摘要：少孢根霉是一種常見的食用真菌，能夠產(chǎn)生對人類健康有益的化合物，廣泛用作發(fā)酵食品的發(fā)酵劑。該研究以鷹嘴豆為原料，用少孢根霉進(jìn)行發(fā)酵，分析其發(fā)酵過程中的抗氧化能力、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制活性、主要化學(xué)成分含量的變化及發(fā)酵前后的風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中，少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆的抗氧化能力顯著升高，ABTS自由基清除能力在72 h時最高，為19.27 mg TE/g DW，DPPH自由基清除能力、Fe3+還原能力在60 h時最高，分別為2.48，1.56 mg TE/g DW，ACE抑制活性呈先上升后下降的趨勢，在48 h時最高，為67.7%；在發(fā)酵過程中總酚、多肽、可溶性蛋白、還原糖含量均顯著增加。發(fā)酵36 h時樣品中共檢測出62種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，較未發(fā)酵時增加了47種，發(fā)酵后酯類、醛類、醇類3種風(fēng)味物質(zhì)種類明顯增加。該研究為少孢根霉的利用與鷹嘴豆高值化深加工產(chǎn)品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：少孢根霉；鷹嘴豆；風(fēng)味物質(zhì)；抗氧化

中圖分類號：TS201.2""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）08-0022-06

Analysis of Functional Activity and Flavor Substances" in Chickpea

Fermented by Rhizopus oligosporus

REN Jia-min， REN Di-rong， REN Cheng-huan， FU Wei-qi， LI Shu-wen， LI Feng-juan*

（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety， Ministry of Education， State Key Laboratory of Food

Nutrition and Safety Co-constructed by Province and Ministry， College of Food Science and

Engineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： Rhizopus oligosporus is a common edible fungus， which can produce compounds beneficial to human health and is widely used as a starter for fermented food. In this study， chickpea is fermented by Rhizopus oligosporus， and the antioxidant capacity， angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitory activity， change of the content of main chemical components and flavor substances before and after fermentation are analyzed. The results show that during fermentation， the antioxidant capacity of chickpea fermented by Rhizopus oligosporus increases significantly. The scavenging capacity on ABTS radical is the highest at 72 h， which is 19.27 mg TE/g DW， and the scavenging capacity on DPPH radical and Fe3+ reducing capacity are the highest at 60 h， which is 2.48， 1.56 mg TE/g DW respectively. ACE inhibitory activity increases firstly and then decreases， which is the highest of 67.7% at 48 h. The content of total phenols， polypeptides， soluble proteins and reducing sugar increases significantly during frementation. A total of 62 volatile flavor substances are detected in the sample fermented for 36 h， which is 47 more than that in the unfermented sample， and the types of esters， aldehydes and alcohols increase significantly

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.005

引文格式：任佳敏，任帝蓉，任成歡，等.少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中功能活性及風(fēng)味物質(zhì)分析.中國調(diào)味品，2024，49（8）：22-27.

REN J M， REN D R， REN C H， et al.Analysis of functional activity and flavor substances in chickpea fermented by Rhizopus oligosporus.China Condiment，2024，49（8）：22-27.

收稿日期：2024-01-09

基金項目：天津市自然科學(xué)基金項目（16JCYBJC23200）

作者簡介：任佳敏（1999—），女，碩士，研究方向：發(fā)酵食品功能性及風(fēng)味。

*通信作者：李風(fēng)娟（1983—），女，副研究員，博士，研究方向：食品功能性評價及生物活性成分。

after fermentation. This study has provided a theoretical basis for the utilization of Rhizopus oligosporus and the research and development of high-value deep-processed products of chickpea.

