摘要：發(fā)酵菌種是發(fā)酵乳發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素，該研究以核桃原漿為發(fā)酵底物，篩選出合適的發(fā)酵菌種來制備純植物基核桃發(fā)酵乳，以解決其酸度不足、持水性差、風(fēng)味不佳等問題，進(jìn)一步提高該發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)和穩(wěn)定性。以持水性和感官評(píng)分為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化純植物基核桃發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，篩選的最佳復(fù)配菌種為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌，以1∶1∶1的復(fù)配比發(fā)酵后的發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性和感官評(píng)分達(dá)到最優(yōu)；最優(yōu)發(fā)酵工藝為料液比1∶5、蔗糖添加量7%、發(fā)酵溫度36℃、發(fā)酵時(shí)間12 h、菌種接種量4.5%。在此條件下發(fā)酵的純植物基核桃發(fā)酵乳質(zhì)地細(xì)膩黏稠、香氣適宜、口味獨(dú)特，感官評(píng)分達(dá)到89.4分，相關(guān)理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。此產(chǎn)品的開發(fā)為核桃資源的開發(fā)和利用提供了參考，為提高純植物基核桃發(fā)酵乳的品質(zhì)提供了篩菌和工藝優(yōu)化的新思路。

關(guān)鍵詞：核桃；純植物基發(fā)酵乳；菌種篩選；發(fā)酵工藝；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）01-0001-09

Study on Screening of Strains of Pure Plant-Based Walnut Fermented Milk and Optimization of Fermentation Process

ZHENG Jing-chuan^{1，2，3}， YANG Rui-juan^{1，2，3}， LIN Xing-mi¹， SHEN Zhao-yu¹， TIAN Yang^{1，2，3，4*}

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2.Engineering Research Center for the Development and Utilization of Food and Medicine Homologous Resources， Ministry of Education， Kunming 650201， China; 3.Yunnan Key Laboratory of Precision Nutrition and Personalized Food Manufacturing， Kunming 650201， China; 4.Pu'er University， Pu'er 665000， China）

Abstract： Fermentation strains are the key factor in the fermentation process of fermented milk， in this study， with walnut raw pulp as the fermentation substrate， suitable fermentation strains are selected to prepare pure plant-based walnut fermented milk， so as to solve the problems of insufficient acidity， poor water holding capacity and poor flavor， and further improve the texture and stability of the fermented milk. With water holding capacity and sensory score as the indexes， the fermentation process of pure plant-based walnut fermented milk is optimized by using single factor test and response surface method. The results show that the optimal screened compound strains are Lactobacillus bulgaricus， Streptococcus thermophilus and Lactobacillus plantarum.The texture characteristics and sensory score of fermented milk are the best by compounding at the ratio of 1∶1∶1. The optimal fermentation process is solid-liquid ratio of 1∶5， sucrose addition amount of 7%， fermentation temperature of 36℃， fermentation time of 12 h and strain inoculation amount of 4.5%. Under these conditions， the pure plant-based walnut fermented milk is fine and sticky in texture， with suitable aroma and unique taste. The sensory score reaches 89.4 points， and the relevant physicochemical indexes and microbiological indexes all meet the standard requirements. The development of this product has provided references for the development and utilization of walnut resources， and provided new ideas of strain screening and process optimization for improving the quality of pure plant-based walnut fermented milk.

Key words： walnut; pure plant-based fermented milk; strain screening; fermentation process; response surface optimization

胡桃（Juglans regia），胡桃科胡桃屬植物，是我國(guó)分布最廣的經(jīng)濟(jì)樹種之一，產(chǎn)量位居世界首位^[1]。研究表明，核桃仁中因含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等^[2-3]，具有降血脂^[4]、抗炎^[5]、抗疲勞^[6]等多種功效，是人們?nèi)粘Ｉ钪袃?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的攝入來源。作為世界四大堅(jiān)果之一的核桃具有廣闊的發(fā)展前景^[7]。

