摘要：目的" 分析感染性肺結(jié)節(jié)患者呼吸道微生態(tài)成分構(gòu)成和變化。方法" 收集2020年6月-2022年12月在我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科診斷和治療的肺結(jié)節(jié)病患者共53例，根據(jù)臨床診斷分為感染組（22例）和非感染組（31例）。收集肺泡灌洗液行宏基因組測(cè)序（mNGS）檢測(cè)呼吸道微生物。比較兩組患者呼吸道微生物Alpha多樣性，以及各指數(shù)ROC和PRC曲線。結(jié)果" 感染組Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于非感染組，而Simpson指數(shù)低于非感染組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。感染組ACE指數(shù)高于非感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。非感染組以G陰性菌和病毒為主要微生物群落，感染組則以G陽性菌為主，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。Sobs、Chao1和Simpson指數(shù)的錯(cuò)誤率高于50%，僅ACE和Shannon指數(shù)錯(cuò)誤率低于50%。ACE和Shannon指數(shù)用于診斷感染性肺結(jié)節(jié)的準(zhǔn)確率、特異性、敏感性和精確度均高于其它指數(shù)。Sobs、Chao1、AEC、Shannon和Simpson指數(shù)ROC的AUC分別為0.396、0.394、0.569、0.582和0.449。PRC的AUC分別為0.476、0.474、0.562、0.647和0.511；聯(lián)合檢測(cè)ROC和PRC的AUC為0.482和0.520。結(jié)論" 呼吸道微生態(tài)與感染性肺結(jié)節(jié)患者相關(guān)，對(duì)呼吸道微生物Alpha多樣性分析可用于感染性肺結(jié)節(jié)患者臨床診斷和治療，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：感染性肺結(jié)節(jié)；呼吸道微生態(tài)；Alpha多樣性

中圖分類號(hào)：R563；R816.4" " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.17.011

文章編號(hào)：1006-1959（2024）17-0064-05

Analysis of Respiratory Tract Microecology in Patients with Infectious Pulmonary Nodules

HE Yan-qin，TANG Wei，ZHANG Yin-jie，SHI Lin-feng，HE Mei-yan

（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture People's Hospital，Xishuangbanna 666100，Yunnan，China）

Abstract：Objective" To analyze the composition and changes of respiratory microecological components in patients with infectious pulmonary nodules.Methods" A total of 53 patients with pulmonary sarcoidosis diagnosed and treated in the Department of Respiratory and Critical Care Medicine of our hospital from June 2020 to December 2022 were collected. According to the clinical diagnosis， they were divided into infection group （22 patients） and non-infection group （31 patients）. Bronchoalveolar lavage fluid was collected for metagenomic sequencing （mNGS） to detect respiratory microorganisms. The Alpha diversity of respiratory microorganisms and the ROC and PRC curves of each index were compared between the two groups.Results" The Sobs index， Chao1 index and Shannon index of the infected group were higher than those of the non-infected group， while the Simpson index was lower than that of the non-infected group， but the difference were not statistically significant （Pgt;0.05）. The ACE index of the infected group was higher than that of the non-infected group， and the difference was statistically significant （Plt;0.05）. The non-infected group was dominated by G-negative and virus， while the infected group was dominated by G-positive bacteria， and the difference was statistically significant （Plt;0.05）. The error rates of Sobs， Chao1 and Simpson indices were higher than 50%， and only ACE and Shannon indices were lower than 50%. The accuracy， specificity， sensitivity and accuracy of ACE and Shannon index in the diagnosis of infectious pulmonary nodules were higher than those of other indexes. The AUC of Sobs， Chao1， AEC， Shannon and Simpson index ROC were 0.396， 0.394， 0.569， 0.582 and 0.449， respectively. The AUC of PRC was 0.476， 0.474， 0.562， 0.647 and 0.511， respectively. The AUC of combined detection of ROC and PRC was 0.482 and 0.520.Conclusion" Respiratory tract microecology is related to patients with infectious pulmonary nodules. The analysis of Alpha diversity of respiratory tract microorganisms can be used for clinical diagnosis and treatment of patients with infectious pulmonary nodules， which has certain application value.

