摘 要：肺癌是癌癥相關死亡的主要原因，也是中國乃至全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤。本文旨在研究赤峰地區(qū)部分肺腺癌PD-L1蛋白表達情況及其臨床意義。取赤峰市腫瘤醫(yī)院部分肺腺癌組織制成石蠟標本，通過免疫組織化學法和蘇木精-伊紅染色法將切片染色，顯微鏡觀察PD-L1蛋白表達情況。研究數(shù)據(jù)采用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件進行分析。分析赤峰地區(qū)部分肺腺癌組織PD-L1蛋白免疫組化染色陽性表達和陰性表達，陽性表達率為73%，陰性表達率為27%。并且肺腺癌組織PD-L1蛋白表達與臨床資料性別、年齡、腫物數(shù)量、腫物大小均無相關性。得出結論：首先，分析了赤峰地區(qū)部分肺腺癌組織PD-L1蛋白表達情況，該結果為臨床肺腺癌患者是否使用免疫抑制劑藥物治療提供可靠依據(jù)。其次，證明了肺腺癌組織PD-L1蛋白表達與年齡、性別、腫物數(shù)量、腫物大小均無關。

關鍵詞：肺腺癌；PD-L1蛋白；免疫組織化學法；赤峰地區(qū)

中圖分類號：R734.2文獻標識碼：A文章編號：1673-260X（2024）11-0035-04

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因[1～3]。最新癌癥統(tǒng)計報告表明我國是肺癌病率和死亡率最高的國家[4]。雖然醫(yī)療技術取得了較大的進步，但肺腺癌的5年生存率仍然很低。目前在中國，每年發(fā)病人數(shù)約78.1萬，死亡人數(shù)也達到62.6萬[5]。肺癌在臨床上通常分為兩個類型：非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC），其中非小細胞肺癌約占肺癌患者的85%，又分為肺鱗癌（squamous cell carcinoma， SCC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma， LUAD）和大細胞肺癌（large cell lung cancer， LCLC）三類。其中肺腺癌是最常見的肺癌類型，本文針對肺腺癌患者進行研究。

近年來，免疫治療的相關研究如日中天，比如PD-1和PD-L1免疫治療。程序性死亡配體1簡稱PD-L1，是一種常見的表達于抗原提呈細胞和腫瘤細胞表面的跨膜蛋白[6]，程序性死亡受體1簡稱PD-1，是一種主要表達在T細胞上的免疫抑制因子，當PD-L1與PD-1結合，可以誘導活化的T細胞凋亡或耗竭，腫瘤細胞就可以逃脫T細胞的免疫殺傷作用。免疫檢查點抑制劑是免疫治療的一種新方式，通過糾正腫瘤進展過程中的免疫反應的特定缺陷或功能障礙，恢復抗腫瘤的免疫能力[7]。PD-L1免疫檢查點抑制劑在非小細胞肺癌的臨床一、二線治療方面均獲得顯著成效[8，9]，使非小細胞肺癌（包括肺腺癌）又多了一種高效治療方法[10]。并且PD-L1與PD-1結合在免疫逃逸及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[11]。藥物（帕博利珠單抗、尼伏單抗、派姆單抗等）可以阻斷這種抑制信號，增強T細胞的活性，進而提高肺腺癌患者生存率[12～14]。

在赤峰地區(qū)肺腺癌PD-L1蛋白檢測方面還沒有相關報道，因此本研究旨在針對赤峰地區(qū)部分肺腺癌患者開展PD-L1蛋白檢測及其臨床資料的相關性分析。本文以赤峰地區(qū)部分肺腺癌患者為對象，在肺腺癌石蠟組織標本上采用蘇木精-伊紅染色法和免疫組織化學方法進行PD-L1蛋白檢測，為臨床肺腺癌患者免疫抑制劑治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年4月至2024年4月間赤峰市腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)手術切除的肺腺癌病例共計168例，其中做PD-L1檢測30例（檢測率為17.9%，30/168）。均經(jīng)病理學明確診斷為浸潤性肺腺癌。5例男性患者，25例女性患者。年齡范圍是39歲至72歲，平均（51.00±9.26）歲。本研究材料均使用手術切除標本，其他相關臨床資料均取自患者病理報告及病歷資料。本次研究所用標本的臨床使用申請已獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準。納入標準：（1）病人及其家屬已簽訂知情同意書。（2）患者均未進行放化療等癌癥治療。（3）所有病例標本均在離體后60min內進行10%甲醛固定石蠟包埋處理，組織切片厚度4μm。排除標準：（1）鱗癌。（2）錯構瘤等一些良性腫瘤。（3）病理和臨床資料不完整。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器

