摘要：采用自動(dòng)化裝備進(jìn)行食醋發(fā)酵生產(chǎn)是食醋行業(yè)未來(lái)發(fā)展的方向之一。采用食醋固態(tài)發(fā)酵罐設(shè)備進(jìn)行食醋固態(tài)發(fā)酵，利用共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)酵條件與核心風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性，以滿意度函數(shù)綜合評(píng)分（Dv）為考察指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵工藝并建立響應(yīng)面模型。結(jié)果表明，利用食醋固態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵的最佳工藝條件為翻醅周期24 h、接種量5.20%、溫度35.00 ℃。與傳統(tǒng)手工生產(chǎn)的食醋相比，該工藝條件生產(chǎn)的食醋的理化指標(biāo)（除揮發(fā)酸外）基本無(wú)顯著性差異，兩者核心風(fēng)味物質(zhì)滋味輪基本重合，但香氣輪存在較大差異。溫度作為主要影響因素，與2，3-丁二酮、乙偶姻、糠醛、苯甲醛、苯乙醇、甘露糖、乳酸、丙酮酸、氨基酸呈正相關(guān)，與酯類、乙酸、原料淀粉利用率呈顯著負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：固態(tài)發(fā)酵罐；共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)；滿意度函數(shù)；風(fēng)味物質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS205.5""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）08-0142-07

Analysis of Key Parameters and Optimization of Fermentation Process of

Vinegar Solid-State Fermentation Tank

LI Yan1， WANG Ai-xia1， LI Xiao-wei2， ZHENG Yu2， XIA Meng-lei2，

TONG Li-tao1， WANG Feng-zhong1*

（1.Institute of Food Science and Technology CAAS， Beijing 100193， China; 2.Tianjin Microbial

Metabolism and Fermentation Process Control Technology Engineering Center， School of

Bioengineering， Tianjin University of Science amp; Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： The application of automation equipment for vinegar fermentation production is one of the future development directions in the vinegar industry. Vinegar solid-state fermentation tank equipment is used for vinegar solid-state fermentation， and the correlation between fermentation conditions and core flavor substances is analyzed using co-occurrence network. With the satisfaction degree function comprehensive score （Dv） as the evaluation index， the fermentation process is optimized and a response surface model is established. The results show that the optimal process conditions for fermentation by vinegar solid-state fermentation tank are the mash turning cycle of 24 h， the inoculation amount of 5.20%， and the temperature of 35.00 ℃. Compared with vinegar produced by traditional method， there is no significant difference in the physicochemical indexes （except for volatile acids） of vinegar produced under these process conditions. The taste wheel of core flavor substances of the two basically overlaps， but there is a significant difference in the aroma wheel. As the core factor， temperature is positively correlated with 2，3-butanedione， acetoin， furfural， benzaldehyde， phenethyl alcohol， mannose， lactic acid， pyruvate and amino acid， while negatively correlated with esters， acetic acid and utilization rate of starch raw materials.

Key words： solid-state fermentation tank; co-occurrence network; satisfaction degree function; flavor substances

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.024

引文格式：李巖，王愛霞，李曉偉，等.食醋固態(tài)發(fā)酵罐關(guān)鍵參數(shù)解析與發(fā)酵工藝優(yōu)化.中國(guó)調(diào)味品，2024，49（8）：142-148，185.

LI Y， WANG A X， LI X W， et al.Analysis of key parameters and optimization of fermentation process of vinegar solid-state fermentation tank.China Condiment，2024，49（8）：142-148，185.

收稿日期：2023-12-17

基金項(xiàng)目：“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1600101）

作者簡(jiǎn)介：李巖（1982—），男，博士，研究方向：功能食品與生物活性物質(zhì)。

*通信作者：王鳳忠（1972—），男，研究員，博士，研究方向：功能食品與生物活性物質(zhì)。

食醋是國(guó)際上消費(fèi)量最大的調(diào)味品之一，歐美等西方國(guó)家多以水果為原料釀造食醋，多用液態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)食醋，而我國(guó)以谷物為原料，采用固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)食醋，釀造歷史悠久，形成了其獨(dú)特的風(fēng)味特征。谷物醋發(fā)酵過(guò)程大致分為酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段，其中醋酸發(fā)酵階段被認(rèn)為是食醋的特征性芳香代謝物形成和乙酸積累的最復(fù)雜和最關(guān)鍵的步驟。