Key words：Infectious lung nodule;Respiratory microecology;Alpha diversity

隨著我國人口結(jié)構(gòu)老齡化和現(xiàn)代影像學(xué)的發(fā)展，肺結(jié)節(jié)診斷率逐漸增加，其檢出率約為20%。但據(jù)美國國家肺癌CT篩查結(jié)果顯示，96.4%的陽性結(jié)節(jié)為良性結(jié)節(jié)，而對(duì)疑似肺癌的肺結(jié)節(jié)患者行手術(shù)治療，良性結(jié)節(jié)率為25%[1，2]。較高假陽性率不利于醫(yī)療資源充分利用和合理分配，可導(dǎo)致誤診和過度治療，也可能引起患者心理焦慮和家庭不睦。以病原微生物將肺部病變分為感染性和非感染性，感染性肺炎由細(xì)菌、病毒、真菌等病原微生物引起，而非感染性肺炎則無特異性病原體或不明[3]。呼吸道中存在微生物菌群，且處于動(dòng)態(tài)變化中，若呼吸道微生態(tài)平衡被打破，就會(huì)對(duì)呼吸胸產(chǎn)生不良影響，引起肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病等疾病[4-7]。因此，研究呼吸道微生態(tài)紊亂引起肺部感染所致結(jié)節(jié)，對(duì)于肺結(jié)節(jié)鑒別診斷和預(yù)防治療具有一定臨床價(jià)值和意義。本研究通過收集患者肺泡灌洗液進(jìn)行mNGS檢測(cè)呼吸道微生物，對(duì)比微生物在感染性和非感染性肺結(jié)節(jié)患者分布情況，分析感染性肺結(jié)節(jié)患者呼吸道微生態(tài)成分構(gòu)成特點(diǎn)。

1資料與方法

1.1一般資料" 收集2020年6月-2022年12月在西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院經(jīng)高分辨CT確診的肺小結(jié)節(jié)患者53例，其中男26例，女27例；年齡18～90歲，平均年齡（53.66±17.95）歲；依據(jù)臨床診斷結(jié)果將患者分為感染性和非感染性肺病兩組。其中非感染組2例患者未參與支氣管鏡檢查和肺泡灌洗液收集。本項(xiàng)目經(jīng)西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NO.2023015），患者和家屬知情同意并簽署參與志愿書。研究實(shí)施過程中嚴(yán)格遵循赫爾辛基宣言。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn)" 納入標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)表現(xiàn)為直徑≤3 cm的局灶性、類圓形、高密度的實(shí)性或亞實(shí)性肺部隱影；②孤立性肺結(jié)節(jié)邊界清楚、密度高，且周圍被含氣肺組織包繞；③多發(fā)性肺結(jié)節(jié)數(shù)量≤10個(gè)，單一肺結(jié)節(jié)伴有一個(gè)或多個(gè)小結(jié)節(jié)；④不伴有肺不張、肺門淋巴結(jié)腫大和或胸腔積液；⑤未患包括肺癌在內(nèi)等癌癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有全身嚴(yán)重疾病，如尿毒癥、風(fēng)濕病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等；②患有高血壓、糖尿病、高尿酸血癥等；③患有家族遺傳病和先天性疾病等；④年齡大于90歲和（或）不能耐受氣管鏡檢查。感染性肺結(jié)節(jié)除滿足肺結(jié)節(jié)患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)之外應(yīng)符合以下條件之一：①CT檢查提示滲出性病變（磨玻璃密度影）、變質(zhì)性病變（囊變、空腔、鈣化等）、增生性病變（條索、斑片、腫塊等）；②HRCT提示結(jié)節(jié)有暈征，結(jié)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)密度低、松散，純磨玻璃或部分磨玻璃樣，肉芽組織形成和增生，帶磨玻璃樣纖維灶[2，3，8]。

