摘要：目的三結構域蛋白29（TRIM29）參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，與部分DNA和RNA病毒復制密切相關，本研究對TRIM29與HBV復制及聚乙二醇干擾素（PEG-IFN）α-2b抗病毒作用之間的關系展開初步討論。方法選取2021年10月—2022年6月在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院感染內(nèi)科門診就診的CHB患者64例，其中未治療患者34例（CHB組），經(jīng)PEG-IFN-α-2b治療患者30例，體檢中心30例健康志愿者作為對照（健康對照組）。收集志愿者年齡、性別、ALT、AST、TBil、DBil、HBV DNA和外周血單個核細胞（PBMC）。采用HepG2和HepG2.2.15細胞作為細胞模型，將TRIM29特異性過表達質?；騭iRNA和對照轉染至細胞；PEG-IFN-α-2b（0、10、100、1 000和10 000 U/mL）處理HepG2細胞和Huh7細胞；TRIM29特異性si-RNA或陰性對照聯(lián)合PEG-IFN-α-2b處理HepG2.2.15細胞。ELISA檢測HBsAg和HBeAg的濃度，qRT-PCR檢測TRIM29和HBV RNA相對表達水平，Western Blot檢測STING、p-TBK1、TBK1、pIRF3、IRF3、MX1和IFIT1蛋白表達情況，免疫共沉淀檢測TRIM29與STING蛋白相互作用關系。正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher檢驗。結果CHB組患者外周血TRIM29表達明顯高于健康對照組（Plt;0.001）。在細胞實驗中，HBsAg、HBeAg和HBV RNA的表達均隨TRIM29表達上調(diào)而升高，隨TRIM29表達下調(diào)而降低（P值均lt;0.05）。TRIM29與STING互相結合，并通過蛋白酶降解STING，與對照組相比，過表達TRIM29對TBK1和IRF3總蛋白無明顯變化，STING、p-TBK1和p-IRF3蛋白表達水平均降低（P值均lt;0.05）。處理HepG2細胞和Huh7細胞的PEG-IFN-α-2b濃度越高，TRIM29蛋白和mRNA的表達水平越低（P值均lt;0.01）。CHB患者在PEG-IFN-α-2b治療期間，TRIM29 mRNA表達水平逐漸降低，且早期應答組和無應答組間差異均有統(tǒng)計學意義（P值均lt;0.05）。在等量PEG-IFN-α-2b處理下，與對照相比，敲低TRIM29后HepG2.2.15細胞的MX1和IFIT1蛋白表達水平明顯增高（P值均lt;0.05）。在PEG-IFN-α-2b治療早期，CHB患者PBMC中TRIM29表達逐漸降低。結論TRIM29靶向并降解STING，通過抑制STING-TBK1-IRF3信號通路促進HBV復制。TRIM29干擾PEG-IFN-α-2b的抗病毒作用，CHB患者PBMC中TRIM29的表達水平可能作為預測患者對PEG-IFN-α-2b治療應答的指標。

關鍵詞：乙型肝炎病毒；三結構域蛋白29；聚乙二醇干擾素α;信號通路

基金項目：國家自然科學基金地區(qū)基金（82060114）；貴州省衛(wèi)健委2023年度科技基金項目（gzwkj2023-042）；貴州省衛(wèi)生健康委員會2024年科技基金項目（gzwkj2024-010）

Association of TRIM29 with HBV replication and the antiviral effect of pegylated interferonα-2b

LIAO Xin1，ZHANG Baofang2.（1.School of Clinical Medicine，Guizhou Medical University，Guiyang 550000，China；2.Department of Infectious Diseases，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550000，China）