Key words： Rhizopus oligosporus; chickpea; flavor substances; antioxidation

少孢根霉是一種常見的能夠在人體內(nèi)產(chǎn)生有益化合物的可食用真菌，廣泛用作發(fā)酵食品的發(fā)酵劑。孫強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，少孢根霉發(fā)酵豆粕后異黃酮含量升高。Yin等用少孢根霉發(fā)酵甘薯渣，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性、酚類含量和可溶性膳食纖維含量均顯著提高。印度尼西亞傳統(tǒng)發(fā)酵豆類食品丹貝也是以少孢根霉為發(fā)酵劑制得的一種產(chǎn)品，其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特，具有抗氧化、抗菌等生理功能，被譽(yù)為“肉的替代品”，是素食者的良好蛋白質(zhì)來源。

鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）是豆科鷹嘴豆屬植物，又名桃豆、腦核豆，含有豐富的營養(yǎng)成分，主要包含蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維等，具有抗氧化、抑菌、抗疲勞、調(diào)節(jié)膽固醇等生理活性。鷹嘴豆是蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)來源，其蛋白質(zhì)消化率和生物利用率均高于大豆。房丹丹等用鷹嘴豆制作酸奶，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)含量與ABTS自由基清除率均高于純酸奶。Li等用枯草芽孢桿菌對鷹嘴豆進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，其可溶性蛋白含量與多肽含量均顯著增加，提高了鷹嘴豆的蛋白質(zhì)分解和抗氧化活性。因此，鷹嘴豆在發(fā)酵食品中具有廣闊的應(yīng)用前景，可對改善制品的風(fēng)味并提高其營養(yǎng)價值產(chǎn)生積極的影響。

鑒于此，本研究以鷹嘴豆為原料，利用少孢根霉固態(tài)發(fā)酵鷹嘴豆，考察發(fā)酵過程中其營養(yǎng)成分、功能活性的變化，并對發(fā)酵前后的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，為高值化鷹嘴豆產(chǎn)品的研發(fā)及發(fā)酵豆制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的思路和指導(dǎo)。

1" 材料和方法

1.1" 材料

少孢根霉（Rhizopus oligosporus）：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）：購于臨沂市蘭山區(qū)大森食品有限公司。

1.2" 主要試劑

三吡啶基三嗪（TPTZ）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、沒食子酸（GA）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde， OPA）、谷胱甘肽（GSH）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、Folin-Ciocalteu試劑：美國Sigma-Aldrich公司；水溶性維生素E（Trolox）：美國MCE公司。

1.3" 主要儀器

GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀" 美國安捷倫科技公司；Model 1680酶標(biāo)儀" 瑞士Tecan公司；IPP Plus 110培養(yǎng)箱" 美墨爾特（上海）貿(mào)易有限公司。

1.4" 實驗方法

1.4.1" 樣品的制備

將鷹嘴豆浸泡12 h，去除種皮，蒸煮25 min，待原料冷卻至室溫后加白醋調(diào)酸（1 mL/100 g），接種少孢根霉種子液（濃度3.67×106 CFU/mL），裝袋扎孔于30 ℃進(jìn)行發(fā)酵，分別在0，12，24，36，48，60，72 h取樣。

1.4.2" 樣品水提液的制備

將樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，打粉后于－20 ℃保存。稱取1 g樣品加10 mL蒸餾水，渦旋2 min，超聲10 min后搖床1 h，在3 800 r/min條件下離心15 min，吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾得到樣液，濃度標(biāo)記為100 mg/mL。

1.4.3" 抗氧化活性的測定

1.4.3.1" ABTS自由基清除能力的測定

測定方法參照Loizzo等的方法。取5 μL水提液（濃度25 mg/mL）、200 μL ABTS反應(yīng)液（濃度7 mmol/L）加入96孔酶標(biāo)板中，以相同體積的無水乙醇作空白對照，暗反應(yīng)30 min，測定732 nm處的吸光值，計算清除率。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量，記為mg TE/g DW。

1.4.3.2" DPPH自由基清除能力的測定

測定方法參照Brand-Williams等的方法。取5 μL水提液（濃度50 mg/mL）、195 μL DPPH反應(yīng)液（濃度0.079 mg/mL）加入96孔酶標(biāo)板中，以相同體積的無水乙醇作空白對照，暗反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光值，計算清除率。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量，記為mg TE/g DW。

