關(guān)鍵詞：硫氧還蛋白；橡膠樹(shù)；基因表達(dá)；酵母表達(dá)；抗氧化性；非生物逆境脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

硫氧還蛋白（thioredoxin， TRX）是生物體內(nèi)廣泛存在的一種高度保守、酸性、熱穩(wěn)定的小分子蛋白質(zhì)[1-3]。硫氧還蛋白含有保守的氧化還原活性位點(diǎn)，其核心序列通常為C （G/P） PC （Cys-Gly/Pro-Pro-Cys），極少數(shù)為C （G/P） PS （Trp-Cys-Gly/Pro-Pro-Ser）[4-5]。硫氧還蛋白與硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase， TR）、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）一起構(gòu)成硫氧還蛋白系統(tǒng)[6-7]。硫氧還蛋白系統(tǒng)是機(jī)體重要的抗氧化系統(tǒng)，在清除活性氧、維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[6-8]。

植物硫氧還蛋白基因家族成員眾多，如水稻（Oryza sativa）基因組中含有30 個(gè)TRX 基因[9]，甜橙（Citrus sinensis）基因組中含有22 個(gè)TRX基因[10]。根據(jù)氨基酸序列差異，植物硫氧還蛋白家族基因被劃分為7 種類(lèi)型：f、h、m、o、x、y和z[1， 11]。大多數(shù)植物僅含有1 個(gè)o 型TRX 基因，如楊樹(shù)和水稻。少數(shù)植物含有2 個(gè)o 型TRX 基因，如擬南芥[5]。擬南芥AtTRXo1 已被證實(shí)定位于線粒體，而AtTRXo2 的亞細(xì)胞定位目前仍不清楚[12]。李宇佳[13] 研究發(fā)現(xiàn)， 在擬南芥中超量表達(dá)AtTRXo1 提高了轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下的發(fā)芽率，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的生長(zhǎng)。同野生型相比，鹽脅迫下擬南芥AtTRXo1 突變體種子發(fā)芽更快[14]，植株葉片失水速率降低，氣孔關(guān)閉增加，還原型抗壞血酸、H2O2、NO 水平以及過(guò)氧化氫酶活性升高[15-16]。此外，AtTRXo1 通過(guò)與ABA 受體PYR1（pyrabactin resistance 1）互作參與ABA 信號(hào)調(diào)控[17]。對(duì)豌豆o 型TRX 基因PsTRXo1 的研究發(fā)現(xiàn)，在煙草BY-2 細(xì)胞中超量表達(dá)PsTRXo1 提高了過(guò)氧化氫酶活性以及自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，降低了H2O2 和NO 含量，維持了谷胱甘肽的氧化還原狀態(tài)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)氧化脅迫的抗性[18-19]。目前，對(duì)o 型TRX 基因的研究還不深入，除AtTRXo1 和PsTRXo1 外，未見(jiàn)有關(guān)其他植物o 型TRX 基因功能研究的報(bào)道。

橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）作為一種重要的熱帶經(jīng)濟(jì)林木，是重要工業(yè)原料天然橡膠的主要來(lái)源。我國(guó)橡膠樹(shù)種植面積約113.33 萬(wàn)hm2，分布在海南、云南和廣東等地區(qū)，年產(chǎn)天然橡膠約80 萬(wàn)t[20]。低溫、干旱和臺(tái)風(fēng)是影響我國(guó)橡膠樹(shù)生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量的3 種主要?dú)庀鬄?zāi)害[21]。此外，我國(guó)橡膠樹(shù)割面干涸（ tapping panel dryness，TPD，國(guó)內(nèi)常稱(chēng)為死皮）發(fā)生率高，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。為了探究o 型TRX 基因在橡膠樹(shù)割面干涸和非生物脅迫應(yīng)答中的作用，本研究克隆橡膠樹(shù)HbTRXo2 基因，分析其表達(dá)特性，并利用酵母表達(dá)系統(tǒng)鑒定該基因在非生物脅迫（氧化、低溫和干旱）抗性中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用橡膠樹(shù)品種為熱研7-33-97。樹(shù)皮、膠乳、成熟葉、衰老葉、新梢、雌花和雄花等組織樣品采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)六隊(duì)種植的熱研7-33-97 健康植株（樹(shù)齡16 年）。同時(shí)，在相同樹(shù)位，選擇割線70%左右不排膠的割面干涸橡膠樹(shù)，采集膠乳和樹(shù)皮樣品。根組織樣品采自熱研7-33-97 組培苗。樣品采集后液氮速凍，–80 ℃保存，用于總RNA 提取。取移栽培養(yǎng)8 個(gè)月的健康熱研7-33-97 組培苗用于各種非生物脅迫處理。