Corresponding author：ZHANG Baofang，312368145@qq.com（ORCID：0000-0002-5396-540X）

Abstract：Objective To preliminarily investigate the association of TRIM29 with HBV replication and the antiviral effect of pegylated interferonα-2b（PEG-IFN-α-2b），since TRIM29 protein is involved in the development and progression of a variety of diseases and is closely associated with the replication of some DNA and RNA viruses.Methods A total of 64 chronic hepatitis B（CHB）patients who attended the outpatient service of Department of Infectious Diseases，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，from October 2021 to June 2022 were enrolled，among whom there were 34 treatment-na?ve patients and 30 patients treated with PEG-IFN-α-2b，and 30 healthy volunteers in Physical Examination Center were enrolled as controls.Related data were collected，including age，sex，alanine aminotransferase，aspartate aminotransferase，total bilirubin，direct bilirubin，HBV DNA，and peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）.HepG2 and HepG2.2.15 cells were used as cell models and were transfected with TRIM29-specific overexpressed plasmid or siRNA and control plasmid.HepG2 cells and Huh7 cells were treated with PEG-IFN-α-2b（0，10，100，1 000，and 10 000 U/mL），and HepG2.2.15 cells were treated with TRIM29-specific siRNA or negative control combined with PEG-IFN-α-2b.ELISA was used to measure the concentrations of HBsAg and HBeAg；qRT-PCR was used to measure the relative expression levels of TRIM29 and HBV RNA；Western blot was used to measure the protein expression levels of STING，p-TBK1，TBK1，pIRF3，IRF3，MX1，and IFIT1；co-immunoprecipitation assay was used to observe the interaction between TRIM29 and STING protein.The independent-samples t test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups，and a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，with the least significant difference t-test for further comparison between two groups；the chi-square test or the Fisher’s exact test was used for comparison of categorical data between two groups.Results The CHB patients had a significantly higher expression level of TRIM29 in peripheral blood than the healthy controls（Plt;0.001）.In cell experiments，the expression levels of HBsAg，HBeAg，and HBV RNA increased with the upregulation of TRIM29 expression and decreased with downregulation of TRIM29 expression（Plt;0.05）.TRIM29 bound to STING and degraded STING via protease，and compared with the control group，there were no significant changes in the total protein levels of TBK1 and IRF3 after overexpression of TRIM29，while there were significant reductions in the expression levels of STING，p-TBK1，and p-IRF3（Plt;0.05）.The protein and mRNA expression levels of TRIM29 decreased with the increase in the concentration of PEG-IFN-α-2b for the treatment of HepG2 and Huh7 cells（Plt;0.01）.During the treatment with PEG-IFN-α-2b，the CHB patients had a gradual reduction in the mRNA expression level of TRIM29，and there was a significant difference between the early response group and the non-response group（Plt;0.05）.In the context of treatment with an equal volume of PEG-IFN-α-2b，compared with the control group，there were significant increases in the protein expression levels of Mx1 and IFIT1 in HepG2.2.15 cells after TRIM29 knockdown（Plt;0.05）.There was a gradual reduction in the expression of TRIM29 in CHB patients during the early stage of PEG-IFN-α-2b treatment.Conclusion TRIM29 targets and degrades STING and promotes HBV replication by inhibiting the STING-TBK1-IRF3 signaling pathway.TRIM29 interferes with the antiviral effect of PEG-IFN-α-2b，and the expression level of TRIM29 in PBMCs of CHB patients may be used as an indicator for predicting the response of patients to PEG-IFN-α-2b therapy.

Key words：Hepatitis B Virus；Tripartite Motif-Containing Protein 29；PEG-IFNα;Signaling Pathway

Research funding：National Natural Science Foundation of China（82060114）；Scienceamp;Technology Fund Project of Guizhou Health Commission in 2023（gzwkj2023-042）；The Science and Technology Fund Project of Guizhou Health Commission in 2024（gzwkj2024-010）

HBV感染是重大的全球公共衛(wèi)生問題，全球約有2.96億人感染HBV［1］。慢性乙型肝炎（CHB）可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌?，F(xiàn)有的CHB治療藥物包括核苷（酸）類似物和聚乙二醇干擾素（PEG-IFN）等，目前的治療手段對消除HBV感染仍有很大不足，需要研究新的藥物和治療手段來克服這一問題［2］。