1.4.3.3" 鐵離子還原能力的測定

測定方法參照高一芳等的方法。取5 μL水提液（濃度50 mg/mL）、200 μL TPTZ反應(yīng)液加入96孔酶標(biāo)板中，以相同體積的蒸餾水作空白對照，在37 ℃反應(yīng)10 min，于593 nm處測定吸光值。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量，記為mg TE/g DW。

1.4.4" ACE抑制活性的測定

測定方法參照李風(fēng)娟等的方法。以96孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)器，加入15 μL水提液（濃度為10 mg/mL）、30 μL HHL（溶于0.6 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.5）、30 μL ACE酶液（12.5 mU/mL）在37 ℃孵育1 h，加入120 μL 1.2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，再加入30 μL 2%的OPA溶液（溶于甲醇），于室溫下靜置20 min進(jìn)行衍生反應(yīng)，加入30 μL 6 mol/L HCl終止衍生反應(yīng)。空白組不加水提液，空白對照組與樣品對照組不加酶液，以等量蒸餾水代替。在激發(fā)波長340 nm、發(fā)射波長455 nm處測定熒光強(qiáng)度。ACE抑制率計算公式如下：

ACE抑制率%=1－I1－I2I3－I4×100%。

式中：I1為樣品水提液和ACE酶液都存在時的熒光強(qiáng)度；I2為樣品水提液存在、ACE酶液不存在時的熒光強(qiáng)度；I3為樣品水提液不存在、ACE酶液存在時的熒光強(qiáng)度；I4為樣品水提液和ACE酶液都不存在時的熒光強(qiáng)度。

1.4.5" 總酚含量的測定

測定方法參照高一芳等的方法。取100 μL水提液（濃度為25 mg/mL）、80 μL Folin-Ciocalteu顯色劑和80 μL的10% Na2CO3溶液加入96孔酶標(biāo)板中，于37 ℃反應(yīng)60 min，在750 nm處測定吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果表示為沒食子酸毫克當(dāng)量，記為mg GAE/g DW。

1.4.6" 多肽含量的測定

測定方法參照劉婉璐的方法。取15 μL水提液（濃度為10 mg/mL）與300 μL OPA（2.5 mL 5% OPA溶液溶于甲醇、0.1 mol/L四硼酸鈉溶液50 mL、20%十二烷基硫酸鈉溶液5 mL、0.5 mL β-巰基乙醇混勻后定容至100 mL）試劑加入96孔酶標(biāo)板中，室溫反應(yīng)10 min，于340 nm處測定吸光值。以谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果表示為g/100 g。

1.4.7" 可溶性蛋白含量的測定

測定方法參照Huang等的方法。稱取0.1 g樣品與20 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）混合，溶液搖床振蕩1 h，在10 000 r/min條件下離心20 min，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測。取20 μL樣液與200 μL BCA工作液混合，于37 ℃放置20 min，在562 nm處測定吸光值。

1.4.8" 還原糖含量的測定

還原糖的提?。簩?.5 g樣品加入10 mL蒸餾水中，于80 ℃保溫30 min，8 000 r/min離心15 min，上清液用0.45 μm濾膜過濾。

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖含量。取2 mL樣液、1.5 mL DNS加入到25 mL具塞試管中，混勻后沸水浴加熱5 min，立即冷卻并用蒸餾水定容至25 mL，在540 nm處測定吸光值。

1.4.9" 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

將萃取針插入進(jìn)樣口進(jìn)行30 min老化的預(yù)處理，稱取4 g新鮮樣品在研缽中碾碎，轉(zhuǎn)移至萃取瓶中，加入1 μL稀釋的2-甲基-3-庚酮內(nèi)標(biāo)溶液，在60 ℃水浴平衡10 min，再將萃取針插入，頂空吸附30 min，插入進(jìn)樣口解吸15 min。