1.2 方法

1.2.1 非生物脅迫處理 低溫（4 ℃）、聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)的干旱脅迫、甲基紫精（MV）和過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的氧化脅迫處理參照李雙江等[22]的方法。PEG 采用的是PEG6000，處理濃度為30%。MV 和H2O2 處理濃度分別為200 μmol/L、20 mmol/L。均在處理0、3、6、12、24、48 h 時(shí)，采集葉片樣品。每個(gè)處理3 次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)3 株植株。樣品采集后置于液氮速凍，–80 ℃保存，用于總RNA 提取。

1.2.2 總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 采用植物通用提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取樹(shù)皮、新梢、雄花、雌花、成熟葉、衰老葉和根的總RNA，采用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取膠乳總RNA 。RNA 經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)后， 采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time）（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。具體操作方法參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 HbTRXo2 基因的克隆 將擬南芥AtTRXo1基因序列（NM_129053.6）在橡膠樹(shù)HeveaDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//hevea.catas.cn/home/index）中進(jìn)行比對(duì)，獲得橡膠樹(shù)的同源基因scaffold0032_ 237207，將其命名為HbTRXo2。根據(jù)scaffold0032_ 237207序列， 利用Primer3web （ https：//bioinfo.ut.ee/primer3/）在線軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整編碼區(qū)的引物，并在正、反向引物5'端分別加上Kpn I、Xba I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，以便于后續(xù)構(gòu)建酵母表達(dá)載體。正向引物序列：5'-TAGGTACCGGTACGACCGAAACTGCATC-3'，反向引物序列：5'-GCTCTAGATTAGTCCTTCCCATAGAGTTCTTC-3' 。PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，反應(yīng)體系：2.5 U/μL TransStartFastPfu DNA Polymerase 1 μL 、5 × TransStartFastPfu Buffer 10 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、10 μmol/L 正/反向引物各1.5 μL、膠乳cDNA3 μL、ddH2O 29 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，并采用Gel Extraction Kit（OMEGA）回收純化目標(biāo)片段。純化片段連接到pEASY-Blunt Simple CloningVector（北京全式金生物技術(shù)有限公司），轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單克隆送至海南楠山生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 生物學(xué)信息分析 使用SoftBerry（http：//linux1.softberry.com/）在線數(shù)據(jù)庫(kù)中的FGENESH工具預(yù)測(cè)基因編碼區(qū)及其編碼的氨基酸序列；使用Compute pI/Mw（https：//web.expasy.org/compute_pi/）在線軟件分析蛋白的分子量和等電點(diǎn)；使用CDD （ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件預(yù)測(cè)HbTRXo2 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；從NCBI 數(shù)據(jù)下載其他植物的硫氧還蛋白序列，使用MEGA-X 軟件中的鄰接法（neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap 參數(shù)設(shè)置為1000[23]。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析 利用在線工具Primer3web 設(shè)計(jì)HbTRXo2 的qRTPCR特異引物，正向引物序列：5'-GCAGATGTTGGACGCTTGAA-3'，反向引物序列：5'-ACCCACTGTCATTCCATCACT-3'） 。內(nèi)參基因使用HbUBC4（正向引物序列：5'-TCACCCTGAACCTGATAGCC-3'，反向引物序列：5'-TTTCTTTGGTGACGCTGCAA-3'）[24]。qRT-PCR 試劑采用TBGreen Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑說(shuō)明書(shū)， 檢測(cè)采用CFX96 型熒光定量PCR 儀（Bio-Rad）。基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT 法[25]。采用WPS office軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與制圖，使用SAS 8.1 軟件分析差異顯著性（Plt;0.05）。