三結構域蛋白（tripartite motif-containing protein，TRIM）家族成員參與多種生物過程，包括信號轉導、細胞增殖、凋亡、分化和免疫應答等［3-5］。TRIM29是其中一員，位于染色體11q23上，編碼588個氨基酸的蛋白質［6-7］，在乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌和肝癌等腫瘤疾病中均有報道［8-11］。近來研究［3，12］發(fā)現(xiàn)，TRIM29在病毒感染的免疫反應可以抑制免疫激活，發(fā)揮負向調(diào)控的作用。在部分RNA和DNA病毒感染過程中，TRIM29負向調(diào)控IFN的產(chǎn)生，幫助病毒實現(xiàn)免疫逃逸。目前，關于TRIM29與HBV的研究尚不多見，本研究初步探討TRIM29對HBV的潛在作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1外周血采集2021年10月—2022年6月在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院感染內(nèi)科門診就診的64例CHB患者的血液樣本，其中未治療患者（CHB組）34例，經(jīng)PEG-IFN-α-2b治療24周患者30例，體檢中心30例健康志愿者作為對照（健康對照組）。30例經(jīng)治患者治療24周后，將HBsAglt;200 IU/mL、HBV DNA下降gt;1 log10 IU/mL的CHB患者分為早期應答組（n=11），反之則是無應答組（n=19）。CHB診斷參考《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［13］。排除標準：（1）HIV和HCV感染者；（2）酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎和肝硬化等肝膽系統(tǒng)疾病患者；（3）惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病患者。

1.1.2質粒本實驗中所用HBV 1.3-mer WT replico質粒購于淼靈生物公司，pCMV-TRIM29-Flag、pCMV-STING-Myc購于上海吉凱基因公司，si-TRIM29購于上海漢恒生物科技公司。

1.1.3細胞本實驗所用的HepG2和Huh7細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，HepG2.2.15細胞購于上海富衡生物科技有限公司，HEK293T細胞株為本實驗室留存。Huh7、HepG2、HEK293T細胞在10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HepG2.2.15細胞在10%胎牛血清、1%雙抗和480μg/mL G418的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境：37℃;空氣，95%；二氧化碳，5%，培養(yǎng)箱濕度為70%～80%。

1.1.4藥物PEG-IFN-α-2b購于中國廈門特寶生物工程股份有限公司，批準文號：國藥準字S20160001，貨號：202208JS15。MG132購于美國ApexBio生物公司。

1.2研究方法

1.2.1標本采集獲得研究者同意后，采集新鮮抗凝全血5 mL，分離出外周血單個核細胞（PBMC），保存于?80℃冰箱。

1.2.2細胞培養(yǎng)和轉染將細胞接種于6孔板中，細胞濃度培養(yǎng)至70%時準備轉染。使用lipofectamine（Invitrogen）按照制造商的說明進行細胞轉染。

1.2.3實時定量PCR（qRT-PCR）使用RNA提取試劑（Omega）提取細胞總RNA。根據(jù)制造商的說明使用PrimeScript?RT Master Mix（Takara）將RNA逆轉錄成cDNA。在實時熒光定量PCR儀器（Bio-Rad）中按TB Green Premix Ex TaqⅡRR820A（Takara）說明書進行qRT-PCR。引物序列見表1。

1.2.4 ELISA實驗收集細胞上清液，根據(jù)制造商的說明用人HBsAg和HBeAg ELISA試劑盒（晶美生物）進行檢測，并通過多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific）檢測吸光度并分析結果。