翻醅是食醋生產(chǎn)中必不可少的環(huán)節(jié)，主要用來(lái)增加醋醅中氧氣含量、散發(fā)微生物代謝產(chǎn)生的熱量以及進(jìn)行物質(zhì)交換等。傳統(tǒng)食醋的生產(chǎn)主要采用手工翻醅方式，勞動(dòng)力需求高，作業(yè)環(huán)境差，20世紀(jì)90年代食醋固態(tài)翻醅機(jī)的開發(fā)應(yīng)用使食醋生產(chǎn)走向機(jī)械化，較大地提高了翻醅效率。近年來(lái)，密閉式發(fā)酵罐逐漸應(yīng)用于食醋的生產(chǎn)，提高了生產(chǎn)過(guò)程的穩(wěn)定性，如鎮(zhèn)江香醋采用微機(jī)集散控制系統(tǒng)制作酒醪，實(shí)現(xiàn)了酒醪的常年穩(wěn)定生產(chǎn)。但對(duì)于醋酸發(fā)酵階段，大多廠家依然采用開放式生產(chǎn)模式，受環(huán)境因素的影響大，存在產(chǎn)品風(fēng)味不穩(wěn)定、生產(chǎn)難以控制等問題。故采用現(xiàn)代化食品生產(chǎn)管理方式，將開放式的醋酸發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)榉忾]或者半封閉式的發(fā)酵罐生產(chǎn)是目前行業(yè)發(fā)展的方向之一。但固態(tài)發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)發(fā)酵存在較大區(qū)別，其發(fā)酵參數(shù)未得到理性控制，如何使用好發(fā)酵罐是目前行業(yè)亟需解決的關(guān)鍵問題。

發(fā)酵環(huán)境因素對(duì)食醋風(fēng)味物質(zhì)的形成起著至關(guān)重要的作用，包括環(huán)境中的酸度、氧氣、溫度等。將發(fā)酵條件與風(fēng)味物質(zhì)聯(lián)系起來(lái)，可評(píng)估其對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，進(jìn)而優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)來(lái)提高發(fā)酵食品的質(zhì)量和產(chǎn)量。Hutchinson等研究了不同發(fā)酵溫度和微生物接種方式對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，證明了酵母菌和醋酸菌能夠在一定比例下共存，且在較高的發(fā)酵溫度（28 ℃）和共接種方式下產(chǎn)酸率更高。然而，傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過(guò)程中，溫度、溶氧、pH等會(huì)不斷變化，對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響。因此，這一過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)即關(guān)鍵環(huán)境因素的識(shí)別與調(diào)控是使微生物正常生長(zhǎng)代謝進(jìn)而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵設(shè)備合理應(yīng)用的前提。Zhang等用Pearson相關(guān)系數(shù)（r）對(duì)山西老陳醋傳統(tǒng)手工和機(jī)械操作生產(chǎn)過(guò)程中理化性質(zhì)（包括溫度、溶氧量、總酸、非揮發(fā)性酸等）與微生物的相關(guān)性進(jìn)行了分析，揭示了溫度和溶氧是發(fā)酵過(guò)程中乙酸、乳酸形成的主要影響因素，其中控制溫度為30 ℃時(shí)乙酸平均生成速率最大，溫度為40 ℃時(shí)乳酸平均生成速率最大。對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行準(zhǔn)確、科學(xué)的分析和評(píng)價(jià)，是優(yōu)化過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，但目前多數(shù)研究者在對(duì)食醋發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，未綜合評(píng)價(jià)香氣、滋味、原料利用率等各項(xiàng)指標(biāo)，食醋固態(tài)發(fā)酵罐的應(yīng)用效果仍不理想。

本研究采用滾筒式食醋固態(tài)發(fā)酵罐，分析醋酸發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵條件翻醅周期、接種量和溫度與核心風(fēng)味物質(zhì)形成的相關(guān)性，以建立共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。以滿意度函數(shù)綜合評(píng)價(jià)原料淀粉利用率、產(chǎn)品滋味和香氣貢獻(xiàn)值的得分（Dv）為響應(yīng)值，優(yōu)化食醋固態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵條件，為食醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