1.2.6 轉(zhuǎn) HbTRXo2 基因酵母 使用Plasmid MiniKit I（OMEGA）提取上述測(cè)序正確單克隆和酵母表達(dá)載體pYES2 的質(zhì)粒，進(jìn)行Kpn I 和Xba I 雙酶切。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，采用Gel Extraction Kit（OMEGA）回收純化目標(biāo)片段。使用T₄ DNA 連接酶（Thermo Scientific）將回收的HbTRXo2 基因與pYES2 載體連接，獲得重組載體pYES2-HbTRXo2。采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，并涂于含氨芐青霉素100 mg/L 的LB 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。選取單克隆進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，引物采用pYES2載體正向引物（5'-CCCGGATCGGACTACTAGC-3'）和擴(kuò)增HbTRXo2 基因的反向引物。使用Plasmid Mini Kit I（OMEGA）提取PCP 檢測(cè)正確單克隆的質(zhì)粒， 參照pYES2 載體說(shuō)明書(shū)（Invitrogen）制備釀酒酵母菌株INVSc1 感受態(tài)細(xì)胞。采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pYES2-HbTRXo2 和pYES2 載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，并涂于SC-Ura 固體選擇培養(yǎng)基[DO Supplement-Ura（Clontech）0.78 g/L、無(wú)氨基酵母氮源6.7 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L]上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d。選取3 個(gè)單克隆搖菌，采用酵母質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA）提取質(zhì)粒。采用pYES2 載體正向引物加HbTRXo2 基因反向引物或pYES2 載體反向引物（5'-ATTAAAGCCTTCGAGCGTCC-3'）進(jìn)行PCR 檢測(cè)， 獲得重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）。

1.2.7 重組酵母中 HbTRXo2 的表達(dá)檢測(cè) 將獲得的重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）劃線于SC-Ura 固體選擇培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)2 d。挑單克隆接種于2 mL SC-Ura 液體選擇培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)量其OD600 值。取一定量的培養(yǎng)液，離心收集菌體，然后用SC-Ura 液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基[DO Supplement-Ura（Clontech）0.78 g/L、無(wú)氨基酵母氮源6.7 g/L、半乳糖20 g/L]重懸菌體，并調(diào)整OD600=0.2。取10 mL，30 ℃，200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。參照酵母總RNA 快速提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取重組酵母和對(duì)照酵母總RNA。使用PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以釀酒酵母Actin基因（正向引物序列：5′-AGTTGCCCCAGAAGAACACC-3′；反向引物序列：5′-TACCGGCAGATTCCAAACCC-3′）作為內(nèi)參基因確定每個(gè)模板cDNA的加入量，再使用HbTRXo2 基因引物對(duì)模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為：EasyTaq DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司）0.5 μL、Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、正/反向引物各0.5 μL、cDNA 模板1～3 μL，補(bǔ)ddH₂O 至總體積25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.8 非生物脅迫處理 取重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）劃線培養(yǎng)的單克隆，參照上述1.2.7 中的方法先選擇培養(yǎng)24 h 再誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。取一定量的培養(yǎng)液，離心收集菌體，然后用無(wú)菌水重懸菌體，并調(diào)整OD₆₀₀=2.0。氧化脅迫處理組：取調(diào)整好的菌液0.5 mL，加入20 mmol/L 或30 mmol/L 的H₂O₂ 溶液0.5 mL 混勻；干旱脅迫處理組：取菌液0.5 mL，4000 r/min 離心2 min，去上清液0.25 mL 后加入40%的PEG6000 溶液0.75 mL 混勻；將以上各處理組置于30 ℃、160 r/min 搖床中處理。低溫處理組：取菌液0.5 mL，加入0.5 mL 無(wú)菌水，混勻后置于–20 ℃冰箱中。每12 h 取出解凍后再放入–20 ℃冰箱中處理。氧化脅迫處理0（對(duì)照）和1 d，干旱和低溫處理0（對(duì)照）、5、7 d，用無(wú)菌水將處理后的菌液進(jìn)行5 倍的梯度稀釋。取不同稀釋倍數(shù)的菌液各5 μL 分別點(diǎn)樣在SC-Ura 固體選擇培養(yǎng)基上，每處理3 次重復(fù)。30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察比較菌落的生長(zhǎng)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbTRXo2基因的克隆與序列分析