將檢測到的風(fēng)味物質(zhì)在NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫中檢索，篩選出相似度≥80%的物質(zhì)作為有效的風(fēng)味成分，結(jié)合質(zhì)譜（MS）和保留指數(shù)（RI）進(jìn)行定性分析，以2-甲基-3-庚酮為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析，采用面積歸一化法計算風(fēng)味物質(zhì)的相對含量。

1.4.10" 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均設(shè)置3個平行，使用IBM SPSS Statistics 27軟件進(jìn)行方差分析，使用Origin 2023進(jìn)行繪圖，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中抗氧化活性變化

少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中抗氧化活性變化見圖1。

由圖1可知，發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力呈上升趨勢，未發(fā)酵時ABTS自由基清除能力較低，僅為3.96 mg TE/g DW，經(jīng)過發(fā)酵后顯著提高，在發(fā)酵72 h時達(dá)到最高，為19.27 mg TE/g DW，較未發(fā)酵時提高了4.9倍。隨著發(fā)酵時間的延長，DPPH自由基清除能力整體呈先上升后下降的趨勢，在60 h時達(dá)到最高，為2.48 mg TE/g DW，發(fā)酵前未檢測出DPPH自由基清除能力。發(fā)酵過程中Fe3+還原能力在前60 h顯著升高，之后略有下降，最高為1.56 mg TE/g DW，較未發(fā)酵時提高了3.5倍。發(fā)酵豆制品中的抗氧化活性物質(zhì)主要有黃酮類、氨基酸類、酚類和多糖類物質(zhì)。少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆抗氧化能力的提高可能是因為少孢根霉產(chǎn)生的蛋白酶等酶系將營養(yǎng)物質(zhì)水解成多肽等活性成分，同時酮類物質(zhì)可以使自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而導(dǎo)致抗氧化能力升高。

2.2" 少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中ACE抑制活性變化

ACE是調(diào)節(jié)血壓系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，對其活性的抑制是預(yù)防和治療高血壓的一種公認(rèn)手段。少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆ACE抑制活性變化見圖2。

由圖2可知，在0.59 mg/mL濃度下，ACE抑制活性在發(fā)酵過程中呈先上升后下降的趨勢，在48 h時達(dá)到最高，為67.7%，較未發(fā)酵時提高了1.4倍。因此，少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆可以作為潛在的ACE抑制劑來源。

2.3" 少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中總酚含量變化

少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中總酚含量變化見圖3。

由圖3可知，總酚含量整體呈上升趨勢，未發(fā)酵樣品總酸含量為1.63 mg GAE/g DW，在72 h時達(dá)最高，為6.45 mg GAE/g DW，較未發(fā)酵時增加了3.95倍。酚類化合物在發(fā)酵過程中顯著增加，這與Ichikawa等利用米曲霉和醬油曲霉發(fā)酵豆渣的研究結(jié)果類似，與少孢根霉在發(fā)酵過程中分泌的葡萄糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶的水解有關(guān)，這些酶能有效地分解細(xì)胞壁基質(zhì)，從而促進(jìn)酚類物質(zhì)的釋放，總酚含量的增加進(jìn)一步提高了鷹嘴豆的益生潛力。

2.4" 少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中多肽與可溶性蛋白含量變化

發(fā)酵過程中多肽與可溶性蛋白含量變化見圖4。

由圖4可知，發(fā)酵后多肽含量較未發(fā)酵時顯著提高，未發(fā)酵時未檢測出多肽，在60 h時多肽含量最高，為41.97 g/100 g。隨著發(fā)酵時間的延長，可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趨勢，未發(fā)酵時為35.09 mg/g，發(fā)酵60 h時最高，為61.20 mg/g，較未發(fā)酵時增加了1.75倍。這是因為在發(fā)酵過程中少孢根霉分泌蛋白酶，使得鷹嘴豆蛋白被降解成小肽和游離氨基酸，多肽與可溶性蛋白含量增加。