1.3樣本收集" 患者入院第2天在局部麻醉后行纖維支氣管鏡（奧林巴斯，BF-P60）肺泡灌洗檢查。灌洗部位遵循“灌洗病變?nèi)~段”原則，優(yōu)先灌洗新發(fā)或浸潤性病變?nèi)~段；雙肺彌漫性病變選擇灌洗右肺中葉或左肺舌段。灌洗時(shí)將37 ℃滅菌生理鹽水30 ml由氣管活檢孔注入，再以-19.95～-13.3 kPa壓力吸出并轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌瓶內(nèi)。灌洗共5次，共收集約90 ml肺泡灌洗液，低溫保存至實(shí)驗(yàn)室。

1.4 DNA提取和mNGS" 灌洗液500×g離心10 min后棄細(xì)胞沉淀，收集上清10 000×g離心10 min后采用1 ml PBS清洗沉淀物后再高速離心。然后使用HostZERO Microbial DNA Kit（ZYMO Research）提取懸浮物中DNA。放置-80 ℃凍存?zhèn)溆?。基于Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)IDsep（微遠(yuǎn)基因，北京）對(duì)呼吸道樣本進(jìn)行病原宏基因組測(cè)序并分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" 采用R軟件（版本4.3.0）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用Student's T檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用Wilcoxon檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率描述，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。Alpha生物多樣性檢測(cè)采用R軟件包vegan和picante進(jìn)行分析?；赗軟件包precrec分析各因素診斷效能。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1患者臨床特征" "兩組性別、年齡、民族、吸煙情況、PCT、G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、結(jié)節(jié)位置和類型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。感染組CRP水平高于非感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2呼吸道微生物比較" 感染組Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于非感染組，而Simpson指數(shù)低于非感染組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。感染組ACE指數(shù)高于非感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。非感染組以G陰性菌和病毒為主要微生物群落，感染組則以G陽性菌為主，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。

2.3呼吸道微生態(tài)分布對(duì)感染性肺結(jié)節(jié)診斷效能" 呼吸道微生物Alpha多樣性指數(shù)對(duì)感染性肺結(jié)節(jié)診斷效能較低。Sobs、Chao1和Simpson指數(shù)的錯(cuò)誤率高于50%，僅ACE和Shannon指數(shù)錯(cuò)誤率低于50%。ACE和Shannon指數(shù)用于診斷感染性肺結(jié)節(jié)的準(zhǔn)確率、特異性、敏感性和精確度均高于其它指數(shù)，大于52%，見表3。

2.4呼吸道微生態(tài)對(duì)感染性肺結(jié)節(jié)診斷價(jià)值" 通過ROC和PRC曲線繪制和分析，Sobs、Chao1、AEC、Shannon和Simpson指數(shù)ROC的AUC分別為0.396、0.394、0.569、0.582和0.449；PRC的AUC分別為0.476、0.474、0.562、0.647和0.511；聯(lián)合檢測(cè)ROC和PRC的AUC為0.482和0.520。AEC和Shannon指數(shù)的ROC和PRC曲線見圖1。

3討論

感染性肺部良性結(jié)節(jié)是臨床常見的肺病[9]。影響因素較為復(fù)雜，主要機(jī)制為肺部炎性滲出物以肺泡孔為中心向周圍擴(kuò)散，肺炎的炎性物質(zhì)由周圍向中央均勻吸收，此外抗生素使用后炎性介質(zhì)逐漸局限并形成結(jié)節(jié)[8，10]。感染性肺結(jié)節(jié)在普通CT上表現(xiàn)與惡性肺結(jié)節(jié)類似，易誤診；HRCT是最重要的影像學(xué)診斷方法[11]。