1.2.5蛋白質免疫印跡（Western Blot）實驗收集細胞，加入RIPA裂解液（Solarbio）提取蛋白質，BCA試劑盒測定蛋白濃度，3μL蛋白marker（Thermo、雅酶、塞維爾、聚合美），10%凝膠電泳，5%BSA混合溶液封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗PVDF膜3次，加二抗孵育2 h。一抗：TRIM29（1∶2 000）、STING（1∶2 000）、TBK1（1∶1 000）、p-TBK1（1∶1 000）、IRF3（1∶1 000）、p-IRF3（1∶1 000）、DYKDDDDK tag Recombinant antibody（1∶1 200）、MYC tag Polyclonal antibody（1∶1 200）、GAPDH（1∶10 000）、Mx1（1∶1 000）、IFIT1（1∶2 500）；二抗（1∶1 000）室溫下孵育1 h。ECL法顯影，使用Image J分析計算灰度值積分。1.2.6免疫共沉淀取1 mg蛋白加入5μg抗體，4℃摩天輪旋轉過夜。取RIPA裂解液混懸磁珠，磁性分離。向4℃孵育過夜后的抗原-抗體混合物中加入預洗好的磁珠，4℃摩天輪旋轉孵育4 h。清洗磁珠，向磁珠中加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮樣使蛋白變性。分離磁珠，收集上清，進行SDS-PAGE。

1.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 27.0軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 TRIM29表達水平與HBV感染的關系與健康對照組相比，CHB組患者外周血TRIM29表達水平明顯更高（Plt;0.001）（圖1a），CHB患者一般臨床資料如表2。此外，與普通HepG2細胞相比，能夠穩(wěn)定表達HBV基因組的HepG2.2.15細胞中TRIM29表達也明顯較高（圖1b）。

2.2過表達TRIM29對HBV復制的影響在HepG2.2.15細胞中轉染TRIM29質粒，在HepG2細胞中共轉染TRIM29質粒與pHBV1.3質粒，轉染48 h后，收集培養(yǎng)基和細胞，Western Blot和qRT-PCR檢測質粒轉染效率，結果顯示TRIM29過表達成功（P值均lt;0.01）（圖2a、c）。利用ELISA和qRT-PCR檢測HBV復制變化情況，與對照相比，過表達組HBsAg、HBeAg和HBV RNA的表達水平均顯著升高（P值均lt;0.01）（圖2b、d）。

2.3沉默TRIM29對HBV復制的影響將TRIM29特異性si-RNA轉染至細胞中，Western Blot和qRT-PCR檢測結果顯示siRNA-3敲低成功（P值均lt;0.05）（圖3a、c）。在HepG2.2.15細胞中轉染TRIM29特異性siRNA-3，在HepG2細胞中共轉染TRIM29特異性siRNA-3與pHBV1.3質粒，轉染48 h后，收集培養(yǎng)基和細胞，利用ELISA和qRT-PCR檢測HBV復制變化情況。與siNC組相比，敲低組HBsAg、HBeAg和HBV RNA的表達水平均明顯降低（P值均lt;0.05）（圖3b、d）。

2.4 TRIM29對STING-TBK1-IRF3信號通路的調(diào)控作用MG132是一種強效的蛋白酶體抑制劑，通過抑制蛋白酶體依賴的降解途徑來抑制蛋白質的降解。免疫共沉淀顯示，在MG132的作用下，STING蛋白降解受到抑制，與TRIM29蛋白互相結合（圖4a）。qRT-PCR檢測顯示，與對照組相比，在HepG2細胞和HepG2.2.15細胞中過表達TRIM29能夠顯著降低IFN-αmRNA的水平（P值均lt;0.01）（圖4b、c）。Western Blot檢測STING-TBK1-IRF3信號通路蛋白結果顯示，與對照組相比，HepG2細胞和HepG2.2.15細胞中TBK1、IRF3總蛋白水平無明顯變化，STING、TBK1磷酸化蛋白和IRF3磷酸化蛋白表達水平均降低（P值均lt;0.05）（圖4d、e）。這些結果顯示TRIM29負向調(diào)控STING-TBK1-IRF3信號通路。