PD-L1蛋白檢測試劑盒（E1L3N）產(chǎn)自邁杰轉化醫(yī)學研究有限公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）、二抗（鼠抗兔IgG蛋白）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均產(chǎn)自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，LUMATAS免疫組化自動染色儀產(chǎn)自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2.2 蘇木素-伊紅（HE）染色及免疫組織化學（IHC）染色過程

將石蠟包埋組織連續(xù)切片，厚度為4μm，進行常規(guī)脫蠟處理（二甲苯溶液，5min）后在常溫下用梯度酒精進行脫水，一部分使用蘇木素進行染色（5min）后進行自來水清洗，采用1%鹽酸酒精進行浸泡（1min），清洗后使用伊紅染色處理（3min），清洗后再次進行梯度酒精脫水處理，待染色成功后行蓋玻片封片。另一部分切片IHC采用邁新機器自動化方法。將切片放入機器內，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復、加一抗PD-L1（E1L3N）、二抗（MaxVision-HRP鼠抗兔IgG試劑盒）、DAB顯色、蘇木素復染細胞核等步驟。最后，將切片用梯度酒精脫水，在二甲苯中透明，之后滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，烤箱72℃烤片30min，拿出切片，貼上標簽。在顯微鏡下進行觀察，圖像分析、拍照。

1.2.3 PD-L1蛋白IHC染色的石蠟標本和質控要求

（1）PD-L1蛋白免疫組化染色標本要求：確定肺腺癌細胞形態(tài)完整以及有足夠癌細胞用于評估（不少于100個腫瘤細胞）。

（2）PD-L1檢測過程組織質控：用戶實驗室檢測過程的差異可能會導致結果有顯著差異。每次染色運行時，需包括陽性和陰性實驗室內的組織質控。理想的陽性組織質控應呈現(xiàn)對腫瘤細胞和腫瘤相關免疫細胞（包括淋巴細胞，巨噬細胞）由弱到中度染色的完整動態(tài)范圍。理想的陰性組織質控應呈現(xiàn)對腫瘤細胞和腫瘤相關免疫細胞沒有染色。

（3）陽性質控：陽性質控片（已知PD-L1陽性）的PD-L1抗體染色以及陰性對照試劑的染色，用于檢測固定方法和抗原修復過程是否有效。PD-L1陽性的腫瘤組織、扁桃體組織、胎盤組織，或PD-L1陽性細胞系（如：NCI-H596、NCI-H260和NCI-H460等）等樣本均可作為本試劑的陽性質控組織。即用型PD-L1兔單抗在陽性質控組織的腫瘤細胞、扁桃體的生發(fā)中心的免疫細胞和隱窩上皮細胞、胎盤滋養(yǎng)層細胞或NCI-H596、NCI-H260和NCI-H460細胞上呈棕褐色細胞膜和/或細胞質染色信號。陰性對照試劑在陽性質控品中不見任何目標染色信號。

（4）陰性質控：陰性質控片（已知PD-L1陰性）的PD-L1抗體染色以及陰性對照試劑的染色，以驗證抗原抗體結合的特異性。PD-L1陰性的腫瘤組織、胃組織（腺上皮細胞）或PD-L1陰性細胞系（如：K562或KM12等）等樣本均可作為本試劑的陰性質控片。即用型PD-L1兔單抗和陰性對照試劑在陰性質控品中不見目標染色信號。

