關(guān)鍵詞益母草堿；GAS6/Axl信號通路；冠心??；心肌損傷

冠心病屬于心血管相關(guān)疾病，具有高致殘率及高致死率，其主要是由于沉積物積聚促使冠狀動脈狹窄、阻塞，引發(fā)心肌組織缺氧、缺血、壞死等損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)心絞痛、心悸、呼吸急促、乏力等癥狀，若不及時治療，還可加劇損傷，引發(fā)心肌梗死、心力衰竭，甚至威脅患者的生命安全[1]。目前，冠心病的臨床治療主要通過服用防血栓類藥物以防止冠狀動脈阻塞，但現(xiàn)有治法服藥周期長且難以消除病根，因此迫切需要尋求新型特效藥以緩解患者病情[2]。

益母草堿提取自中藥益母草，具有降血脂、溶栓、保護(hù)心血管等多種藥理作用，被廣泛應(yīng)用于心血管相關(guān)疾病的治療。已有研究顯示，益母草堿可減輕血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導(dǎo)的小鼠心臟肥大、纖維化和炎癥，抑制心臟損傷和功能障礙，改善心功能[3]。生長停滯特異性蛋白6（growtharrest-specificprotein-6，GAS6）/酪氨酸蛋白激酶受體（Axl）信號通路在維持心臟正常功能中具有重要作用，激活GAS6/Axl-AMP活化蛋白質(zhì)激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）信號通路可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡[4]。本研究通過探究益母草堿對GAS6/Axl信號通路的影響，闡明其減輕冠心病大鼠心肌損傷的機制，以期為冠心病的治療尋求新策略。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ReadMax1500型酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）、RX50型顯微鏡[思科諾思生物科技（北京）有限公司]、4200SF型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

益母草堿對照品（批號yb-019，純度≥98%）購自上海鈺博生物科技有限公司；GAS6/Axl信號通路抑制劑R428對照品（批號ab141364，純度＞98%）購自英國Abcam公司；腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為ER006、ER008-16、ER003-48）均購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatinekinaseisoenzyme，CK-MB）、肌鈣蛋白Ⅰ（troponinⅠ，cTnⅠ）、肌紅蛋白（myoglobin，Mb）ELISA試劑盒（批號分別為JLC15558、JLC14924、JLC15548）均購自江西江藍(lán)純生物試劑有限公司；兔源胱天蛋白酶3（caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）抗體（批號分別為LM-0081R、LM0057）均購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；兔源GAS6抗體（批號BKKT17001）購自上海帛科生物技術(shù)有限公司；兔源磷酸化Axl（phosphorylatedAxl，p-Axl）、Axl抗體（批號分別為kl-5181R、kl230Ra21）均購自上?？道噬锟萍加邢薰?；兔源剪切型caspase-3（cleaved-caspase-3）抗體（批號9661T）購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；兔源Bcl-2抗體（批號FNab00839）購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔源β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號k10085）購自北京百奧萊博科技有限公司；TUNEL試劑盒（批號Y1040S）購自優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（批號B1061）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白G二抗（批號abs20002）購自愛必信（上海）生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

60只7周齡、體重（200±20）g的SPF級正常健康雄性SD大鼠[動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2022-0001]購自河南省實驗動物中心。所有大鼠飼養(yǎng)于溫度21～23℃、相對濕度55%、12h光/12h暗交替的環(huán)境中，飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水。本研究方案已獲得河南利欣制藥股份有限公司動物倫理委員會審批（審批號2022-030195）。

2 方法

2.1 冠心病大鼠模型構(gòu)建

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，選取12只正常健康大鼠喂養(yǎng)普通飼料作為對照組。剩余48只大鼠進(jìn)行冠心病造模，具體造模方法及成模判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：先以高脂飼料（87.3%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.5%?；悄懰徕c+0.2%丙基硫氧嘧啶）喂養(yǎng)6周，再連續(xù)注射5mg/（kg·d）鹽酸異丙腎上腺素3d，每天1次。大鼠注射藥物期間仍用高脂飼料喂養(yǎng)。注射3d后，用30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠并連接心電圖，觀察其心電圖ST段變化，當(dāng)ST段抬高≥0.1mV表明冠心病大鼠模型構(gòu)建成功[5]。

2.2 分組與給藥

將造模成功的48只大鼠按隨機抽樣方法分為模型組，益母草堿低、高劑量組（益母草堿-L、益母草堿-H組，分別灌胃25、100mg/kg的益母草堿+腹腔注射75mg/kg的生理鹽水[6]），益母草堿高劑量+GAS6/Axl信號通路抑制劑組（益母草堿-H+R428組，灌胃100mg/kg的益母草堿+腹腔注射75mg/kg的R428[7]），每組12只。各給藥組大鼠給予相應(yīng)藥物，對照組和模型組大鼠灌胃并腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)48d。

