摘要：附著在河床泥沙表層的生物膜中含有的大量微生物，在河道有機(jī)物分解及碳氮循環(huán)等過程中扮演著重要角色，然而，不同粒徑河床泥沙表層生物膜中細(xì)菌群落的組成差異尚不明確。基于在石亭江河道實(shí)測的4組不同粒徑泥沙表層生物膜樣品，

通過理化因子測定與高通量測序，

對不同粒徑泥沙表層生物膜中的細(xì)菌群落組成進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：粒徑lt;2 mm與gt;2 mm的泥沙表層生物膜細(xì)菌的群落組成有明顯區(qū)別，門水平與屬水平下的物種豐度存在顯著差異;最細(xì)泥沙（lt;2 mm）表層生物膜細(xì)菌具有最高的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)，即多樣性最高;堰上游泥沙生物膜細(xì)菌的多樣性也要高于堰下游，這可能是由于堰下游河床的沖刷不利于附石細(xì)菌的生長。ANOSIM統(tǒng)計檢驗(yàn)顯示，相比泥沙粒徑，空間位置對石亭江附著生物膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響更大。研究成果可為山區(qū)河流生態(tài)修復(fù)提供參考。

關(guān) 鍵 詞：附著生物膜； 細(xì)菌群落； 泥沙粒徑； 多樣性； 河流生態(tài)； 石亭江

中圖法分類號： TV145.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

DOI：10.16232/j.cnki.1001-4179.2024.11.003

0 引 言

生物膜是細(xì)菌、藻類、原生動物、真菌和小型底棲動物的復(fù)雜聚集體，通過水動力和自身作用初步附著并生長在巖石、沉積物、垃圾和木材等有機(jī)和無機(jī)物表面上，再通過分泌胞外聚合物（即代謝產(chǎn)物）

進(jìn)一步加強(qiáng)對基底的附著作用。生物膜在溪流、河床、湖泊沉積物和地下水含水層等不同環(huán)境中進(jìn)行著無數(shù)生物地球化學(xué)循環(huán)過程。在溪流中，生物膜是酶活動的關(guān)鍵場所，包括有機(jī)物循環(huán)、生態(tài)系統(tǒng)呼吸和初級生產(chǎn)，因此構(gòu)成了食物網(wǎng)的基礎(chǔ)^［1］。在環(huán)境工程中，生物膜與泥沙顆粒的結(jié)合有著廣泛的應(yīng)用，使用有生物膜的顆粒流可以更有效地處理流化床中的廢水^［2］。

隨著環(huán)境和生態(tài)問題的提出，人們越來越關(guān)注河流湖泊生物膜對整個水環(huán)境、水生態(tài)的影響。近年來，已有不少學(xué)者進(jìn)行了生物膜對于泥沙基本特性（密度、形貌、流變特性等）及河床阻力的影響的相關(guān)研究。例如，趙慧明^［1］通過激光共聚焦顯微鏡分析長膜泥沙中膜和沙的占比，提出生物膜泥沙密度在1 100～1 500 kg/m3范圍內(nèi)。方紅衛(wèi)等^［3］采用環(huán)掃電鏡觀察生物膜泥沙形貌，認(rèn)為長膜后泥沙表面形貌起伏減少。尚倩倩^［4］和方紅衛(wèi)^［5］等通過水槽試驗(yàn)研究了長膜沙的起動條件，發(fā)現(xiàn)長膜沙的起動更加困難。

附石生物膜中的河流底棲細(xì)菌（sedimentary bacteria）受到水沙運(yùn)動與河道演變的影響，因此，關(guān)于河流微生物的研究跨越了微生物生態(tài)學(xué)與水沙運(yùn)動及河道演變相關(guān)科學(xué)。然而，人類當(dāng)前對于微生物的了解仍然非常有限，95%以上的細(xì)菌目前還無法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，對河流微生物的演變研究還處于初期探索階段，對河流微生物的多樣性、地理分布及其群落構(gòu)建機(jī)制的認(rèn)識有待提高^［6-7］。泥沙粒徑對生物膜也會產(chǎn)生影響，細(xì)沉積物更容易移動，相比礫石或卵石更不穩(wěn)定^［8-9］。因此，巖石比沙子攜帶更多的生物膜生物量^［10］，初級生產(chǎn)量也更高^［11］。另一方面，沙上的生物膜似乎具有更強(qiáng)的降解多糖和有機(jī)磷化合物的能力^［12-13］。此外，堰等跨河建筑物對河流附石微生物的影響尚不明確。