（5）陰性對照試劑質控：本試劑盒中的陰性對照試劑用于判斷是否存在非特異性染色或污染。如果陰性對照試劑染色結果為陽性或大量背景著色，則試驗樣本的檢測結果應視為無效。PD-L1（E1L3N）抗體檢測試劑（免疫組織化學）判讀手冊—nsNSCLC 9待測標本處理建議使用經(jīng)4%中性甲醛（磷酸緩沖）溶液固定、石蠟包埋（FFPE）的組織樣本。組織離體后應在30分鐘內使用4%中性甲醛溶液（磷酸緩沖）固定，固定液量與所浸泡組織的比例應足夠。固定時間以6～72小時為宜。參照病理技術規(guī)范要求取材、脫水、石蠟包埋并制成石蠟包埋組織樣本。石蠟包埋組織樣本應切成厚度為3～5μm的切片。切片后，組織切片黏附在防脫載玻片上，60±5℃烤片30～60分鐘。為了防止蛋白丟失，保持抗原活性，一旦將組織置于載玻片上制成切片，切片應置于2～8℃、室溫（10～30℃）或-20±5℃避光保存。置于2～8℃保存的切片應在1個月內使用；置于室溫（10～30℃）保存的切片應在7天內使用；置于-20±5℃保存的切片應在6個月內使用。

（6）評分標準：PD-L1（E1L3N）抗體檢測試劑（免疫組織化學）是一種定性免疫組織化學檢測方法。使用腫瘤細胞的細胞膜染色比例評分測定肺腺癌中的PD-L1蛋白表達，不需考慮細胞膜或細胞染色強度和染色完整性。對檢測PD-L1表達的肺腺癌組織標本進行評分，根據(jù)肺腺癌細胞評為以下表達水平：TC（%）=任何強度PD-L1膜染色陽性的肺腺癌細胞數(shù)/肺腺癌細胞總數(shù)×100%，TC≥1%為PD-L1表達陽性，TC＜1%為PD-L1表達陰性。

1.2.4 統(tǒng)計學方法

研究數(shù)據(jù)采用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件進行分析。肺腺癌組織PD-L1蛋白免疫組化染色表達采用費希爾判別法（Fisher檢驗）。P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織PD-L1蛋白免疫組化染色陽性表達

肺腺癌石蠟組織標本的連續(xù)切片上首先設置陰性對照和陽性切片，然后對PD-L1蛋白免疫組化染色，如圖1所示。在陰性對照切片上癌細胞膜PD-L1蛋白無著色，呈陰性表達（圖1A黑色箭頭）。在陽性切片上癌細胞膜棕黃色著色呈陽性表達（圖1B和C黑色箭頭）。肺泡腔內吞噬細胞膜PD-L1蛋白有棕黃色著色，但是根據(jù)PD-L1蛋白表達判讀標準不能將其判讀為陽性（圖1B白色箭頭）。

2.2 肺腺癌組織PD-L1蛋白免疫組化染色陰性表達

肺腺癌石蠟組織標本的連續(xù)切片上首先設置陰性對照切片和陽性切片，然后使用顯微鏡觀察PD-L1蛋白免疫組化染色情況，如圖2所示。在陰性對照切片上癌細胞膜（圖2A和D黑色箭頭）和肺泡腔吞噬細胞膜（圖2A和D白色箭頭）PD-L1蛋白無著色，呈陰性表達。在陽性切片上癌細胞膜無著色呈陰性表達（圖2B、C、E、F黑色箭頭）。肺泡腔內吞噬細胞膜PD-L1蛋白有棕黃色著色，但是根據(jù)PD-L1蛋白表達判讀標準不能將其判讀為陽性（圖2B、C、E、F白色箭頭）。

2.3 肺腺癌組織PD-L1蛋白免疫組化染色陽性表達率分析與臨床資料分析

赤峰地區(qū)部分肺腺癌組織PD-L1蛋白免疫組化染色陽性率為73%（22/30例）。肺腺癌PD-L1蛋白表達與患者性別、年齡、腫物數(shù)量、腫瘤大小無關。詳見表1。