2.3 大鼠心功能檢測

給藥結(jié)束后24h，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，超聲心動圖監(jiān)測5個周期（1個周期0.10～0.16s）的左室射血分?jǐn)?shù)（leftventricularejectionfraction，LVEF），取均值作為最終結(jié)果，計算左室短軸縮短率（leftventricularfractionalshortening，LVFS）及二尖瓣環(huán)舒張早期與舒張晚期運動速度之比（ratioofearly-diastolicandlate-diastolicmotionvelocityofthemitralring，Em/Am）。LVFS＝（左心室的舒張末期內(nèi)徑－左心室的收縮末期內(nèi)徑）/左心室的舒張末期內(nèi)徑×100%。

2.4 大鼠血清中炎癥因子及心肌損傷標(biāo)志物水平檢測

心功能檢測結(jié)束后，各組大鼠腹主動脈取血，靜置后離心，取血清，按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）及心肌損傷標(biāo)志物（CK-MB、cTnⅠ、Mb）水平。

2.5 大鼠心肌組織病理形態(tài)觀察

取血結(jié)束，處死大鼠，取心肌組織。每組選擇6只大鼠的心肌組織，制成石蠟切片（厚5μm），行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)。其余心肌組織置于－20℃冰箱中冷凍保存。

2.6 大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率檢測

取“2.5”項下各組大鼠的心肌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水后進(jìn)行TUNEL染色、DAPI染色，具體操作參照試劑盒說明書；脫水后透明密封，顯微鏡下觀察心肌組織細(xì)胞凋亡情況（凋亡細(xì)胞呈紅色）。計算心肌組織細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率（%）＝TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7 大鼠心肌組織中凋亡及GAS6/Axl信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

取各組剩余6只大鼠的心肌組織，研碎后加入蛋白裂解液在冰上充分裂解，提取總蛋白并進(jìn)行定量，沸水浴變性。取變性蛋白，在電壓60V下電泳分離4～5h，然后在電壓60V下濕轉(zhuǎn)2h至硝酸纖維素膜，封閉液室溫?fù)u床封閉1h。將膜與cleaved-caspase-3、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAS6、p-Axl、Axl、β-actin一抗（其中cleavedcaspase-3、caspase-3抗體的稀釋比例均為1∶1000，其余一抗的稀釋比例均為1∶2000）在4℃下共孵育8h；洗膜后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例1∶10000）在37℃下共孵育1h。經(jīng)可視化處理后，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用Image軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量，并計算cleaved-caspase-3/caspase-3、Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠心功能測定結(jié)果

模型組大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均較對照組顯著降低（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均較模型組顯著升高（P＜0.05），且益母草堿-H組上述指標(biāo)變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均較益母草堿-H組顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 大鼠血清中炎癥因子水平測定結(jié)果

模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較對照組顯著升高（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較模型組顯著降低（P＜0.05），且益母草堿-H組上述指標(biāo)變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.3 大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物水平測定結(jié)果

模型組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均較對照組顯著升高（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均較模型組顯著降低（P＜0.05），且益母草堿-H組上述指標(biāo)變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

3.4 大鼠心肌組織病理形態(tài)觀察結(jié)果

對照組大鼠心肌細(xì)胞與心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞形態(tài)正常、大小均勻，無炎癥細(xì)胞浸潤；與對照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞與纖維排列紊亂，細(xì)胞肥大，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞數(shù)量減少，大量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組相比，益母草堿各劑量組大鼠心肌細(xì)胞與纖維排列相對整齊，細(xì)胞形態(tài)相對正常，細(xì)胞數(shù)量增多，炎癥細(xì)胞浸潤減少；與益母草堿-H組比較，益母草堿-H+R428組大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重，細(xì)胞及纖維排列紊亂，細(xì)胞異常肥大，細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥細(xì)胞浸潤明顯。結(jié)果見圖1。

3.5 大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率測定結(jié)果

模型組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率[（34.69±3.56）%]較對照組[（1.53±0.19）%]顯著升高（P＜0.05）；益母草堿-L組、益母草堿-H組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率[分別為（21.25±2.34）%、（9.44±9.87）%]均較模型組顯著降低（P＜0.05），且益母草堿-H組大鼠上述指標(biāo)變化較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率[（18.67±1.93）%]較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

3.6 大鼠心肌組織中凋亡及GAS6/Axl信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)測定結(jié)果