本文以四川石亭江河道為例，基于野外測量與取樣，采用高通量測序方法，分析不同粒徑河床泥沙表面附石生物膜細(xì)菌的群落組成與多樣性差異，研究泥沙粒徑對附石生物膜細(xì)菌的影響，同時，探討跨河建筑物——堰的上、下游附石生物膜細(xì)菌群落組成差異，為山區(qū)河流生態(tài)修復(fù)提供參考。

1 研究區(qū)域與方法

1.1 研究區(qū)域

石亭江發(fā)源于龍門山，流向成都平原，屬沱江一級支流，長江二級支流，全長約120 km，流域面積約1 500 km^2［14］。該地區(qū)屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年降雨量為850～1 700 mm，平均流量為20 m3/s，汛期石亭江流量可增加近100倍。2008年汶川8.0級地震導(dǎo)致石亭江泥沙濃度增加，龍門山上游發(fā)生了沉積，而下游則遭受了嚴(yán)重的河床沖刷和下切^［15］。

本研究河段位于高景關(guān)水文站（圖1中A1站上游）至石亭江下游與射水河匯合處之間，河道總長約30 km（圖1）。除5座橋梁外，該河段從上游向下游還有3座堰（W1、W2和W3），高度分別約2，25，20 m。其中，W2和W3為紅巖支渠堰和人民渠堰，堰上游泥沙基本接近頂部，堰下游則沖刷嚴(yán)重，形成了陡峭的河流階地。汛期是泥沙運(yùn)動的主要時期，大部分泥沙和幾乎所有的水流都可以被輸送至下游。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集

2022年7月3～9日，在石亭江干流沿岸的18個地點(diǎn)（圖1）采集了水樣和附著生物膜。此外，還在一些支流或匯入干流的人工水渠采集了水樣。4組上下游取樣點(diǎn)分別相距1.7 km（A1和A3）、0.5 km（A3和B1）、1.3 km（C4和D0，D0為新增對比采樣點(diǎn)）和2 km（D2和E1）。

本研究在各采樣點(diǎn)采集床沙表面生物膜，并根據(jù)泥沙粒徑將基底泥沙分成4組，如表1所列。A組泥沙使用滴頭吸管吸取與其他組別刮取的生物膜樣本總重量相等的生物膜樣本，并將其放入A組的無菌聚乙烯試管中封存。對于B、C、D 3組，在各采樣點(diǎn)將B、C、D組泥沙分別使用無菌刮刀在每個泥沙顆粒表面刮取相同面積的生物膜樣本，且3組生物膜樣本總重量相等；最后，將生物膜樣本放入對應(yīng)組別的無菌聚乙烯試管中封存，冷藏并遮光運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，再保存于-80 ℃的冰柜中。

1.2.2 理化因子測定

pH值、水溫（T）、溶解氧（DO）、鹽度（Salinity）、電導(dǎo)率（EC）和溶解性總固體（TDS）采用多功能檢測儀（衡欣）現(xiàn)場測量。濁度（Turb）使用便攜式濁度計（HACH）進(jìn)行現(xiàn)場測量。流速（V）和水深（H）則分別使用電磁流量計和鋼尺進(jìn)行現(xiàn)場測量。從每個采樣點(diǎn)采集3份水樣，裝入500 mL無菌聚乙烯瓶中，儲存在冰箱中，然后送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行理化分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對化學(xué)需氧量（COD）、氨氮（NH3-N）、亞硝酸鹽（NO2-N）、硝酸鹽（NO3-N）、總氮（TN）和總磷（TP）進(jìn)行分析。使用TOC分析儀測定總碳（TC）、總有機(jī)碳（TOC）和總無機(jī)碳（TIC）的含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并取平均值作為結(jié)果。

1.2.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測序

按照FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals）說明書從0.5 g樣本中提取基因組DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的濃度和純度。使用引物338F（5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）在 ABI GeneAmp 9700 PCR 熱循環(huán)儀（ABI）上擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)域。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上游引物（5 uM） 0.8 μL，下游引物（5 uM）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個樣本重復(fù)3次。按照制造商的說明，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后使用QuantusTM熒光儀（Promega）進(jìn)行定量測定。純化的擴(kuò)增子以等摩爾量匯集，并按照Majorbio Bio-Pharm Technology Co.，Ltd.的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議在Illumina MiSeq PE300平臺（Illumina）上進(jìn)行成對測序。