采用RT-PCR 從橡膠樹(shù)膠乳中克隆了HbTRXo2 基因，測(cè)序結(jié)果顯示，克隆片段的大小為683 bp?；蝾A(yù)測(cè)表明，HbTRXo2 基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為594 bp，編碼197 個(gè)氨基酸。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明，HbTRXo2 蛋白的分子量為21.90 kDa，理論等電點(diǎn)為7.59。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示（圖1），HbTRXo2 蛋白含有TRX 保守結(jié)構(gòu)域（pfam00085），位于第88～192 位氨基酸，其氧化還原活性位點(diǎn)核心序列為CGPC，位于第119～122 位氨基酸，表明該蛋白屬于硫氧還蛋白家族的成員。

2.2 HbTRXo2 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載不同類(lèi)型的植物硫氧還蛋白，與HbTRXo2 蛋白一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2 所示。這些硫氧還蛋白可分為7 類(lèi)：m、f、h、o、x、y 和z。HbTRXo2 與其他植物o型硫氧還蛋白聚在一類(lèi)，故其屬于o 型硫氧還蛋白。o 型硫氧還蛋白又分為2 個(gè)亞組：Ⅰ和Ⅱ。亞組Ⅰ為單子葉植物的o 型硫氧還蛋白，包括水稻OsTRXo1、玉米ZmTRXo1 和小麥TaTRXo；亞組Ⅱ?yàn)殡p子葉植物的o 型硫氧還蛋白，包括橡膠樹(shù)HbTRXo2、木薯MeTRXo2、麻風(fēng)樹(shù)JcTRXo1、蓖麻RcTRXo2、擬南芥AtTRXo1 和AtTRXo2、葡萄VvTRXo1 和VvTRXo2。HbTRXo2 與木薯MeTRXo2 近緣關(guān)系最近，氨基酸序列一致性為83%，其次是麻風(fēng)樹(shù)JcTRXo1 和蓖麻RcTRXo2，氨基酸序列一致性分別為70%和65%。

2.3 HbTRXo2 基因的組織表達(dá)特性

采用qRT-PCR 檢測(cè)HbTRXo2 基因在橡膠樹(shù)各組織中的表達(dá)特性，結(jié)果如圖3 所示。HbTRXo2基因在橡膠樹(shù)根、樹(shù)皮、膠乳、成熟葉、衰老葉、新梢、雌花和雄花中均表達(dá)，但表達(dá)量存在顯著差異。膠乳中HbTRXo2 基因的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織；成熟葉與樹(shù)皮中的表達(dá)量次之，約為膠乳中表達(dá)量的1/3；新梢中的表達(dá)量最低，不足膠乳的1/10。同健康橡膠樹(shù)相比，割面干涸橡膠樹(shù)樹(shù)皮和膠乳中HbTRXo2 基因的表達(dá)顯著降低（圖4）。