3 討論

在肺腺癌的各種治療方法中，手術治療為首選治療方法?？墒怯捎诜N種原因，只有15%肺腺癌患者適合手術治療[15]。目前對這部分肺腺癌患者進行深入探索，為患者研制出了靶向治療等新治療方法對抗肺腺癌，極大改善肺腺癌患者的預后和生存期。但是仍有部分患者沒有發(fā)現(xiàn)相應的已知致病的驅動基因，無法對患者采取更精準的治療。因此，尋找并開發(fā)新的特異性生物標記物和藥物靶點，深入系統(tǒng)研究肺腺癌的發(fā)病機制，對于肺腺癌的早期診斷和治療具有重要意義。

腫瘤免疫逃逸是腫瘤形成的重要特征之一，主要由于腫瘤細胞自身的修飾和腫瘤微環(huán)境的改變，掌握腫瘤免疫逃逸的機制，對于患者臨床治療大有裨益[7]。PD-L1是PD-1（也稱為CD279）的第一個功能特征配體，也稱為B7-H1或CD274[16]。PD-L1抑制劑，是免疫抑制劑的一種，通過識別腫瘤細胞表面的PD-L1并與其結合，阻斷腫瘤的免疫逃逸，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。因此，全面分析肺腺癌中PD-L1的表達具有重要的臨床意義。

臨床上常通過篩查PD-L1的表達水平，判斷患者是否能夠在免疫治療中獲益，PD-L1的表達率越高，常提示患者采用免疫治療的效果可能更好。這時候可以給患者采用PD-L1單抗的藥物進行治療，也可以將PD-L1單抗與化療、放療進行聯(lián)合應用，常常能收獲更好的治療效果。PD-L1蛋白不僅表達在腫瘤細胞，還表達在激活的T細胞、B細胞、DC細胞、單核細胞、NK細胞，肝、肺等部位的組織巨噬細胞、激活的血管內皮細胞、間充質干細胞。在免疫豁免部位如眼、胎盤部位的細胞可有PD-L1的固定表達[17]。本文實驗中，30例赤峰地區(qū)肺腺癌患者PD-L1蛋白免疫組化陽性染色為22例，可以嘗試使用免疫治療。30例赤峰地區(qū)部分肺腺癌患者PD-L1蛋白免疫組化陰性染色為8例，不建議使用免疫治療，本實驗肺腺癌患者PD-L1蛋白在肺泡腔的單核巨噬細胞中同樣表達，與尼加提·艾爾肯的文章中所述一致[17]。

馬海玥等人研究表明，在肺腺癌中PD-L1蛋白表達與患者年齡、性別無關[18]，陳顯文等人研究表明，在肺腺癌中PD-L1的表達與患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小等無關，沒有統(tǒng)計學意義[19]。我們實驗研究結果同樣顯示肺腺癌中PD-L1蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量無關，這一結果與上述相關報道基本相符。但是夏成茂的文章結果顯示，肺腺癌中PD-L1的表達與患者性別有關系。肺腺癌中PD-L1蛋白表達與臨床資料相關性分析結果出現(xiàn)差異[3]，可能有諸多因素參與，其中實驗樣本數(shù)量是可能干擾因素之一。

4 結論

本文分析了赤峰地區(qū)部分肺腺癌組織PD-L1蛋白表達情況，陽性表達率為73%（22/30），陰性表達率為27%（8/30），該結果為臨床肺腺癌患者是否使用免疫抑制劑藥物治療提供可靠依據(jù)；首次證明了赤峰地區(qū)部分肺腺癌組織PD-L1蛋白表達與年齡、性別、腫物數(shù)量、腫物大小均無關。

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收稿日期：2024-06-13

通信作者：白玉勤（1969-），女，興安盟科右前旗人，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤分子病理學研究，郵箱：baiyuqincn@163.com。

基金項目：內蒙古自治區(qū)教育廳科學研究項目（NJZY22178）