原始16S rRNA基因的正反序列由 FLASH（v1.2.7）生成。使用UPARSE（v7.1）將標(biāo)簽聚類為相似度為97%的操作分類單元（OTU），并識別和刪除嵌合序列。使用RDP Classifier（v2.2）將每個OTU的代表序列與置信度為70%的16S rRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，確定每個序列的分類。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

Good′s覆蓋率指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)被用來計算細(xì)菌群落的覆蓋率、豐富度和多樣性。這些變量使用MOTHUR 1.15.0軟件包計算。利用R語言vegan包，得出門水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)柱形堆積圖。使用Bray-Curtis距離進(jìn)行非計量多維尺度分析（NMDS），以對比不同樣本中含有相似或不相似細(xì)菌的程度（Beta多樣性）。

2 結(jié)果與分析

2.1 附著生物膜細(xì)菌群落與環(huán)境理化因子相關(guān)性分析

采用CCA分析法對樣品生物膜細(xì)菌群落與H、pH、DO等多種環(huán)境理化因子的相關(guān)性進(jìn)行分析，如圖2所示。圖中箭頭的長短代表二者相關(guān)性的強(qiáng)弱，由此可知樣品生物膜細(xì)菌群落與DO、Salinity相關(guān)性最強(qiáng)，而與H、pH、V、TIC相關(guān)性則較弱。由箭頭指向可知H、pH、V、TIC與其他環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)性，而T、TP、TOC、NO2-N、NH3-N以及Salinity與其他環(huán)境因子之間相互呈正相關(guān)性。

2.2 附著生物膜細(xì)菌群落多樣性分析

在對生物膜樣本進(jìn)行高通量測序后，一共得到了8 408個OTUs，如圖3所示。不同粒徑組的附著生物膜OTUs在數(shù)量上具有顯著差異。其中，A、B、C、D分別含有6 532，5 424，5 649，5 722個OTUs，4組樣本共有的OTUs有3 548個，A組有816個特有的OTUs，明顯高于其他3個粒徑組特有的OTUs數(shù)量。Coverage指數(shù)反映微生物群落的覆蓋度，所有樣本的Coverage指數(shù)均達(dá)到96%以上，說明測序結(jié)果能有效反映附著生物膜細(xì)菌生物信息。Shannon指數(shù)反映微生物群落的多樣性，值越大代表群落多樣性越高。Chao指數(shù)反映微生物群落的豐富度，值越大代表群落豐度越高。4組中堰上游樣本的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)大于下游。其中，Shannon指數(shù)差異顯著（plt;0.05），Chao指數(shù)差異不顯著（p=0.068）。對4個粒徑組的附著生物膜Alpha多樣性進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，A組生物膜的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)最大，并且A組與D組生物膜的Shannon指數(shù)存在顯著差異（plt;0.05）。

2.3 附著生物膜細(xì)菌群落特征

在門水平下，對相對豐度排名前10的物種進(jìn)行分析。石亭江附著生物膜細(xì)菌在門水平上較為豐富，樣本細(xì)菌群落主要由變形菌門（Proteobacteria，79.11%～10.61%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria，87.91%～4.37%）、厚壁菌門（Firmicutes，16.00%～0.05%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，11.75%～0.05%）、放線菌門（Actinobacteria，5.32%～0.64%）、擬桿菌門（Bacteroidota，9.31%～0.29%）、綠彎菌門（Chloroflexi，9.99%～0.02%）、酸桿菌門（Acidobacteriota，5.47%～0.01%）、Patescibacteria（1.45%～0.01%）、產(chǎn)水菌門（Bdellovibrionota，4.16%～0.03%）構(gòu)成。如圖5所示，相對豐度前三的菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）。A組與其余3個粒徑組之間的差異較大，而B、C、D三組之間的差異較小。A組生物膜樣本中藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）的相對豐度明顯低于其余3個組，而放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Patescibacteria、產(chǎn)水菌門（Bdellovibrionota）的相對豐度明顯高于其余3個組。