2.4 HbTRXo2 的表達(dá)受非生物逆境脅迫誘導(dǎo)

采用qRT-PCR 檢測(cè)HbTRXo2 基因在低溫、干旱以及氧化脅迫下的表達(dá)變化，結(jié)果如圖5 所示。低溫脅迫處理顯著上調(diào)了HbTRXo2 基因的表達(dá)，在處理3、12、24、48 h 時(shí)，HbTRXo2 的表達(dá)約為處理前的1.6 倍。PEG 誘導(dǎo)的干旱脅迫處理也上調(diào)了HbTRXo2 基因的表達(dá)，在處理3、6、24、48 h 時(shí)，HbTRXo2 的表達(dá)顯著高于處理前。其中，處理48 h 時(shí)HbTRXo2 的表達(dá)量最高，為處理前的4.4 倍。在H₂O₂ 和MV 誘導(dǎo)的氧化脅迫下，HbTRXo2 基因的表達(dá)變化趨勢(shì)相似，均呈先升高后下降趨勢(shì)。在處理6 h 時(shí)，表達(dá)量升高至最大值，此后逐漸下降，在處理48 h 時(shí)，基本下降至正常水平。以上結(jié)果表明，HbTRXo2 基因的表達(dá)受低溫、干旱和氧化脅迫的誘導(dǎo)。

2.5 HbTRXo2 基因在抗逆中的功能鑒定

2.5.1 轉(zhuǎn)HbTRXo2 基因酵母的分子檢測(cè) 通過(guò)酶切連接的方法構(gòu)建HbTRXo2 基因的酵母表達(dá)載體pYES2-HbTRXo2。采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將空載體pYES2 和pYES2-HbTRXo2 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株INVSc1 。挑取對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）和重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）單克隆各3 個(gè)，抽提質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR 檢測(cè)，3個(gè)轉(zhuǎn)空載體pYES2 的對(duì)照酵母質(zhì)粒DNA 擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照（pYES2質(zhì)粒DNA）大小一致的條帶，且符合預(yù)期長(zhǎng)度（圖6A），3 個(gè)轉(zhuǎn)pYES2-HbTRXo2的重組酵母質(zhì)粒DNA 擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照（pYES2-HbTRXo2 質(zhì)粒DNA）大小一致的條帶，且符合預(yù)期長(zhǎng)度（圖6B）。以上結(jié)果表明，空載體pYES2 和pYES2-HbTRXo2 成功轉(zhuǎn)入對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）和重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）。

為明確HbTRXo2 基因是否在重組酵母中表達(dá)，采用半定量RT-PCR 檢測(cè)HbTRXo2 基因在重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）中的表達(dá)情況。如圖7 所示，經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)24 h 后， 重組酵母INVSc1（ pYES2-HbTRXo2 ） 中可檢測(cè)到外源基因HbTRXo2 的表達(dá)，而對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）中檢測(cè)不到外源基因HbTRXo2 的表達(dá)，這表明HbTRXo2 基因轉(zhuǎn)入酵母并成功表達(dá)。

2.5.2 表達(dá)HbTRXo2 提高了重組酵母的抗氧化性為明確HbTRXo2 基因在氧化脅迫應(yīng)答中的作用，比較了重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）在0、10、20 mmol/L H₂O₂處理20 h 后的存活差異，結(jié)果如圖8所示。對(duì)照組（無(wú)H₂O₂ 處理，CK）中，各梯度稀釋濃度下重組酵母和對(duì)照酵母生長(zhǎng)狀況基本一致，菌斑數(shù)無(wú)明顯差異，表明酵母中表達(dá)HbTRXo2 基因?qū)ζ湔ＩL(zhǎng)無(wú)明顯影響。同對(duì)照組相比，H₂O₂ 處理組中酵母菌斑數(shù)明顯減少，表明H₂O₂ 處理導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡。10、20 mmol/L H₂O₂ 處理組中，各梯度稀釋下重組酵母的菌斑數(shù)顯著多于對(duì)照酵母，這表明轉(zhuǎn)HbTRXo2 基因酵母在H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化脅迫下的死亡率降低，表達(dá)HbTRXo2 提高了重組酵母對(duì)氧化脅迫的抗性。

