見圖5。

由圖5可知，不同煮制時間下肌原纖維蛋白微觀結構差異較大，X組為生鮮豬肉肌原纖維蛋白的微觀結構，其肌原纖維蛋白結構飽滿完整，聚集度好，表面光滑；Y_2.5組肌原纖維蛋白結構發(fā)生變化，開始出現不規(guī)則孔洞，但表面相對光滑；Y₁₃組肌原纖維蛋白呈現出大量邊緣不規(guī)則的聚集物，部分表面光滑，開始變得粗糙；Y₃₀組有類似長條狀的纖維束，且表面附著大量飽滿的小顆粒聚集物；Y₄₅組能清楚觀察到長條的纖維束，纖維束上的小顆粒聚集物減少，且邊緣變得粗糙；Y₆₀組的肌原纖維蛋白形成了大量不規(guī)則的小顆粒聚集物。與X組生鮮豬肉相比，其他5組的肌原纖維蛋白微觀結構均有不同程度變化，表面均出現不同程度的小分子片狀顆粒。

熱處理對肌原纖維的微觀結構具有破壞作用，由生到熟的過程中，肌內膜表面會出現小分子顆粒，可能是由于熱處理會使肌漿蛋白變性而凝聚成顆粒狀物質^[24-25]。隨著煮制時間的增加，豬肉肌原纖維蛋白的降解程度加深、變性程度更強，煮制60 min時，肌原纖維蛋白聚集形成不規(guī)則小顆粒聚集物，破壞程度加深^[26]。

2.5 低溫真空長時煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白二級結構的影響

蛋白二級結構是指多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或折疊而形成的特定的構象，即肽鏈主鏈骨架原子的空間位置排布，其主要形式包括α螺旋、β折疊、β轉角和無規(guī)則卷曲^[27]。利用傅里葉變換紅外光譜儀（光譜范圍400～4 000 cm^-1）對各組樣品的肌原纖維蛋白二級結構進行檢測和分析，紅外光譜圖見圖6。低溫真空煮制0，2.5，13，30，45，60 min時樣品的紅外圖譜特征峰并未發(fā)生明顯變化，表明煮制時間并未明顯改變蛋白質官能團的組成。但波長3 300 cm^-1附近都有一個明顯的吸收峰，這個吸收峰來源于蛋白質-OH和N—H的伸縮振動，該吸收峰的峰形較寬，且常受氫鍵的影響而發(fā)生偏移。3 063 cm^-1附近均出現微弱吸收峰，來源于不飽和脂肪烴和芳香烴C—H的伸縮振動。2 873～2 964 cm^-1波段出現的吸收峰的吸光度增加，這與蛋白質甲基和亞甲基的對稱和不對稱伸縮振動有關；1 600～1 700 cm^-1和1 500 cm～1 600^-1波段出現的特征吸收峰分別位于酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶，是蛋白質二級結構的典型特征，主要是由蛋白肽鍵（NH—CO）中CO的拉伸振動、N—H的彎曲振動和C—N的伸縮振動引起的；其中1 655 cm^-1和1 536 cm^-1附近的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶分別屬于β折疊（無序）和α螺旋（有序）。1 394 cm^-1和1 445 cm^-1處的特征峰包含蛋白肽鍵（NH—CO）中N—H的拉伸振動、氨基酸殘基側鏈基-COO^-中CO的對稱伸縮振動模式，同時還包含部分亞甲基的變形振動模式。1 243 cm^-1處的特征峰主要與C—O結構的伸縮振動相關；1 079 cm^-1附近的連續(xù)吸收峰主要與C—O的不對稱伸縮振動相關。

對比不同煮制時間下蛋白質二階導數圖譜，將各實驗組肌原纖維蛋白的酰胺Ⅰ帶放大，對其進行去卷積和平滑處理，結果見圖7。由圖7可知，不同煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白二級結構產生影響，各組波數都出現紅移和藍移，還有新峰出現，說明隨著煮制時間的增加，豬肉蛋白質二級結構發(fā)生變化。將不同煮制時間下蛋白樣品的酰胺Ⅰ帶進行擬合，計算α螺旋、β折疊、β轉角和無規(guī)則卷曲的比例。