高粱、麩皮、稻殼：市售；α-淀粉酶：寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；固體糖化酶、活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；大曲、火醅：山西紫林醋業(yè)股份有限公司。

3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、丙三醇、濃鹽酸、濃硫酸、苯酚、甲醛、2-辛醇、氯化鈉（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化工有限公司。

1.2" 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀" 日本島津公司；固相微萃取裝置（包括手柄、導(dǎo)向桿、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭）" 美國(guó)Supelco 公司；1200/1260型高效液相色譜分析儀（紫外/蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）" 美國(guó)安捷倫科技有限公司；S-433D型氨基酸自動(dòng)分析儀" 德國(guó)Sykam公司；1500型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀" 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；WM224電子天平" 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TH/GT-S-50滾筒式食醋固態(tài)發(fā)酵罐（50 L）" 南京匯科生物工程設(shè)備有限公司。

1.3" 方法

1.3.1" 食醋發(fā)酵工藝流程

食醋生產(chǎn)工藝流程主要包括酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵。

1.3.1.1" 酒精發(fā)酵

將高粱粉碎至40～50目，加入溫水蒸煮1.5～2.0 h，然后按高粱∶大曲粉為1∶0.625的比例拌曲，補(bǔ)水至料液比為1∶3.3，并按2‰的接種量接入活性干酵母（25～30 ℃溫水活化30 min）。混合均勻后，置于酒精發(fā)酵缸中，于28～30 ℃進(jìn)行為期7 d的酒精發(fā)酵。

1.3.1.2 "醋酸發(fā)酵

取發(fā)酵結(jié)束后的酒醪，按照酒醪∶麩皮∶稻殼為5.0∶1.1∶0.6的比例混合均勻制成醋醅。其中，傳統(tǒng)手工翻醅發(fā)酵方式：將醋醅轉(zhuǎn)入發(fā)酵缸中，按5%的接種量接種火醅，自然發(fā)酵，每天翻醅一次。食醋固態(tài)發(fā)酵罐自動(dòng)發(fā)酵方式：將醋醅裝入滾筒式固態(tài)發(fā)酵罐中，接種火醅，控制填料量為發(fā)酵罐總體積的1/3～2/5，發(fā)酵過(guò)程中控制一定溫度，并按照5 L/min的速率每隔8 h通氣20 min，定期按照罐體轉(zhuǎn)速80 r/min翻醅20 min。

1.3.2" 固態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.2.1" 單因素實(shí)驗(yàn)

翻醅周期的優(yōu)化：設(shè)置溫度為36 ℃，火醅接種量為5%，翻醅周期為8，16，24，32，40 h，比較發(fā)酵結(jié)束時(shí)理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)組成，每個(gè)條件設(shè)置3組平行。

接種量的優(yōu)化：設(shè)置溫度為36 ℃，翻醅周期為24 h，火醅接種量為2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%，比較發(fā)酵結(jié)束時(shí)理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)組成，每個(gè)條件設(shè)置3組平行。

溫度的優(yōu)化：設(shè)置翻醅周期為24 h，火醅接種量為5%，發(fā)酵罐溫度為32，36，40，44，48 ℃，比較發(fā)酵結(jié)束時(shí)理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)組成，每個(gè)條件設(shè)置3組平行。

1.3.2.2" 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以翻醅周期、接種量和溫度為自變量，以滿意度函數(shù)綜合評(píng)分為因變量（響應(yīng)值），采用中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD），應(yīng)用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3.3" 滿意度函數(shù)評(píng)價(jià)方法

采用滿意度函數(shù)，對(duì)發(fā)酵結(jié)束的醋醅樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，以食醋原料淀粉利用率和風(fēng)味品質(zhì)（滋味和香氣）的貢獻(xiàn)值為考察指標(biāo)，按公式（1）和公式（2）計(jì)算醋醅總體評(píng)分（Dv）。各特性評(píng)價(jià)中包括多個(gè)指標(biāo)，假設(shè)其變化是獨(dú)立的，滋味貢獻(xiàn)值以揮發(fā)酸（以乙酸計(jì)）、不揮發(fā)酸、還原糖和氨基酸的貢獻(xiàn)值按相同權(quán)重（0.25）加和，香氣貢獻(xiàn)值以醇類、醛類、酮類和酯類4種主要風(fēng)味化合物的貢獻(xiàn)值按相同權(quán)重（0.25）加和。