2.5.3 表達(dá)HbTRXo2 提高了重組酵母的抗旱性比較重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）在PEG 誘導(dǎo)的干旱脅迫處理后的存活差異，結(jié)果如圖9 所示。對(duì)照組中，各梯度稀釋濃度下重組酵母與對(duì)照酵母的生長(zhǎng)狀況基本一致，無(wú)明顯差異。30% PEG 處理誘導(dǎo)了酵母細(xì)胞死亡，但在處理5d 和7d中，重組酵母在5^-2、5^-3、5^-4稀釋下的菌斑數(shù)明顯多于對(duì)照酵母。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)HbTRXo2 基因酵母在PEG 誘導(dǎo)的干旱脅迫下的死亡率降低， 表達(dá)HbTRXo2 提高了重組酵母對(duì)干旱脅迫的抗性。

2.5.4 表達(dá)HbTRXo2 降低了重組酵母的抗寒性比較重組酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和對(duì)照酵母INVSc1（pYES2）在低溫脅迫處理后的存活差異，結(jié)果如圖10 所示。對(duì)照組中，各梯度稀釋濃度下重組酵母與對(duì)照酵母的生長(zhǎng)狀況基本一致，無(wú)明顯差異。–20 ℃處理5d，重組酵母在5^–1、5^–2、5^–3 稀釋下的菌斑數(shù)明顯少于對(duì)照酵母。處理7 d 時(shí)，在無(wú)稀釋條件下，重組酵母的菌斑數(shù)量明顯少于對(duì)照酵母；在濃度為5^–1 時(shí)，對(duì)照酵母仍有少量菌斑生長(zhǎng)，而重組酵母無(wú)菌斑生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)HbTRXo2 基因酵母在低溫脅迫下的死亡率增加，表達(dá)HbTRXo2降低了重組酵母的抗寒性。

3討論

硫氧還蛋白是植物體內(nèi)一類(lèi)重要的氧化還原調(diào)控蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物與非生物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1， 8， 11， 26]。植物硫氧還蛋白被分為f、h、m、o、x、y 和z 等7 種類(lèi)型[1， 11]，廣泛分布于幾乎所有的亞細(xì)胞區(qū)室中。其中，o型硫氧還蛋白主要存在于線粒體和細(xì)胞核中，f、m、x、y 和z 型硫氧還蛋白主要分布于葉綠體中，而h 型硫氧還蛋白廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等中[11， 26-27]。目前，對(duì)于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體硫氧還蛋白系統(tǒng)的研究較為深入，但對(duì)于線粒體硫氧還蛋白系統(tǒng)的研究較少[16， 27-28]。o型硫氧還蛋白作為最主要的線粒體硫氧還蛋白，對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于增強(qiáng)對(duì)線粒體硫氧還蛋白系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。本研究從橡膠樹(shù)中克隆的HbTRXo2 基因編碼的蛋白含有TRX 保守結(jié)構(gòu)域（pfam00085），其氧化還原活性位點(diǎn)核心序列為CGPC，與其他植物o 型硫氧還蛋白聚在一類(lèi)，說(shuō)明其屬于o 型硫氧還蛋白。