與傳統(tǒng)乳基發(fā)酵乳（酸奶）不同，純植物基發(fā)酵乳是以植物基為原料，添加菌種，并采用生物發(fā)酵工藝制成的發(fā)酵乳^[8]。因其用“植物原料”替換“動(dòng)物原料”，具備植物原料不含膽固醇、低脂肪、低熱量、易消化等特點(diǎn)^[9-10]，具有適合乳糖不耐癥患者和素食主義者食用^[11]及減少動(dòng)物飼養(yǎng)成本和環(huán)境污染^[12-13]等優(yōu)點(diǎn)，利用植物蛋白為發(fā)酵底物替代動(dòng)物蛋白開發(fā)純植物基發(fā)酵乳飲品已成為研究熱點(diǎn)。

但植物發(fā)酵乳的植物蛋白種類、分子量、空間結(jié)構(gòu)和動(dòng)物蛋白不同，導(dǎo)致發(fā)酵后易出現(xiàn)質(zhì)構(gòu)不良、風(fēng)味不佳、口感欠缺等諸多問題，傳統(tǒng)解決方法大多局限于改良產(chǎn)品配方^[14]和優(yōu)化加工工藝^[15]，而篩選合適的發(fā)酵菌種研究較欠缺。目前植物基發(fā)酵乳的發(fā)酵菌種主要為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這些動(dòng)物發(fā)酵乳常用菌，二者互惠共生，嗜熱鏈球菌所產(chǎn)甲酸、丙酮酸、葉酸等可為保加利亞乳桿菌所利用，同時(shí)保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的游離氨基酸和肽可為嗜熱鏈球菌所利用^[16]。有研究表明，現(xiàn)有益生菌核桃發(fā)酵乳的研究中，主要以傳統(tǒng)發(fā)酵菌種混合發(fā)酵為主，現(xiàn)今被作為益生菌的乳桿菌有嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌等^[17]。

目前，以核桃作為植物基原料完全替代乳基原料制備植物基發(fā)酵乳的相關(guān)研究較少，純植物基核桃發(fā)酵乳的研制還處于實(shí)驗(yàn)室研究的初步階段，并且我國(guó)核桃產(chǎn)品精深加工不足、綜合利用率偏低，因此開發(fā)純植物基核桃發(fā)酵乳具有較大的市場(chǎng)潛力。本研究旨在以核桃原漿作為發(fā)酵底物，通過篩選適合發(fā)酵的乳酸菌菌種，并確定最佳的配方配比和加工工藝，研制出一款風(fēng)味獨(dú)特、質(zhì)地良好、健康營(yíng)養(yǎng)的純植物基發(fā)酵乳飲品，為國(guó)內(nèi)特色風(fēng)味純植物基發(fā)酵乳飲料的開發(fā)提供了一定的理論支撐，同時(shí)也為開發(fā)優(yōu)良的植物基發(fā)酵菌種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃：大理漾濞核桃有限責(zé)任公司；發(fā)酵菌種：實(shí)驗(yàn)室冷凍保存；MRS培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；蔗糖：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

JMS膠體磨 廊坊市正瑞機(jī)械有限公司；打漿機(jī) 邢臺(tái)有間優(yōu)宿科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州聚輝儀器制造有限公司；Eppendorf臺(tái)式冷凍離心機(jī) 鄭州今時(shí)邁科技有限公司；SRH高壓均質(zhì)機(jī) 上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；SKD-800凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；QSY-8數(shù)控消化爐 杭州菲躍儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 浙江譜析儀器有限公司；YXQ-100G立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 純植物基核桃發(fā)酵乳制作工藝流程和操作要點(diǎn)