di=Yi-yiLi-yi。（1）

Dv=∑ji=1di×wi。（2）

式中：di為第i個(gè)考察指標(biāo)的貢獻(xiàn)值；Yi為結(jié)果中第i個(gè)考察指標(biāo)的實(shí)際響應(yīng)值；yi為結(jié)果中第i個(gè)考察指標(biāo)的最低響應(yīng)值；Li為結(jié)果中第i個(gè)考察指標(biāo)的最高響應(yīng)值；Dv為醋醅品質(zhì)的得分；wi 為每個(gè)考察指標(biāo)的權(quán)重值。其中，原料淀粉利用率、滋味和香氣貢獻(xiàn)值的權(quán)重值分別為0.2，0.5，0.3。

1.3.4" 分析方法

樣品預(yù)處理：取5.0 g樣品，加入45.0 mL 去離子水，于60 ℃浸泡1 h，待溫度降至30 ℃以下，取15.0 mL樣品以8 000 r/min離心5 min，取上清液，將上清液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中待測(cè)，測(cè)定結(jié)束后于-20 ℃留樣保存。

總酸、不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮、總糖含量參照國(guó)標(biāo)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》中規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定；還原糖含量采用DNS法測(cè)定；乙醇含量采用生物傳感儀測(cè)定；有機(jī)酸、氨基酸、單糖、揮發(fā)性成分含量按照之前報(bào)道的方法測(cè)定，物質(zhì)含量以“g/100 g 干醋醅”為單位計(jì)算。原料淀粉利用率按照公式（3）進(jìn)行計(jì)算。

原料利用率=醋醅中總酸（以乙酸計(jì)）+醋醅中酒精含量×1.304（原料全糖含量-醋醅中全糖含量）×0.666 7。（3）

1.3.5" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用3個(gè)發(fā)酵平行樣品的平均值表示，誤差為標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和Origin進(jìn)行處理。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異性分析采用T檢驗(yàn)。用Origin計(jì)算發(fā)酵條件與核心風(fēng)味物質(zhì)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)（r）并配對(duì)雙尾顯著性檢驗(yàn)，對(duì)其中|r|＞0.7且P＜0.05作為強(qiáng)相關(guān)性節(jié)點(diǎn)，導(dǎo)入Gephi軟件即可得共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵罐食醋發(fā)酵條件

食醋是一種發(fā)酵食品，溫度、溶氧等發(fā)酵條件對(duì)其發(fā)酵過(guò)程有重要影響。本研究利用滿意度函數(shù)對(duì)固態(tài)發(fā)酵罐食醋發(fā)酵條件進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分別以翻醅周期、溫度、接種量為自變量，食醋原料淀粉利用率和風(fēng)味品質(zhì)（滋味和香氣）貢獻(xiàn)值為因變量，對(duì)固態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖1。

食醋發(fā)酵過(guò)程中原料淀粉利用率主要通過(guò)乙酸和總糖來(lái)計(jì)算，由圖1中A可知，隨著翻醅周期的延長(zhǎng)，原料淀粉利用率呈先升高后降低的趨勢(shì)（P＜0.01），在每隔16 h翻醅條件下原料淀粉利用率最高，此時(shí)總糖含量最高，為37.71 g/100 g。在翻醅周期為8，24，40 h時(shí)，滋味貢獻(xiàn)值無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在這3個(gè)條件下分別有最高還原糖貢獻(xiàn)值0.73、揮發(fā)酸貢獻(xiàn)值0.95、氨基酸態(tài)氮貢獻(xiàn)值0.45和不揮發(fā)酸貢獻(xiàn)值1.00。隨著翻醅周期的延長(zhǎng)（40 h除外），香氣貢獻(xiàn)值逐漸增加（P＜0.01）。翻醅是傳統(tǒng)食醋固態(tài)醋酸發(fā)酵階段的一個(gè)重要工藝，通過(guò)翻醅補(bǔ)充氧氣和進(jìn)行物質(zhì)交換，調(diào)節(jié)溫度、溶氧等微生物生長(zhǎng)代謝的主要環(huán)境，從而完成發(fā)酵過(guò)程。由于翻醅頻率降低使得溶氧降低，微生物特別是醋酸菌代謝速率減慢，乙醇氧化為乙酸速率降低，由于乙酸抑制作用的減少，其他微生物如乳桿菌、芽孢桿菌等能更快地將原料分解成氨基酸態(tài)氮、乳酸及揮發(fā)性成分。然而，每隔8 h翻醅條件下?lián)]發(fā)酸貢獻(xiàn)值較低（0.74），原因在于乙醇氧化速率過(guò)快，乙醇被完全氧化和耗盡時(shí)，一些醋酸菌如Acetobacter、Gluconacetobacter和Komagataeibacter可以通過(guò)檸檬酸循環(huán)和乙醛酸途徑利用乙酸并將其完全氧化成二氧化碳和水，即“過(guò)氧化”，從而降低乙酸的含量。