ORTIZ-ESPíN 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥o 型硫氧還蛋白基因AtTRXo1 在根、莖、葉、花以及不同發(fā)育階段的角果中均有表達(dá)，但不同組織中的表達(dá)存在一定差異。為了解HbTRXo2 基因的組織表達(dá)特性，本研究檢測(cè)了該基因在橡膠樹(shù)根、樹(shù)皮、膠乳、成熟葉、衰老葉、新梢、雌花和雄花等組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HbTRXo2 在各組織中均表達(dá)，但不同組織間存在明顯差異。HbTRXo2 在膠乳中的表達(dá)量顯著高于其他組織，且在產(chǎn)量顯著降低的割面干涸植株膠乳中的表達(dá)顯著降低，這與本課題組前期克隆的橡膠樹(shù)h 型硫氧還蛋白基因HbCXXS1 的表達(dá)相似[29] ， HbTRXo2 和HbCXXS1 等硫氧還蛋白基因可能在維持橡膠樹(shù)乳管系統(tǒng)的氧化還原穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。楊洪等[30]通過(guò)比較健康樹(shù)和不同程度割面干涸橡膠樹(shù)樹(shù)皮線粒體超微結(jié)構(gòu)及活性氧代謝相關(guān)基因表達(dá)差異認(rèn)為，線粒體等細(xì)胞器氧化損傷是橡膠樹(shù)割面干涸發(fā)生的關(guān)鍵過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，HbTRXo2 在割面干涸橡膠樹(shù)中的表達(dá)顯著降低，而酵母中超量表達(dá)HbTRXo2 能提高對(duì)氧化脅迫的抗性。據(jù)此，推測(cè)HbTRXo2 基因表達(dá)的降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，活性氧過(guò)量積累損傷線粒體，進(jìn)而導(dǎo)致橡膠樹(shù)割面干涸的發(fā)生。HbTRXo2 基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化性在橡膠樹(shù)割面干涸發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，增強(qiáng)HbTRXo2基因的表達(dá)或許能降低橡膠樹(shù)割面干涸的發(fā)生。

硫氧還蛋白在植物抵御非生物逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[1， 26]。荊曉姝等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在煙草中超量表達(dá)秋茄（Kandelia candel）f型硫氧還蛋白基因KcTrxf能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的抗性。對(duì)中國(guó)野生葡萄—燕山葡萄（Vitisyeshanesis Yanshan）y型硫氧還蛋白基因VyTRXy的研究表明，在本氏煙草（Nicotiana benthamiana）中超量表達(dá)VyTRXy 可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性[32] 。對(duì)擬南芥和豌豆o 型氧還蛋白基因AtTRXo1 和PsTRXo1 的研究證實(shí)，o型氧還蛋白基因也參與了非生物逆境脅迫應(yīng)答[13-14， 18-19]。擬南芥中超量表達(dá)AtTRXo1 能提高抗鹽性[13]，而在煙草BY-2細(xì)胞中超量表達(dá)PsTRXo1 能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抗氧化性[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫、干旱和氧化脅迫下橡膠樹(shù)HbTRXo2 基因的表達(dá)顯著上調(diào)，表明該基因參與非生物逆境脅迫應(yīng)答。為鑒定該基因在非生物逆境脅迫中的功能，本研究構(gòu)建HbTRXo2 基因的酵母表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入了釀酒酵母。對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母進(jìn)行H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化脅迫、PEG 誘導(dǎo)的干旱脅迫和低溫脅迫處理發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)HbTRXo2 基因提高了重組酵母對(duì)氧化和干旱脅迫的抗性，但卻降低了對(duì)低溫的抗性。據(jù)此推測(cè)，HbTRXo2 基因可用于橡膠樹(shù)非生物逆境脅迫抗性遺傳改良，通過(guò)基因工程手段在橡膠樹(shù)中超量表達(dá)該基因可能提高植株的抗旱性，而敲除或抑制該基因的表達(dá)可能提高植株的抗寒性，后續(xù)還需在橡膠樹(shù)體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證該推測(cè)是否正確。由于HbTRXo2 基因在干旱和低溫應(yīng)答中的功能截然不同，這可能會(huì)制約該基因的利用。因?yàn)樵诟纳埔环N抗性的同時(shí)可能會(huì)對(duì)另一種抗性產(chǎn)生不利影響。造成HbTRXo2基因在干旱和低溫應(yīng)答中的功能差異以及如何合理利用該基因用于橡膠樹(shù)非生物逆境脅迫改良仍需進(jìn)一步深入研究。