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

熱泡脫皮：選擇外形飽滿、無霉變、無蟲蛀的干核桃，去除外殼得核桃仁。使用沸水浸泡核桃仁10 min，除去種皮。

加水磨漿：在打漿機(jī)中放入核桃仁，并按照1∶5的料液比加入純水，磨漿處理3次。

過濾：使用100目過濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，去除核桃漿中的不溶性固體組分。

加料：蔗糖添加量為4%，將混合核桃漿加熱至45℃，并攪拌10 min。

均質(zhì)：在25 MPa條件下均質(zhì)3 min，循環(huán)3次，以保證原漿中各物料穩(wěn)定結(jié)合。

殺菌：原漿采用85℃殺菌20 min，在不破壞原料營(yíng)養(yǎng)和色澤的基礎(chǔ)上，保證充分殺菌。

接種：殺菌后的原漿冷卻至35～40℃，將混合菌種接種到原漿中，攪拌均勻。

發(fā)酵：接種后在36℃下恒溫發(fā)酵12 h。

冷藏后熟：冷卻至4℃并在4～8℃下低溫儲(chǔ)藏24 h，進(jìn)一步發(fā)酵后熟產(chǎn)酸。

1.3.2 發(fā)酵單菌種的篩選

1.3.2.1 發(fā)酵菌種的活化

將實(shí)驗(yàn)室-80℃保藏的菌種恢復(fù)至室溫，分別取1 mL接種到提前滅菌并冷卻至室溫的9 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。重復(fù)傳代3次，活菌數(shù)達(dá)到10⁹ CFU/mL以上，備用。

1.3.2.2 發(fā)酵指標(biāo)的測(cè)定

持水性：取10～15 mL發(fā)酵完成的核桃發(fā)酵乳樣品，稱取樣品的最初質(zhì)量，以10 000 r/min離心15 min，靜置10 min后，倒去上層清液，稱取剩余沉淀質(zhì)量，按照下式計(jì)算發(fā)酵乳的持水性。

發(fā)酵乳持水性（%）=沉淀質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）×100%。

黏度：將核桃發(fā)酵乳發(fā)酵至pH值為4.5，破乳恢復(fù)至室溫，采用Brookfield DV3T黏度計(jì)3號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為60 r/min，測(cè)定30 s時(shí)樣品的黏度。

凝乳時(shí)間：將活化好的菌種按照1.3.1的操作發(fā)酵至凝乳，記錄凝乳時(shí)間。

發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)間：以發(fā)酵乳的pH值達(dá)到4.5為發(fā)酵終點(diǎn)，記錄發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)間。

發(fā)酵終點(diǎn)酸度：發(fā)酵乳酸度的測(cè)定按照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》中的酚酞指示劑法^[18]，記錄發(fā)酵終點(diǎn)酸度。

1.3.2.3 菌種產(chǎn)酸能力的測(cè)定

將11種待測(cè)菌種活化后，按照1.3.1的發(fā)酵工藝進(jìn)行接種發(fā)酵，每隔2 h分別取樣測(cè)定其酸度，酸度按照1.3.2.2中的酸度測(cè)定法測(cè)定，并繪制產(chǎn)酸曲線。

1.3.3 優(yōu)勢(shì)菌種組合發(fā)酵篩選試驗(yàn)

根據(jù)1.3.2選取具有良好發(fā)酵核桃原漿性能的乳酸菌進(jìn)行菌種組合篩選，并按照菌種濃度1∶1∶1的比例，以4.5%的接種量接種到滅菌的核桃原漿中，36℃恒溫發(fā)酵12 h，發(fā)酵完成后放入4℃冰箱中冷藏后熟24 h后進(jìn)行質(zhì)構(gòu)檢測(cè)和感官評(píng)價(jià)，選出質(zhì)構(gòu)良好且感官評(píng)價(jià)最優(yōu)的最佳菌種組合。

1.3.3.1 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

發(fā)酵乳全質(zhì)構(gòu)測(cè)定：質(zhì)構(gòu)儀測(cè)試模式選擇全質(zhì)構(gòu)測(cè)試，探頭型號(hào)為TA/36R，測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度均為1 mm/s，觸發(fā)力為4 g。

1.3.3.2 感官評(píng)價(jià)

純植物基核桃發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)參考國(guó)標(biāo)GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》的規(guī)定進(jìn)行。由10名經(jīng)過專業(yè)品鑒培訓(xùn)的人員組成感官評(píng)判小組，分別從視覺層面——色澤（20分）、味覺層面——滋味（20分）、嗅覺層面——?dú)馕叮?0分）、觸覺層面——組織狀態(tài)（30分）4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)發(fā)酵乳打分，總分100分，具體感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