感染性肺結(jié)節(jié)HRCT表現(xiàn)為結(jié)節(jié)周邊存在暈環(huán)、內(nèi)部疏松呈低密度影、完全或部分磨玻璃樣變化。然而，多發(fā)性和彌漫性肺結(jié)節(jié)診斷較為困難，需結(jié)合影像、臨床檢查和醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)綜合判斷，必要時(shí)需取肺組織行病理檢查后確診。許仙花等[2]報(bào)道了7例感染性肺結(jié)節(jié)患者實(shí)驗(yàn)室檢查正常，無明顯感染癥狀，CT提示惡性或傾向惡性，術(shù)后病理檢查則確證為感染性疾病，包括寄生蟲、曲霉菌、隱球菌和其他真菌感染。本研究發(fā)現(xiàn)感染性肺結(jié)節(jié)患者C反應(yīng)蛋白高于非感染性肺結(jié)節(jié)患者組。PCT是降鈣素的前體物，在炎癥疾病早期發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)細(xì)菌感染和判斷肺炎預(yù)后具有一定臨床價(jià)值；但CRP對(duì)于評(píng)估肺炎嚴(yán)重程度和器官功能障礙等方面更具臨床意義，已作為一項(xiàng)獨(dú)立的生物指標(biāo)用于臨床[12]。其與異常磷酰膽堿結(jié)合激活補(bǔ)體系統(tǒng)和單核細(xì)胞，清除和吞噬死亡細(xì)胞和病原微生物[13]。

呼吸道微生物多樣性對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病具有一定影響[14]。一旦呼吸道微生態(tài)失衡，引起上皮細(xì)胞纖毛擺動(dòng)能力減低、黏液分泌增加、上皮細(xì)胞凋亡或壞死，表現(xiàn)出免疫和炎癥反應(yīng)。肺間質(zhì)纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺炎等患者呼吸道菌群多樣性存在顯著不平衡[15]。Alpha多樣性指數(shù)可反應(yīng)呼吸道生物群落中微生物數(shù)量、豐度和均勻程度。Sobs、Chao1和ACE指數(shù)能夠反應(yīng)呼吸道生物群落豐富程度。與Sobs、Chao1指數(shù)估算菌落豐度不同，ACE可用于估計(jì)呼吸道微生物總數(shù)，并將測(cè)序數(shù)10以下微生物單獨(dú)計(jì)算，進(jìn)而計(jì)算微生物群落中真實(shí)存在微生物數(shù)量，值越大則微生物類型越大[16]。本研究顯示，感染性肺結(jié)節(jié)患者ACE指數(shù)大于非感染性組，提示某一種或幾種微生物處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，存在呼吸道微生態(tài)不平衡。這可能是由于共生菌數(shù)量減低、致病菌大量繁殖導(dǎo)致的。肺炎致病菌以格蘭陽性菌為主，尤其肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌這兩大類常見，與本研究感染性肺結(jié)節(jié)組患者一致；非感染組則革蘭陰性菌和病毒為優(yōu)勢(shì)微生物群落[17，18]。細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing， QS）系統(tǒng)在革蘭陽和陰性菌中普遍存在，致病菌QS信號(hào)通路與生物膜構(gòu)成、毒力因子釋放等致病性密切相關(guān)，可影響非致病菌群[19，20]。

綜上所述，呼吸道微生態(tài)多樣性變化與感染性肺結(jié)節(jié)患者相關(guān)，對(duì)呼吸道微生物豐度、多樣性、均衡性進(jìn)行分析，可用于感染性肺結(jié)節(jié)患者診斷和指導(dǎo)治療，具有一定的臨床運(yùn)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹文軍，薛洪省，湯敏，等.良性肺結(jié)節(jié)的臨床特點(diǎn)及其診斷和治療[J].中華胸部外科電子雜志，2020，7（1）：22-29.

[2]許仙花，陳孟川，翁葉萍，等.感染性肺結(jié)節(jié)影像-病理對(duì)照分析[J].診斷病理學(xué)雜志，2020，27（10）：706-708.