2.5" 少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中還原糖含量變化

少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆過程中還原糖含量變化見圖5。

發(fā)酵過程中少孢根霉分泌的淀粉酶與纖維素酶將鷹嘴豆中的淀粉和纖維素降解成小分子的還原糖。在發(fā)酵前12 h內(nèi)，未檢測出還原糖，可能是由于少孢根霉的孢子處于萌發(fā)狀態(tài)，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物迅速生長，還原糖含量不斷升高，發(fā)酵60 h時最高，達(dá)到14.72%。還原糖在微生物生長過程中提供碳源，可以促進(jìn)美拉德反應(yīng)，為少孢根霉提供了營養(yǎng)物質(zhì)，可以為產(chǎn)品提供甜味，有利于風(fēng)味化合物的形成。

2.6" 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

未發(fā)酵與發(fā)酵36 h產(chǎn)品中的風(fēng)味物質(zhì)見表1。未發(fā)酵時共檢測出15種風(fēng)味物質(zhì)，而發(fā)酵36 h后共檢測出62種風(fēng)味物質(zhì)，可見利用少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆極大地豐富了鷹嘴豆的風(fēng)味成分。

發(fā)酵前與發(fā)酵后均能檢測出的物質(zhì)有13種，其中含量增加最明顯的是乙醇與異戊醇，乙醇含量的增加主要是由于脂肪和氨基酸的代謝，異戊醇含量的增加可能是由于在發(fā)酵過程中發(fā)生了酯化反應(yīng)或氧化反應(yīng)，醇類是食用菌發(fā)酵產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)，可以為產(chǎn)品帶來花香，其他醇類物質(zhì)也在不同程度上豐富了鷹嘴豆的風(fēng)味。

少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆前后風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)量見圖6。發(fā)酵前未檢測出酯類物質(zhì)，發(fā)酵后檢出的酯類物質(zhì)有14種，能夠帶來愉悅的果香味，發(fā)酵后酯類物質(zhì)較多可能是由于醇類和酸類的代謝產(chǎn)生的脂肪酸酯的積累。發(fā)酵后醛類物質(zhì)增加了7種，發(fā)酵后新增了癸醛，且壬醛含量顯著增加，這兩種醛具有水果香氣。己醛可以產(chǎn)生類似生油脂的不愉快風(fēng)味，發(fā)酵后己醛含量降低，表明發(fā)酵可以降低這種不良風(fēng)味的產(chǎn)生。發(fā)酵后新增了5-甲基-3-庚酮和1-辛烯-3-酮這兩種酮類，5-甲基-3-庚酮具有香草香氣，1-辛烯-3-酮具有蘑菇香味。烯類物質(zhì)的增加也豐富了發(fā)酵后的風(fēng)味，其中1-石竹烯含量最高，使少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆具有檸檬、柑橘的香氣。發(fā)酵后檢出2-正戊基呋喃，且含量較高，可以帶來水果香氣。除以上物質(zhì)外，還含有芳香族、烷類及其他風(fēng)味物質(zhì)，但它們的含量較低，對鷹嘴豆的風(fēng)味貢獻(xiàn)值較低。

3" 結(jié)論

利用少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆，發(fā)酵產(chǎn)品具有良好的抗氧化能力與ACE抑制活性，隨著發(fā)酵時間的延長，其總酚、多肽、可溶性蛋白、還原糖含量均顯著增加，發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)種類增加，有利于進(jìn)一步改善產(chǎn)品風(fēng)味?？梢钥闯觯冁吒拱l(fā)酵鷹嘴豆對其功能活性及風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生積極的影響，后續(xù)將進(jìn)一步研究少孢根霉發(fā)酵鷹嘴豆關(guān)鍵活性成分與風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑，這對豐富發(fā)酵豆制品及研發(fā)新型鷹嘴豆功能食品具有借鑒意義。

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