以持水性和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將料液比、蔗糖添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量設(shè)為單因素，每個(gè)單因素設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)水平，依次考察料液比（1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9）、蔗糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、發(fā)酵溫度（32，34，36，38，40℃）、發(fā)酵時(shí)間（8，10，12，14，16 h）、菌種接種量（1.5%、3%、4.5%、6%、7.5%）對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

1.3.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以純植物基核桃發(fā)酵乳的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量為自變量，利用Design-Expert軟件中Box-Behnken程序在三因素三水平的條件下進(jìn)行響應(yīng)面分析，對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵工藝配方進(jìn)行可行性優(yōu)化。Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表2。

1.3.5 純植物基核桃發(fā)酵乳理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵乳的pH值使用pH計(jì)測(cè)定；蛋白質(zhì)含量按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定^[19]；乳酸菌活菌數(shù)按照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定^[20]；大腸桿菌按照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》測(cè)定^[21]；致病菌按照GB 29921—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》測(cè)定^[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件GraphPad Prism 8.0.2和IBM SPSS Statistics 26對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，每項(xiàng)試驗(yàn)至少平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵單菌種篩選結(jié)果

2.1.1 不同菌種發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與分析

一般發(fā)酵乳飲品的菌種篩選主要以凝乳時(shí)間、發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)間和酸度作為衡量指標(biāo)，凝乳時(shí)間和發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)間短且產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌種一般可視為發(fā)酵活力強(qiáng)，可縮短發(fā)酵時(shí)間，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)。由表3可知，羅伊氏乳桿菌、約氏乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌的凝乳時(shí)間和發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)間較長(zhǎng)，分別在15～18 h和18～21 h之間，發(fā)酵終點(diǎn)酸度偏低，在30～40°T之間，根據(jù)《植物蛋白飲料 植物酸奶》中規(guī)定植物基發(fā)酵乳的酸度應(yīng)該大于30°T，綜合可知，其對(duì)核桃原漿的發(fā)酵能力較差。而保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)酸能力，發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌也表現(xiàn)出不錯(cuò)的發(fā)酵產(chǎn)酸能力，雖然不如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，但一般發(fā)酵乳多采用多菌種復(fù)配，將其與發(fā)酵能力強(qiáng)的菌種復(fù)配，可對(duì)發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等產(chǎn)生積極影響。

與乳基發(fā)酵乳不同，純植物基發(fā)酵乳由于植物蛋白種類、分子量、空間結(jié)構(gòu)和動(dòng)物蛋白不同^[23]，并且缺乏乳清和酪蛋白，不能很好地建立三維立體結(jié)構(gòu)來鎖住游離水分，極易出現(xiàn)水相分離的問題，進(jìn)而影響產(chǎn)品品質(zhì)，因此將發(fā)酵乳的持水性和黏度作為篩菌指標(biāo)。由表3可知，發(fā)酵能力強(qiáng)的菌種的持水性和黏度都較高，嗜熱鏈球菌因具有以產(chǎn)黏為主的作用，持水性和黏度最高，分別達(dá)到48.6%和448.3 mPa·s。

2.1.2 不同菌種產(chǎn)酸能力結(jié)果與分析

通常產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌種被廣泛選為發(fā)酵菌種，菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)酸速度也決定了發(fā)酵乳的發(fā)酵周期，對(duì)產(chǎn)品的口感、風(fēng)味和衛(wèi)生安全有著重要影響。由圖1可知，除了保加利亞乳桿菌在第6 h酸度開始迅速增長(zhǎng)外，其他菌種在8～14 h快速增長(zhǎng)，14 h后酸度增長(zhǎng)基本趨于穩(wěn)定。由發(fā)酵開始到發(fā)酵結(jié)束，保加利亞乳桿菌的酸度由12.7°T上升到74.6°T，酸度增加了61.9°T，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的酸度分別增加了61.8，57.6，55.9，51.7，44.3，43.7°T。相比之下，約氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的酸度增長(zhǎng)較小，分別為36.9，31.5，30.6，28.1°T，由于產(chǎn)酸過慢且產(chǎn)酸較少，在發(fā)酵過程中周期較長(zhǎng)，容易造成品質(zhì)不佳和產(chǎn)品污染，因此不適合作為發(fā)酵菌種。