模型組大鼠心肌組織中cleaved-caspase-3/caspase-3比值較對照組顯著升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相對表達(dá)量均較對照組顯著降低（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠心肌組織中cleavedcaspase-3/caspase-3比值均較模型組顯著降低（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相對表達(dá)量均較模型組顯著升高（P＜0.05），且益母草堿-H組大鼠上述指標(biāo)變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠心肌組織中cleaved-caspase-3/caspase-3比值較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相對表達(dá)量均較益母草堿-H組顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表4。

4 討論

冠心病是引發(fā)心血管相關(guān)死亡的主要因素，其主要是由于血脂沉積造成冠狀動脈狹窄阻塞，促使心肌缺血缺氧，造成組織壞死，同時大量巨噬細(xì)胞浸潤，釋放炎癥因子，引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，加劇心肌缺血缺氧性損傷[8]。尋求冠心病的特效治療藥物至關(guān)重要。中藥益母草前期主要應(yīng)用于治療痛經(jīng)、惡露、更年期綜合征、陰道異常出血等婦科相關(guān)疾病，后期證實其在治療心肌梗死、缺血性腦卒中、動脈粥樣硬化等相關(guān)心腦血管疾病中發(fā)揮降血脂、溶栓、保護(hù)心血管等多種作用，而提取自益母草的主要活性生物堿益母草堿在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9]。已有研究顯示，益母草堿可通過減少梗死相關(guān)酶的釋放、心肌細(xì)胞的凋亡，縮小梗死面積，改善心功能，對心肌缺血再灌注損傷具有改善作用[10]；同時，益母草堿還可抑制心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能[11]。LVEF、LVFS、Em/Am是檢測心功能的常用指標(biāo)，可以直觀反映心功能情況，而心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnⅠ、Mb水平可以反映心肌損傷程度。本研究中，冠心病大鼠的LVEF、LVFS、Em/Am水平降低，CK-MB、cTnⅠ、Mb水平升高，心肌組織發(fā)生損傷；而益母草堿給藥后可升高冠心病大鼠的LVEF、LVFS、Em/Am水平，降低其血清中心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnⅠ、Mb水平。這說明益母草堿可改善心功能，減輕心肌損傷，對冠心病大鼠具有心肌保護(hù)作用。

冠心病的發(fā)生發(fā)展受多種因素影響，其中炎癥及細(xì)胞凋亡均與冠心病心肌損傷息息相關(guān)：當(dāng)心肌組織受到缺血缺氧刺激時，心肌組織發(fā)生壞死，炎癥細(xì)胞浸潤加劇，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子大量釋放，進(jìn)而促使細(xì)胞線粒體發(fā)生損傷，釋放大量細(xì)胞色素C，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，然后激活并活化caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加劇心肌損傷[12―13]?？沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax兩者相互拮抗，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比值可以反映細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡狀態(tài)；cleavedcaspase-3作為caspase-3的活化形式，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，cleaved-caspase-3/caspase-3比值可以反映細(xì)胞凋亡程度。已有研究顯示，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平可緩解內(nèi)皮組織炎癥反應(yīng)，減少血管內(nèi)皮活性物質(zhì)表達(dá)，從而緩解內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌組織損傷，改善冠心病患者病情[14]。抑制TNF-α、IL-6水平，下調(diào)caspase-3、Bax表達(dá)，可抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕冠心病大鼠心肌損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，益母草堿可降低冠心病大鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，降低cleaved-caspase-3/caspase-3、Bcl-2/Bax比值，抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕心肌損傷。

GAS6/Axl信號通路參與調(diào)控多種生理病理進(jìn)程，包括心肌保護(hù)，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，維生素K依賴性蛋白家族成員GAS6參與動脈粥樣硬化及冠狀動脈炎性損傷的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)機體受到刺激時，GAS6可被激活，使其結(jié)合并磷酸化激活細(xì)胞膜表面的Axl，進(jìn)而激活下游多條效應(yīng)通路，抑制炎癥發(fā)生及細(xì)胞凋亡等，從而抑制心肌損傷[16]。已有研究顯示，激活GAS6/Axl-含NOD樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3信號通路，可抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善膿毒癥小鼠心功能[17]。另外，激活GAS6/Axl-AMPK信號通路可抑制炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡，改善心功能和膿毒癥心肌損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，益母草堿可上調(diào)冠心病大鼠心肌組織中GAS6蛋白表達(dá)和升高p-Axl/Axl比值；而加入GAS6/Axl信號通路抑制劑R428后，其可逆轉(zhuǎn)高劑量益母草堿對冠心病大鼠心肌損傷的改善作用，進(jìn)一步證實了益母草堿可通過激活GAS6/Axl信號通路減輕冠心病大鼠心肌損傷。

綜上所述，益母草堿可減輕冠心病大鼠心肌損傷，其作用機制可能與激活GAS6/Axl信號通路相關(guān)，但其具體作用機制還需多方實驗加以論證。