不同低溫真空煮制時間下肌原纖維蛋白酰胺Ⅰ帶曲線擬合圖見圖8。由圖8可知，各樣品組對應峰的寬度、高度和峰面積不同，部分重疊的峰或小肩峰明顯分離，說明不同煮制時間下蛋白質的結構發(fā)生了明顯變化，同時反映出不同煮制時間下各樣品組蛋白結構的變化特征。因此，不同低溫真空煮制時間下豬肉肌原纖維蛋白二級結構隨著煮制時間的增加發(fā)生變化。

不同低溫真空煮制時間下肌原纖維蛋白二級結構相對含量見表1，X組（未加熱）樣品蛋白質的主要結構是β折疊（33.57%），其次是α螺旋（25.68%）、無規(guī)則卷曲（20.78%）和β轉角（19.98%）。隨著煮制時間的延長，蛋白質二級結構的相對含量發(fā)生變化。蛋白質二級結構中α螺旋的相對含量整體呈下降趨勢（Plt;0.05），其中煮制2.5，13，30，45，60 min的樣品相較于X組的α螺旋相對含量分別下降了13.90%、8.26%、3.31%、10.12%、31.62%，說明在煮制60 min的條件下對有序的α螺旋影響最大；β折疊相對含量變化除煮制60 min增加12.57%（Plt;0.05）外，其他樣品總體呈下降趨勢（Plt;0.05），其中煮制2.5，13，30，45 min的β折疊相對含量分別下降了33.10%、9.64%、25.12%、17.55%；β轉角相對含量除煮制13 min下降了0.33%（Plt;0.05）外，其他樣品組（Y_2.5、Y₃₀、Y₄₅和Y₆₀組）呈上升趨勢，分別上升了22.99%、40.52%、33.66%、52.38%（Plt;0.05）；無規(guī)則卷曲相對含量的變化相較于X組呈上升趨勢，其中煮制2.5，13 min上升趨勢明顯（Plt;0.05），分別上升了33.98%和26.08%，而其他組的相對含量相較于X組沒有顯著性差異（Plt;0.05）。

綜合上述分析，不同煮制時間下蛋白質二級結構的變化較復雜，總體表現為α螺旋相對含量減少，β折疊相對含量先下降后上升，β轉角相對含量增加，無規(guī)則卷曲相對含量先上升后下降。加熱使α螺旋結構解開^[28]，疏水性氨基酸暴露，肌原纖維蛋白間疏水相互作用改變，蛋白質結構從有序向無序轉變^[29]。無規(guī)則卷曲相對含量隨著熱處理時間的延長呈先上升后下降的趨勢，蛋白質分子結構從有序向松散狀態(tài)轉化。

3 結論

本研究探討了低溫真空長時煮制工藝條件下，不同煮制時間對豬肉肌原纖維蛋白的影響。相較于生鮮豬肉，隨著煮制時間的增加，羰基含量呈穩(wěn)步上升趨勢，總巰基含量先上升后下降，羰基和總巰基含量的最大值分別為煮制60 min時的4.21μmol/mg prot和煮制45 min時的59.56μmol/mg prot。肌原纖維蛋白結構也由表面光滑且緊致的多孔結構轉變?yōu)楸砻娲植诘木W狀結構，進而出現大量小分子片狀顆粒。SDS-PAGE電泳結果顯示，煮制30 min時蛋白降解程度相比于其他時間更低。蛋白質二級結構總體表現為隨著加熱時間的增加，α螺旋相對含量減少，β折疊相對含量先下降后上升，β轉角相對含量增加，無規(guī)則卷曲相對含量先上升后下降，煮制60 min時α螺旋相對含量顯著最低，β折疊與β轉角相對含量顯著最高。綜上所述，低溫真空長時煮制對豬肉肌原纖維蛋白產生顯著影響，煮制60 min時樣品的肌原纖維蛋白降解聚集程度顯著最高，對蛋白結構的影響最大，煮制30 min對蛋白的影響程度相對較低。此研究為明確低溫真空長時煮制工藝對豬肉蛋白質分子結構的具體影響提供了理論依據，并為豬肉制品的品質提升與研究應用提供了理論支撐。

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