根據(jù)表3和圖1的結(jié)果，最終將產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的保加利亞乳桿菌和產(chǎn)黏能力最強(qiáng)的嗜熱鏈球菌作為基礎(chǔ)發(fā)酵菌種，而發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌作為待定搭配菌種，以此進(jìn)一步進(jìn)行最佳菌種組合發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2 菌種組合篩選結(jié)果

2.2.1 不同菌種組合對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的影響

由表4可知，菌種組合L1+L2+L5發(fā)酵的發(fā)酵乳的各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)參數(shù)在所有組合中最佳，發(fā)酵乳的硬度和膠黏性參數(shù)受不同發(fā)酵菌種組合的影響較大。發(fā)酵乳的硬度是其凝膠結(jié)構(gòu)體系的特征，較好的硬度有利于發(fā)酵乳的運(yùn)輸和儲(chǔ)存，菌種組合L1+L2+L5和L1+L2+L7的發(fā)酵乳在硬度方面比較出色。菌種組合L1+L2+L5的發(fā)酵乳在膠黏性方面表現(xiàn)出色，發(fā)酵乳的膠黏性是發(fā)酵乳可被其他物體黏附的能力，較高的膠黏性使發(fā)酵乳具有較好的黏性，進(jìn)而表明發(fā)酵乳具有較好的流變特性^[24]，對(duì)發(fā)酵乳的口感具有顯著影響，并且發(fā)酵乳的膠黏性高可降低乳飲料的離心沉淀率^[25]，適合生產(chǎn)乳酸菌飲料。綜合比較可得，菌種組合L1+L2+L5在純植物基核桃發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)方面表現(xiàn)最優(yōu)。

2.2.2 不同菌種組合對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳感官評(píng)分的影響

由表5可知，不同菌種組合對(duì)發(fā)酵乳色澤和氣味的影響較小，但對(duì)發(fā)酵乳的滋味、組織狀態(tài)有顯著影響。滋味不良主要表現(xiàn)在由酸度不足導(dǎo)致發(fā)酵乳的風(fēng)味不佳，缺乏發(fā)酵乳特有的酸甜口味，主要原因是菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)酸不足和產(chǎn)酸速度過慢，無法在指定時(shí)間內(nèi)達(dá)到特定酸度要求。組織狀態(tài)不佳表現(xiàn)在發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)不佳，體系結(jié)構(gòu)呈塊狀，黏稠度低，并且水相分離嚴(yán)重，主要原因可能是菌種發(fā)酵過程中所產(chǎn)胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）量不同導(dǎo)致黏性不同，乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的黏性物質(zhì)^[26]，發(fā)酵乳的黏稠性與胞外多糖的量有著直接關(guān)系。菌種組合L1+L2+L5在發(fā)酵乳的滋味和組織狀態(tài)方面表現(xiàn)都非常出色。

綜合表4和表5中結(jié)果，最終將最優(yōu)發(fā)酵菌種組合確定為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

核桃原漿的不同料液比對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳品質(zhì)的影響見圖2。

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶1～1∶5時(shí)，發(fā)酵乳的感官評(píng)分持續(xù)快速增加，發(fā)酵乳的持水性呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1∶5時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值85.6分，此時(shí)持水性為59.4%；當(dāng)料液比為1∶5～1∶9時(shí)，感官評(píng)分和持水性均逐漸下降，這是由于料液比過大時(shí)，核桃中以酮類為主要呈香物質(zhì)，因過度稀釋導(dǎo)致香味不突出，口味偏淡，并且與傳統(tǒng)乳基發(fā)酵乳不同，純植物基發(fā)酵乳因植物蛋白種類、分子量、空間結(jié)構(gòu)與動(dòng)物蛋白不同，較高的料液比使其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體系很不穩(wěn)定，導(dǎo)致發(fā)酵乳體系水相分離嚴(yán)重，影響發(fā)酵乳的整體品質(zhì)；當(dāng)料液比過大時(shí)，核桃原漿濃度過大，氣味濃郁而無法體現(xiàn)核桃的清香，過于濃稠的發(fā)酵底物也使發(fā)酵過程中乳酸菌不能均勻發(fā)酵核桃原漿，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酸不足，影響核桃發(fā)酵乳的口感。因此，最適料液比為1∶5。