2.5 PEG-IFN-α-2b對TRIM29表達的影響分別用不同劑量的PEG-IFN-α-2b（0、10、100、1 000和10 000 U/mL）刺激HepG2細胞和Huh7細胞，24 h后收集細胞，Western Blot和qRT-PCR檢測結果顯示，處理的PEG-IFN-α-2b濃度越高，TRIM29蛋白和mRNA的表達水平越低（P值均lt;0.01）（圖5）。

2.6 CHB患者PEG-IFN-α-2b治療早期HBV DNA、ALT和TRIM29 mRNA表達的動態(tài)變化治療期間，兩組HBV DNA和TRIM29 mRNA相對表達水平逐漸下降，且0、12和24周時兩組間差異均有統(tǒng)計學意義（P值均lt;0.05）。兩組ALT水平均先升后降，治療12周和24周時兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P值均lt;0.001）（表3）。

2.7 TRIM29對PEG-IFN-α-2b抗病毒作用的影響Western Blot檢測TRIM29對PEG-IFN-α-2b抗病毒作用的影響。與siNC組相比，PEG-IFN-α-2b處理組、PEG-IFN-α-2b與si-TRIM29共處理組細胞中的MX1（Plt;0.05，Plt;0.001）和IFIT1（Plt;0.01，Plt;0.0001）蛋白表達明顯增加。相較于PEG-IFN-α-2b處理組，PEG-IFN-α-2b與si-TRIM29共處理組中細胞的MX1（Plt;0.05）和IFIT1（Plt;0.05）蛋白增加更多（圖6）。

3討論

HBV感染可引起急性和慢性肝臟感染，該病毒是一種包膜雙鏈DNA病毒，其包膜蛋白與肝細胞表面的Na+-?；悄懰峁厕D運多肽特異性結合［14］。長度約為3.2 kb的松弛環(huán)狀DNA進入宿主肝細胞的細胞核中，經(jīng)細胞修復系統(tǒng)將其轉化為共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）［15］。HBV cccDNA作為所有病毒蛋白基因組前RNA和亞基因組RNA轉錄物的模板，在病毒持續(xù)感染和復發(fā)中起著至關重要的作用。IFN參與先天免疫應答反應，是具有抗病毒作用的細胞因子，低病毒載量可誘導IFN-Ⅰ應答并刺激HBV基因表達和復制，然而，當病毒載量高時，IFN-Ⅰ可抑制HBV復制［16］。有研究［17-19］發(fā)現(xiàn)，IFN可清除HBV cccDNA，發(fā)揮抗病毒作用。

TRIM蛋白在多種疾病中發(fā)揮作用，包括神經(jīng)精神疾病、發(fā)育性疾病、心血管疾病、染色體異常、傳染病、癌癥等［20-23］。多種TRIM家族蛋白已被證實參與HBV復制，例如，TRIM21與HBx蛋白相互作用，靶向HBx泛素化和蛋白酶體降解，導致染色體結構維持蛋白6降解受損，抑制HBV復制［24］；TRIM5γ通過促進K48相關的泛素化和K95泛素位點HBx蛋白的降解來抑制HBV復制［25］；TRIM25可以增強HBx的K90位點泛素化，并通過蛋白酶體途徑促進HBx降解，TRIM25還可能作為適配器，增強RIG-I對pgRNA的識別，從而進一步促進IFN的產(chǎn)生，抑制HBV復制［26］。

人類疾病與蛋白質變化有關，本研究發(fā)現(xiàn)TRIM29在CHB患者外周血中的表達水平明顯高于健康對照組。與普通肝癌細胞HepG2相比，TRIM29在穩(wěn)定表達HBV基因的HepG2.2.15中表達也更高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在瞬時轉染HBV質粒的HepG2細胞和HepG2.2.15細胞中，TRIM29過表達后可促進HBV復制，而敲低TRIM29則抑制HBV復制。這些結果顯示，HBV感染后，TRIM29促進HBV復制和基因表達。