接種量決定了微生物在發(fā)酵罐中的濃度，對(duì)于混菌發(fā)酵而言，增加接種量可以增加微生物的濃度，縮短發(fā)酵周期，并減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)，然而過(guò)高的接種量會(huì)使發(fā)酵提前結(jié)束，最終導(dǎo)致風(fēng)味形成不足。由圖1中B可知，當(dāng)接種量由2.5%增加至5%時(shí)，原料淀粉利用率顯著增加（P＜0.01），接種量繼續(xù)增加至7.5%時(shí)，則無(wú)顯著性差異（P＞0.05），之后隨著接種量的增加而顯著降低（P＜0.01）。滋味和香氣貢獻(xiàn)值隨著接種量的增加呈現(xiàn)波動(dòng)性下降的趨勢(shì)，且分別在接種量為10%和12.5%時(shí)有最低香氣貢獻(xiàn)值（0.31）和滋味貢獻(xiàn)值（0.44）。

溫度的改變必然會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)代謝，從而影響風(fēng)味物質(zhì)的生成。由圖1中C可知，隨著溫度的升高，原料淀粉利用率顯著下降（P＜0.01），而44 ℃和48 ℃條件下，原料淀粉利用率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。不同于傳統(tǒng)的開放式發(fā)酵工藝，食醋固態(tài)發(fā)酵罐可實(shí)現(xiàn)控溫發(fā)酵，一般認(rèn)為30～34 ℃是醋酸菌的最佳生長(zhǎng)活動(dòng)溫度，當(dāng)溫度超過(guò)42 ℃時(shí)，醋酸菌很難存活。32，36，40，44 ℃條件下，乙酸貢獻(xiàn)值分別為1.00，0.95，0.36，0.00，相關(guān)性分析結(jié)果表明，溫度主要影響乙酸的形成，導(dǎo)致較低的原料利用率。隨著溫度的上升，滋味和香氣貢獻(xiàn)值呈現(xiàn)波動(dòng)式增加，在48 ℃時(shí)達(dá)到最大值，其中還原糖、氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸以及酮類、醛類化合物的貢獻(xiàn)值（di=1.00）達(dá)到最大。此外，從整體上看，溫度是影響香氣和原料淀粉利用率貢獻(xiàn)值最主要的因素，且與滋味貢獻(xiàn)值有較大相關(guān)性，見表2。

2.2" 發(fā)酵條件對(duì)食醋核心風(fēng)味物質(zhì)的影響

風(fēng)味是發(fā)酵食品的骨架，食品的風(fēng)味由呈香和呈味物質(zhì)組成。前期研究表明，山西老陳醋中TAV＞1的物質(zhì)分別由乙酸、乳酸、檸檬酸、草酸、丙酮酸5種有機(jī)酸，谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、組氨酸5種氨基酸，以及葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、肌醇5種糖類物質(zhì)組成，它們對(duì)山西老陳醋的酸味、甜味、苦味等滋味有重要貢獻(xiàn)；揮發(fā)性香氣化合物主要由2，3-丁二酮、乙酸乙酯、乙偶姻、糠醛、乙酸異戊酯、苯甲醛、苯乙醇、乙二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯等ROVA＞0.1的化合物組成，它們是山西老陳醋的核心風(fēng)味物質(zhì)。計(jì)算發(fā)酵條件與核心風(fēng)味物質(zhì)之間的Pearson相關(guān)性系數(shù)，將其中|r|＞0.7且P＜0.05的值作為強(qiáng)相關(guān)性節(jié)點(diǎn)，結(jié)果見圖2。3個(gè)因素與核心風(fēng)味物質(zhì)之間共有36條線，即36個(gè)相關(guān)關(guān)系，與翻醅周期、接種量和溫度的相關(guān)關(guān)系分別為6，11，19個(gè)，說(shuō)明與翻醅周期和接種量相比，溫度對(duì)食醋風(fēng)味物質(zhì)的影響更大，該結(jié)果與表2中的相關(guān)性分析結(jié)果一致。