2.3.2 蔗糖添加量對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

不同蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)品持水性和感官評(píng)分的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)蔗糖添加量為1%～7%時(shí)，發(fā)酵乳的持水性和感官評(píng)分均呈升高趨勢(shì)；當(dāng)蔗糖添加量為7%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，為86.4分，此時(shí)持水性為56%；當(dāng)蔗糖添加量大于7%后，感官評(píng)分下降，但是持水性緩慢上升。在傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)工藝中添加蔗糖的主要原因：添加適量蔗糖可以調(diào)節(jié)發(fā)酵乳的糖酸比例進(jìn)而增加發(fā)酵產(chǎn)品的味感，并增加產(chǎn)品的滲透壓，減少雜菌污染來保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全和延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期，同時(shí)蔗糖的添加可為乳酸菌提供生長(zhǎng)繁殖所需的能量。因此通過試驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)蔗糖添加量過少時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)繁殖緩慢，活力較低，導(dǎo)致核桃原漿所需發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，極易引起體系水相分離和味道過酸，體系水相分離嚴(yán)重會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致發(fā)酵乳的持水性下降，從而影響發(fā)酵乳的品質(zhì)。蔗糖添加量過多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵乳產(chǎn)品過甜，遮蓋了產(chǎn)品原有核桃醇厚的風(fēng)味，口味變差。因此，核桃發(fā)酵乳最適的蔗糖添加量為7%。

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)品持水性和感官評(píng)分的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為32～36℃時(shí)，發(fā)酵乳的持水性和感官評(píng)分均升高；當(dāng)發(fā)酵溫度為36℃時(shí)，感官評(píng)分和持水性均達(dá)到最高，分別為85.4分和60%；當(dāng)發(fā)酵溫度大于36℃后，發(fā)酵乳的感官評(píng)分大幅度下降，其持水性也呈逐漸下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度過低時(shí)，乳酸菌種活性偏低，其產(chǎn)酸能力較弱，導(dǎo)致發(fā)酵乳中因風(fēng)味物質(zhì)發(fā)酵不充分而風(fēng)味較差，并且因乳酸菌活性不高導(dǎo)致的發(fā)酵不充分也使發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)體系不穩(wěn)定，進(jìn)而表現(xiàn)出較低的持水性；當(dāng)發(fā)酵溫度過高時(shí)，發(fā)酵乳體系酸化程度較大，以植物蛋白為發(fā)酵底物的植物基發(fā)酵乳極易形成不良的酸餿味，并且較高的發(fā)酵溫度使核桃中的揮發(fā)性醛類物質(zhì)大量揮發(fā)，產(chǎn)生過多的不良“草味”，還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品體系水相分離嚴(yán)重。綜上，相對(duì)于低溫發(fā)酵，較高的發(fā)酵溫度更易影響發(fā)酵乳的口感、風(fēng)味和外觀品質(zhì)。在適宜的發(fā)酵溫度下，純植物基核桃發(fā)酵乳能夠獲得純凈的香氣、細(xì)膩的口感和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)體系。因此，最適發(fā)酵溫度為36℃。