[3]滑炎卿.肺部感染與非感染性病變的CT鑒別診斷[J].上海醫(yī)學(xué)影像，2009，18（4）：347-349.

[4]陳熔，王旭，舒靜，等.特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化急性加重患者呼吸道微生態(tài)成分與不良預(yù)后的關(guān)系[J].疑難病雜志，2022，21（11）：1141-1146.

[5]王輝，葉彩虹，馬煥麗，等.吸煙相關(guān)COPD肺微生態(tài)菌群、Treg/Th17、炎癥在發(fā)病中的作用機(jī)制[J].分子診斷與治療雜志，2021，13（7）：1126-1129，1133.

[6]張鵬，劉升明，劉寶儀，等.膿毒癥肺內(nèi)感染與肺外感染ARDS肺部微生態(tài)的異同[J].廣東醫(yī)學(xué)，2022，43（3）：356-361.

[7]任媛.不同激素條件下云南地區(qū)AECOPD患者呼吸道微生態(tài)研究[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2023.

[8]楊麗，李廷源，李良山，等.CT引導(dǎo)下肺穿刺活檢術(shù)對(duì)老年孤立性肺結(jié)節(jié)的診斷及安全性分析[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（24）：2643-2647.

[9]王璐，洪群英.肺結(jié)節(jié)診治中國專家共識(shí)（2018年版）解讀[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2019，39（5）：440-442.

[10]李冰.感染性肺結(jié)節(jié)的診治[C]//中國生理學(xué)會(huì).2019中國生理學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨張錫鈞基金第十五屆全國青年優(yōu)秀生理學(xué)學(xué)術(shù)論文交流會(huì)及第十三屆全國青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要.同濟(jì)大學(xué)，2019：2.

[11]雷光焰，張艱，閆小龍.肺結(jié)節(jié)診治西北地區(qū)專家共識(shí)（2021年版）[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2021，11（23）：16-22，25.

[12]覃鑫，胡量子.重癥肺炎患者降鈣素原、C反應(yīng)蛋白、D-二聚體的水平變化及其對(duì)預(yù)后的診斷價(jià)值[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020，26（15）：3077-3081.

[13]Guo S，Mao X，Liang M.The moderate predictive value of serial serum CRP and PCT levels for the prognosis of hospitalized community-acquired pneumonia[J].Respiratory Research，2018，19（1）：193-202.

[14]盛美玲，汪群智.慢性阻塞性肺疾病急性加重風(fēng)險(xiǎn)高危與低?；颊吆粑牢⑸鷳B(tài)系統(tǒng)差異分析[J].臨床肺科雜志，2020，25（12）：1787-1790.

[15]Valenzi E，Tabib T，Papazoglou A，et al.Disparate Interferon Signaling and Shared Aberrant Basaloid Cells in Single-Cell Profiling of Idiopathic Pulmonary Fibrosis and Systemic Sclerosis-Associated Interstitial Lung Disease[J].Frontiers in Immunology，2021，12（4）：595811.

[16]溫燕.特發(fā)性間質(zhì)性肺炎患者下呼吸道菌群結(jié)構(gòu)研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2016.

[17]Fernández L，Cima-Cabal MD，Duarte AC，et al.Gram-Positive Pneumonia： Possibilities Offered by Phage Therapy[J].Antibiotics （Basel），2021，10（8）：1000.

[18]Quinton LJ，Walkey AJ，Mizgerd JP.Integrative Physiology of Pneumonia[J].Physiol Rev，2018，98（3）：1417-1464.

[19]Moreno-Gámez S，Hochberg ME，van Doorn GS.Quorum sensing as a mechanism to harness the wisdom of the crowds[J].Nature Communications，2023，14（1）：3415-3434.

[20]Weeks JR，Staples KJ，Spalluto CM，et al.The Role of Non-Typeable Haemophilus influenzae Biofilms in Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J].Front Cell Infect Microbiol，2021，11（8）：720742.

收稿日期：2023-08-04；修回日期：2023-09-14

編輯/肖婷婷