由圖2可知，溫度與核心風(fēng)味物質(zhì)主要呈正相關(guān)，接種量與核心風(fēng)味物質(zhì)主要呈負(fù)相關(guān)，翻醅周期與呈香物質(zhì)主要呈正相關(guān)，結(jié)果與圖1中基本一致。溫度與核心香氣物質(zhì)2，3-丁二酮、乙偶姻、糠醛、苯甲醛、苯乙醇呈極顯著正相關(guān)（r＞0.9），與乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯呈顯著負(fù)相關(guān)（r＜-0.8）。發(fā)酵過(guò)程中較高的溫度有助于酮類、醛類物質(zhì)的形成，而低溫條件有助于乙酸乙酯、己酸乙酯等酯類物質(zhì)的形成。溫度與2，3-丁二酮的正相關(guān)性系數(shù)最大（r=0.97），這主要是由于隨著溫度的增加，醋酸菌生長(zhǎng)受到抑制，而乳酸菌代謝活性增加，從而產(chǎn)生較多的2，3-丁二酮。溫度與核心呈味物質(zhì)甘露糖、氨基酸、丙酮酸、乳酸呈顯著正相關(guān)（r＞0.8），與乙酸呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＜-0.9）。其中，溫度分別與乳酸和乙酸的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)系數(shù)最大（r=0.99和 r=-0.96），這主要是由于在一定范圍內(nèi)隨著溫度的增加，乳酸脫氫酶基因（形成乳酸）轉(zhuǎn)錄水平升高，而乙醇脫氫酶（形成乙酸）的轉(zhuǎn)錄水平降低。接種量與呈味物質(zhì)的形成主要呈負(fù)相關(guān)，這主要是由于接種量的增加提高了微生物的濃度。乙醇、碳水化合物、糖醇類物質(zhì)被快速氧化成相應(yīng)的氧化產(chǎn)物（主要為乙酸），導(dǎo)致酸度快速增加，抑制了其他微生物的生長(zhǎng)。接種量與乳酸形成的負(fù)相關(guān)性系數(shù)最大（r=-0.97），原因在于增加接種量，酸度快速增加，醋酸菌代謝活性增強(qiáng)，但醋酸菌不具有合成磷酸果糖激酶的能力，糖酵解代謝不活躍而產(chǎn)生較少乳酸，而在酒精發(fā)酵階段產(chǎn)生的乳酸還能被醋酸菌進(jìn)一步代謝。翻醅周期主要與乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、檸檬酸等風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)，說(shuō)明隨著翻醅周期的縮短，氧的交換速率降低，低氧條件下更能促進(jìn)部分風(fēng)味物質(zhì)的形成，這與溫度、接種量的結(jié)果相符。

2.3" 響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵罐食醋發(fā)酵條件

2.3.1" 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與建模分析

為了確定最佳發(fā)酵條件，在單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了17次運(yùn)行，評(píng)估發(fā)酵溫度、翻醅周期和接種量對(duì)食醋固態(tài)發(fā)酵結(jié)束時(shí)樣品總體評(píng)分（Dv）的影響，結(jié)果見表3。

通過(guò)對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得回歸方程：Y=0.619-0.014A-0.002B-0.046C-0.029AB-0.017AC-0.026BC-0.027A2-0.060B2-0.093C2。

通過(guò)F檢驗(yàn)檢查回歸方程的統(tǒng)計(jì)顯著性，各數(shù)據(jù)方差分析（ANOVA）見表4，模型的F值和低概率值（P=0.007 3＜0.01）表明該模型具有極顯著性；失擬項(xiàng)的P=0.087 1＞0.05，不顯著，與實(shí)際情況擬合較好。因此，該模型可用于分析和預(yù)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中樣品的得分。

2.3.2" 模型預(yù)測(cè)