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)品持水性和感官評(píng)分的影響見圖5。

由圖5可知，當(dāng)核桃原漿的發(fā)酵時(shí)間為8～12 h時(shí)，發(fā)酵乳的感官評(píng)分和持水性均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為12 h時(shí)，產(chǎn)品的感官評(píng)分和持水性均達(dá)到最高，分別為84.4分和59.6%；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于12 h后，因發(fā)酵過度導(dǎo)致發(fā)酵乳體系酸度持續(xù)上升，酸味過重使感官評(píng)分持續(xù)下降。因?yàn)楹颂抑械暮颂矣秃胸S富的不飽和脂肪酸甘油酯，容易氧化、酸敗和變質(zhì)，因此發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致核桃原漿在發(fā)酵過程中氧化嚴(yán)重，使發(fā)酵乳表面容易產(chǎn)生紫色色變，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味；發(fā)酵時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致其發(fā)酵不完全，使發(fā)酵乳的呈味物質(zhì)未完全體現(xiàn)，從而導(dǎo)致香氣不足，并且因?yàn)榘l(fā)酵不完全導(dǎo)致乳酸菌所產(chǎn)的胞外多糖不足，乳酸菌分泌的胞外多糖作為一種天然的增稠劑和穩(wěn)定劑被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)質(zhì)地的改善，因此缺乏胞外多糖使發(fā)酵乳體系缺少黏性，導(dǎo)致發(fā)酵乳體系水分析出過多，水相分離嚴(yán)重，影響體系的穩(wěn)定性，進(jìn)而使口感不佳。因此，純植物基核桃發(fā)酵乳的最適發(fā)酵時(shí)間為12 h。

2.3.5 菌種接種量對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

不同菌種添加量對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)品持水性和感官評(píng)分的影響見圖6。

由圖6可知，在制作純植物基核桃發(fā)酵乳時(shí)接種1.5%～4.5%的菌種，發(fā)酵乳的感官評(píng)分和持水性隨之增加；當(dāng)接種4.5%的菌種時(shí)，感官評(píng)分和持水性均達(dá)到最高值，分別為86分和58.6%；當(dāng)菌種接種量超過4.5%后，感官評(píng)分下降，持水性也緩慢下降。因?yàn)楸＜永麃喨闂U菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，嗜熱鏈球菌有較強(qiáng)的產(chǎn)黏能力，當(dāng)菌種接種量過少時(shí)，發(fā)酵不充分，發(fā)酵乳的酸度和體系黏度不足，導(dǎo)致風(fēng)味和口感不佳；菌種接種量過大時(shí)，產(chǎn)酸過多，導(dǎo)致發(fā)酵乳的酸味過重，發(fā)酵乳體系酸度過高使水分析出嚴(yán)重，導(dǎo)致發(fā)酵乳呈豆腐渣狀和團(tuán)塊狀，對(duì)發(fā)酵乳的呈香呈味產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，最適菌種接種量為4.5%。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析

2.4.1 建立回歸模型和方差分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（X₁）、發(fā)酵時(shí)間（X₂）、菌種接種量（X₃）3個(gè)因素，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)核桃發(fā)酵乳加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表6中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=89.28+1.42X₁+0.36X₂+2.71X₃-0.67X₁X₂+1.33X₁X₃-0.10X₂X₃-5.11X₁²-5.19X₂²-7.34X₃²。

由表7可知，該試驗(yàn)感官評(píng)分二次多元回歸模型的P值＜0.000 1，說明該回歸模型極顯著（P＜0.01）。此外，回歸模型失擬項(xiàng)的P值為0.252 9（Pgt;0.05），表明該回歸模型的失擬結(jié)果不顯著，綜上可得，該回歸模型方差分析結(jié)果與實(shí)際結(jié)果非常接近，因此，此二次多元回歸模型適用于擬合試驗(yàn)。通過進(jìn)一步分析該回歸模型可得，模型的決定系數(shù)R²=0.993 1，說明該模型能夠解釋99.31%的響應(yīng)值變化，存在0.69%的總變異，表明該模型的擬合度好、可信度高，試驗(yàn)的誤差較小，因此可應(yīng)用于純植物基核桃發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)。模型響應(yīng)值Y的變異系數(shù)（coefficient of variation，C.V.）是標(biāo)準(zhǔn)值與平均值的比值，C.V.可以直接反映出試驗(yàn)的精準(zhǔn)度，且與試驗(yàn)的精準(zhǔn)度和重復(fù)性成反比，其值越大代表可靠性越差，本試驗(yàn)感官評(píng)分?jǐn)M合中的C.V.=0.94%＜5%，表明試驗(yàn)的精準(zhǔn)度和重復(fù)性都較高，且可信度較高。