STING是一種位于內(nèi)質網(wǎng)的小蛋白，在病毒感染觸發(fā)的免疫反應中發(fā)揮關鍵作用［27-28］。STING可通過招募TBK1促進TBK1二聚化，從而介導相鄰的TBK1互相磷酸化［29］。激活的TBK1促使STING-TBK1復合物招募IRF3并磷酸化IRF3。TBK1對IRF3的磷酸化又使IRF3發(fā)生二聚化并易位到細胞核，誘導IFN-Ⅰ、干擾素刺激基因（ISG）和其他幾種炎癥介質的基因表達［30-31］。機制研究發(fā)現(xiàn)，TRIM29可與STING結合并降解STING，負向調(diào)控STING-TBK1-IRF3信號通路。STING-TBK1-IRF3信號通路參與到免疫反應促進IFN的產(chǎn)生，細胞實驗結果顯示，過表達TRIM29后，IFN-α的表達降低。先前研究［32］發(fā)現(xiàn)，在EBV、HSV-60和cGAMP等dsDNA刺激下，TRIM29抑制先天免疫激活。因此，TRIM29可能是一個廣泛的免疫治療靶點，篩選能夠下調(diào)TRIM29表達的潛在藥物可能有助于開發(fā)新的治療HBV等病毒感染的方法，為靶向TRIM29抑制病毒復制提供一種新的策略。

有趣的是，不僅TRIM29會抑制IFN-α表達，TRIM29表達也會受到IFN-α的抑制。用不同濃度的PEG-IFN-α-2b處理HepG2和Huh7，PEG-IFN-α-2b以劑量依賴的方式抑制TRIM29的表達，使用的PEG-IFN-α-2b濃度越高，TRIM29的表達越低。

IFN是臨床最常用的抗病毒藥物之一。盡管給藥方式復雜，副作用大，僅有約1/3的患者反應良好，但PEG-IFN-α仍是最有希望的藥物［33-35］。因此，制定準確的治療方案，提高臨床藥物的治療效果是一個重要的研究方向。一些關于IFN-α耐藥機制的研究［36］發(fā)現(xiàn)，HBV通過抑制STAT1核易位，影響肝細胞中ISG的轉錄，破壞IFN-α的療效，從而阻止IFN-α信號的誘導。Rehermann等［37］研究認為，宿主的免疫狀態(tài)可能與抗病毒治療的效果有關，并可通過抗病毒治療進行調(diào)節(jié)。Luo等［38］研究發(fā)現(xiàn)IFN-α可誘導TRIM26表達，并通過降解HBx發(fā)揮抗病毒作用，而TRIM26 rs116806878與PEG-IFN-α的治療反應相關。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG-IFN-α-2b治療后，CHB患者PBMC中TRIM29的表達下降。在體外試驗中，用等量的PEG-IFN-α-2b處理HepG2.2.15細胞，TRIM29低表達組中抗病毒蛋白MX1和IFIT1表達更多，這可能提示PEG-IFN-α-2b在TRIM29低表達的CHB患者中發(fā)揮更好的抗病毒效應，不過發(fā)揮作用的具體途徑，尚待進一步探究?？偟膩碚f，早期治療期間外周血中較低的TRIM29水平可能成為預測PEG-IFN-α-2b治療反應的有效生物標志物。

綜上所述，研究證實TRIM29對HBV基因表達有促進作用，TRIM29表達水平還可能與PEG-IFN-α-2b治療預后有關，這些發(fā)現(xiàn)可能為未來抗病毒藥物開發(fā)和治療策略制訂提供新的參考。

倫理學聲明：本研究方案于2020年4月9日通過貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號為2020208。所有研究對象入組前均簽署了書面知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：廖心負責課題設計，實驗實施，收據(jù)收集和撰寫論文；張寶芳負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-02-19；錄用日期：2024-04-26

本文編輯：王瑩

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