在屬水平下，將排名前25的物種，根據(jù)其在每個樣本中的豐度信息，對組內(nèi)樣本相對豐度求均值，從物種和樣本兩個層面進(jìn)行聚類，繪制為屬水平分類下的物種豐度聚類熱圖。結(jié)果如圖6所示，不同分組聚集情況具有顯著差異。其中，A組細(xì)菌群落在屬水平與B、C、D顯著不同，而C組與D組之間相似性最高。A組樣本中Tychonema_CCAP_1459-11B（A：2.05%，B：8.01%，C：14.08%，D：16.65%），Phreatobacter（A：0.90%，B：1.45%，C：1.74%，D：1.30%）的相對豐度顯著低于其余三組，而Luteolibacter（A：2.29%，B：0.67%，C：0.79%，D：0.98%），Arenimonas（A：1.52%，B：0.63%，C：0.93%，D：0.94%）、CL500-29_marine_group（A：1.36%，B：0.78%，C：0.90%，D：0.85%）在A組中的相對豐度顯著高于其余3組。

2.4 附著生物膜樣本Beta多樣性分析

在OTU分類水平下，對分組樣本進(jìn)行基于Bray_Curtis距離的非度量多維尺度分析（NMDS）及差異性ANOSIM檢驗(yàn)，分析各組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。兩樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成越相似，從而可以看出石亭江附著生物膜樣本細(xì)菌群落之間的相似性。ANOSIM統(tǒng)計檢驗(yàn)顯示，石亭江附著生物膜樣本細(xì)菌群落在不同的取樣點(diǎn)之間具有明顯分離（stress=0.148lt;0.2，p=0.001，R=0.575 4），但在不同的粒徑分組中分離不明顯（stress=0.148lt;0.2，p=0.089，R=0.025 5）。圖7為A組樣本分別與B、C、D 3組樣本之間細(xì)菌群落組成的差異，結(jié)果表明，A組分別與B、C、D之間細(xì)菌群落具有明顯分離（plt;0.05），說明A組細(xì)菌群落與B、C、D組之間具有顯著差異，但取樣點(diǎn)空間位置對于石亭江附著生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響遠(yuǎn)高于不同粒徑基底泥沙的影響。

3 結(jié) 論

在四川石亭江河道進(jìn)行不同粒徑組泥沙表層生物膜中的細(xì)菌群落采樣，并對4組生物膜樣品進(jìn)行了理化因子測定與高通量測序。理化分析發(fā)現(xiàn)，樣品生物膜細(xì)菌群落與環(huán)境理化因子中DO、Salinity相關(guān)性最強(qiáng)，而與H、pH、V、TIC相關(guān)性較弱。高通量測序的結(jié)果表明，最細(xì)的A組泥沙（dlt;2 mm）中的附著生物膜細(xì)菌具有最高的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)，即A組樣本群落的多樣性與豐度最高;A組泥沙與D組泥沙（100 mm≤dlt;200 mm）附著生物膜的Shannon指數(shù)存在著顯著差異（plt;0.05）。同時，堰上游泥沙生物膜細(xì)菌的多樣性也明顯高于堰下游，這可能是由于堰下游河床的沖刷不利于附石細(xì)菌的生長。分析生物膜樣本細(xì)菌群落特征后發(fā)現(xiàn)，A組樣本在門水平與屬水平下，都與其他3組樣本在微生物物種相對豐度上存在著較大差異，但同時ANOSIM統(tǒng)計檢驗(yàn)顯示，生物膜樣本細(xì)菌群落在不同取樣點(diǎn)之間分離明顯，而在不用粒徑分組中的分離卻并不明顯。因此，取樣點(diǎn)空間位置對石亭江附著生物膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響遠(yuǎn)高于不同粒徑泥沙基底的影響。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 趙慧明.泥沙顆粒生長生物膜后基本物理性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究［D］.北京：清華大學(xué)，2010.

［2］ 王梁燕，戴商，金妙仁，等.重金屬污染水環(huán)境的微生物修復(fù)技術(shù)［J］.生物工程學(xué)報，2024，40（10）：3427-3440.

［3］ 方紅衛(wèi)，趙慧明，何國建，等.泥沙顆粒生長生物膜前后表面變化的試驗(yàn)研究［J］.水利學(xué)報，2011，42（3）：278-283.

［4］ 尚倩倩，方紅衛(wèi)，趙慧明，等.泥沙顆粒生長生物膜后沉降的實(shí)驗(yàn)研究Ⅰ：實(shí)驗(yàn)設(shè)計及粒徑變化［J］.水利學(xué)報，2012，43（3）：275-281.