由P值可知，一次項(xiàng)X₁、X₃，二次項(xiàng)X₁²、X₂²和X₃²之間的交互作用均極顯著（P＜0.01），對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳感官評(píng)分的影響較大；交互項(xiàng)X₁X₃對(duì)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05）；交互項(xiàng)X₁X₂和X₂X₃對(duì)結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05），對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳感官評(píng)分的影響較小。3個(gè)因素對(duì)純植物基核桃發(fā)酵乳感官評(píng)分的影響程度為菌種接種量（X₃）＞發(fā)酵溫度（X₁）＞發(fā)酵時(shí)間（X₂）。

2.4.2 各因素間交互作用的影響

響應(yīng)面陡峭越明顯、等高線越密集且呈橢圓形，表明兩因素的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著。因此，兩因素具有非常明顯的交互作用時(shí)，等高線的形狀為橢圓形或馬鞍形，沒有顯著的交互作用時(shí)，等高線的形狀為圓形。通過Design-Expert軟件中的響應(yīng)面優(yōu)化分析方法得出純植物基核桃發(fā)酵乳的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量各因素交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖7～圖9。交互項(xiàng)X₁X₃的曲面傾斜度較大、坡度較陡，且等高線呈橢圓形、較密集，說明其交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.4.3 最佳發(fā)酵條件的確定和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design-Expert軟件分析得到最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間12.05 h、發(fā)酵溫度36.33℃、菌種接種量4.8%，在此優(yōu)化條件下，感官評(píng)分理論值達(dá)到89.7分。為了驗(yàn)證模型的精準(zhǔn)性，考慮到現(xiàn)有設(shè)備的參數(shù)和發(fā)酵乳產(chǎn)品制作的實(shí)際操作，根據(jù)可行性最終將發(fā)酵工藝條件參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間12 h、發(fā)酵溫度36℃、菌種接種量4.5%，采用此工藝條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)感官評(píng)分達(dá)到89.4分，與預(yù)測(cè)值相近，說明該模型適用于純植物基核桃發(fā)酵乳發(fā)酵工藝的優(yōu)化，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 純植物基核桃發(fā)酵乳理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)分析

由表8可知，酸度為（76.4±2.2）°T，蛋白質(zhì)含量為（4.16±0.15） g/100 g，乳酸菌含量為1.68×10⁹ CFU/g，大腸桿菌和致病菌均未檢出，理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)T/WSJD 12—2020《植物蛋白飲料 植物酸奶》的相關(guān)要求。該發(fā)酵乳是一款美味營(yíng)養(yǎng)、健康安全、天然無添加的純植物基發(fā)酵乳產(chǎn)品。

3 結(jié)論

本研究通過篩選合適的發(fā)酵菌種對(duì)核桃原漿進(jìn)行發(fā)酵，制備純植物基核桃發(fā)酵乳，緩解了原核桃發(fā)酵乳存在的口感粗糙、風(fēng)味不佳的問題。以持水性和感官評(píng)分為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定了最佳發(fā)酵工藝條件為料液比1∶5、蔗糖添加量7%、發(fā)酵溫度36℃、發(fā)酵時(shí)間12 h、菌種接種量4.5%。在此條件下純植物基核桃發(fā)酵乳口感細(xì)膩、香味濃郁、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，感官評(píng)分達(dá)到89.4分，相關(guān)理化和微生物指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。該發(fā)酵乳是一款風(fēng)味獨(dú)特的純植物基發(fā)酵乳新產(chǎn)品，對(duì)核桃資源的利用和滿足消費(fèi)者對(duì)純植物基發(fā)酵乳的多元化選擇具有一定促進(jìn)作用，并為后續(xù)純植物基發(fā)酵乳的發(fā)酵劑復(fù)配提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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