根據(jù)所得的回歸方程，以響應(yīng)值Dv為縱坐標(biāo)，繪制以翻醅周期、接種量、溫度3個(gè)因素為因變量的響應(yīng)面分析圖（見圖3），用以說(shuō)明各獨(dú)立因素對(duì)食醋發(fā)酵的影響及各獨(dú)立因素的交互作用，從中確定最佳因素水平范圍。溫度對(duì)Dv值有顯著影響，將這3個(gè)因素中的任意兩個(gè)因素作為變量，另一個(gè)固定為中間水平，即可得到本實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面圖。由圖3響應(yīng)面的最高點(diǎn)可直觀地看出，在所選范圍內(nèi)存在最大值。應(yīng)用響應(yīng)面法確定了最佳發(fā)酵條件為翻醅周期21.23 h、接種量5.23%、發(fā)酵溫度35.05 ℃，預(yù)測(cè)最高評(píng)分為0.63。其中，溫度對(duì)Dv值有顯著影響，說(shuō)明溫度是影響食醋發(fā)酵品質(zhì)最主要的因素，結(jié)果與圖2中一致。

2.3.3" 最優(yōu)發(fā)酵工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)整最優(yōu)發(fā)酵條件為翻醅周期24 h、接種量5.20%、發(fā)酵溫度35 ℃。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并與在相同實(shí)驗(yàn)條件下采用傳統(tǒng)手工方式生產(chǎn)的食醋進(jìn)行比較，分析發(fā)酵結(jié)束時(shí)兩種發(fā)酵方式下醋醅的理化指標(biāo)，結(jié)果見表5。相較于傳統(tǒng)手工生產(chǎn)的食醋，采用固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)的食醋中的不揮發(fā)酸、乳酸、還原糖和氨基酸態(tài)氮無(wú)顯著性差異，總酸、乙酸原料利用率和揮發(fā)性成分種類具有顯著性差異。固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)食醋的總酸、乙酸和原料淀粉利用率分別比手工生產(chǎn)的食醋高7.26%、12.44%和6.18%，但揮發(fā)性成分種類低11.21%。這可能是由于傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中缺少控溫裝置，在發(fā)酵中期升溫較快，產(chǎn)生了更多的風(fēng)味物質(zhì)。由圖2可知，高溫更有利于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的積累，不利于乙酸的形成。

為評(píng)價(jià)兩種發(fā)酵方式樣品的風(fēng)味品質(zhì)，分別以核心呈味和呈香風(fēng)味物質(zhì)含量的對(duì)數(shù)值建立風(fēng)味輪，結(jié)果見圖4。不同的風(fēng)味物質(zhì)在兩種發(fā)酵方式下的滋味輪基本重疊（見圖4中a），與手工翻醅方式生產(chǎn)的食醋類似，固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)的食醋中乙酸、乳酸和葡萄糖依然為最主要的呈味物質(zhì)。兩種發(fā)酵方式下的香氣輪存在一定差異（見圖4中b），固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)的食醋中，乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙偶姻為重要的香氣化合物，而2，3-丁二酮、苯甲醛和苯乙醇含量較低，可能是由于傳統(tǒng)手工生產(chǎn)的食醋自然升溫過(guò)程中有助于酮類、醛類物質(zhì)的形成，而不利于酯類物質(zhì)的積累。

3" 結(jié)論

本研究利用滿意度函數(shù)評(píng)價(jià)方法，綜合考慮原料淀粉利用率、產(chǎn)品滋味和香氣的貢獻(xiàn)值，確定了食醋固態(tài)發(fā)酵罐最優(yōu)生產(chǎn)工藝。最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為翻醅周期24 h、接種量5.20%、發(fā)酵溫度35.00 ℃。與傳統(tǒng)手工翻醅工藝相比，采用固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)的食醋中不揮發(fā)酸、乳酸、還原糖和氨基酸態(tài)氮無(wú)顯著性差異，而總酸、乙酸和原料利用率分別提高了7.26%、12.44%和6.18%。溫度是影響食醋風(fēng)味物質(zhì)形成和原料淀粉利用率（乙酸）最主要的因素，溫度的增加有利于2，3-丁二酮、乙偶姻、糠醛、苯甲醛、苯乙醇等核心呈香物質(zhì)與甘露糖、氨基酸、丙酮酸、乳酸等核心呈味物質(zhì)的形成，但不利于乙酸和乙酸乙酯等酯類物質(zhì)的形成。

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