［5］ 方紅衛(wèi)，尚倩倩，趙慧明，等.泥沙顆粒生長生物膜后沉降的實(shí)驗(yàn)研究Ⅱ：沉降速度計算［J］.水利學(xué)報，2012，43（4）：386-391.

［6］ WANG C，LIU S，WANG P F，et al.How sediment bacterial community shifts along the urban river located in mining city［J］.Environmental Science and Pollution Research，2021，28（31）：42300-42312.

［7］ LIU T，ZHANG A N，WANG J W，et al.Integrated biogeography of planktonic and sedimentary bacterial communities in the Yangtze River［J］.Microbiome，2018，6（1）：16.

［8］ KNIGHTON D.Fluvial forms and processes［M］.Oxford：Oxford University Press，1998.

［9］ 梁仕華，曾偉華，龔星，等.顆粒級配對微生物固化砂土力學(xué)性能的影響［J］.人民長江，2020，51（2）：179-183.

［10］ROMAN A M，SABATER S.Structure and activity of rock and sand biofilms in a Mediterranean stream［J］.Ecology，2001，82（11）：3232-3245.

［11］MARCARELLI A M，HUCKINS C J，EGGERT S L.Sand aggradation alters biofilm standing crop and metabolism in a low-gradient Lake Superior tributary［J］.Journal of Great Lakes Research，2015，41（4）：1052-1059.

［12］ROMAN A M，GIORGI A，ACUA V，et al.The influence of substratum type and nutrient supply on biofilm organic matter utilization in streams［J］.Limnology and Oceanography，2004，49（5）：1713-1721.

［13］杜祥運(yùn)，許文年，夏振堯.向家壩工程擾動邊坡微生物群落功能多樣性分析［J］.人民長江，2016，47（21）：20-24.

［14］MA X D，WANG L，NIE R H，et al.Case study：model test on the effects of grade control datum drop on the upstream bed morphology in Shiting River［J］.Water，2019，11（9）：1898.

［15］FANN N，NIE R H，WANG Q，et al.Dramatic undercutting of piedmont rivers after the 2008 Wenchuan Ms 8.0 Earthquake［J］.Scientific Reports，2016，6（1）：37108.

（編輯：黃文晉）

Differences in bacterial communities of biofilms in bed sands of different particle sizes in Shiting River，Sichuan Province

ZHENG Shan^1，2，3，LIU Min⁴，CHEN Zhang⁴，AN Chen′ge⁵

（1.Key Laboratory of Earthquake Engineering Simulation and Seismic Resilience of China Earthquake Administration，Tianjin University，Tianjin 300350，China； 2.Key Laboratory of Coast Civil Structure Safety of Ministry of Education，Tianjin University，Tianjin 300350，China； 3.School of Civil Engineering，Tianjin University，Tianjin 300350，China； 4.State Key Laboratory of Water Resources Engineering and Management，Wuhan University，Wuhan 430072，China； 5.Department of Hydraulic Engineering，Tsinghua University，Beijing 100084，China）

Abstract：

Biofilms attach to surfaces of bed sediments contain a large number of microorganisms，which play an important role in decomposition of organic matter and carbon and nitrogen cycling in river channels.Nevertheless，the specific composition of bacterial communities in biofilms on bed sediments with different particle sizes remains unclear.Based on an examination of four sets of biofilm samples collected from the Shiting River，we studied the composition of bacterial communities in the biofilms on the sediments with different particle sizes using High-throughput sequencing.The results showed that there were significant differences between the sediment less than 2 mm and the sediment larger than 2 mm，with notable disparity in species abundance at phylum level and genus level.Furthermore，the finest sediment （lt;2 mm）exhibited the highest Shannon and Chao indices，indicating the highest diversity.In addition，the diversity was higher at upstream of the weir compared to downstream.This was likely due to the riverbed erosion occurring downstream of the weir，which was unfavourable for growth of the epilithic bacteria.ANOSIM tests demonstrated that the spatial location exerted a more pronounced influence on the composition of bacterial communities in epilithic biofilms than sediment particle size in the Shiting River.The research results can provide a reference for the ecological restoration of mountainous rivers.

Key words：

epilithic biofilm； bacterial communities； sediment particle size； diversity； river ecology； Shiting River