收稿日期：2024-01-15

基金項目：江蘇省種業(yè)揭榜掛帥項目[JBGS（2021）058]；江蘇現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設項目[JATS（2023）158]；江蘇沿江地區(qū)農業(yè)科學研究所青年科技基金項目[YJ（2022）009]

作者簡介：王 凡（1989-），女，江蘇南通人，博士，助理研究員，主要從事蠶豆抗病育種研究。（E-mail）2320951333@qq.com

通訊作者：吳春芳，（E-mail）jsyias@163.com

摘要： 為明確江蘇省南通市蠶豆赤斑病的病原菌種類，對致病菌進行分離純化，并結合致病性測定、形態(tài)學觀察和多基因堿基序列分析對疑似病原菌進行鑒定。結果表明，南通市蠶豆赤斑病病原菌為擬蠶豆葡萄孢（Botrytis fabiopsis）。生物學特性分析結果表明，該病原菌菌絲的最適生長溫度為25 ℃，最適光照條件為12 h光照+12 h黑暗，對pH不敏感，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨，最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。抑菌藥劑篩選結果表明，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對病原菌的抑制效果最好，半數效應濃度（EC50）分別為0.005 4 mg/L和0.755 4 mg/L，而10.0%多抗霉素可濕性粉劑和80.0%波爾多液可濕性粉劑對病原菌幾乎無抑制效果。本研究結果可為江蘇省南通市蠶豆赤斑病的科學防治提供理論基礎。

關鍵詞： 蠶豆；赤斑?。徊≡b定；生物學特性；抑菌藥劑

中圖分類號： S436.43"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）10-1810-08

Identification and screening of antifungal agents for the pathogen causing broad bean chocolate spot in Nantong City

WANG Fan， BIAN Xiaochun， LIU Chenwei， XU Renchao， LU Hongchen， WU Chunfang

（Jiangsu Yanjiang Institute of Agricultural Sciences， Nantong 226012， China）

Abstract： To clarify the pathogen causing broad bean chocolate spot in Nantong City， Jiangsu province， the pathogen was isolated and purified， and the suspected pathogen was identified through pathogenicity testing， morphological observation， and multi-gene base sequence analysis. The results indicated that the pathogen of broad bean chocolate spot in Nantong City was Botrytis fabiopsis. The results of biological characteristics analysis showed that the optimal growth temperature for the pathogen was 25 ℃， and the optimal light condition was 12 h light + 12 h dark. The pathogen was insensitive to pH. The optimal carbon source for the pathogen was glucose， the optimal nitrogen sources were yeast extract， beef extract， and ammonium sulfate， and the optimal culture medium was potato dextrose agar （PDA） medium. The screening results of antifungal agents indicated that 2.0% sophocarpidine aqueous solution and 10.0% difenoconazole water dispersible granules had the best inhibitory effect on the pathogen， with median effective concentration （EC50） of 0.005 4 mg/L and 0.755 4 mg/L， respectively. However， 10.0% polyoxin wettable powder and 80.0% Bordeaux liquid wettable powder had almost no inhibitory effect on the pathogen. The research results can provide a theoretical basis for the scientific prevention and control of broad bean chocolate spot in Nantong City， Jiangsu province.

Key words： Vicia faba L.；chocolate spot；pathogen identification；biological characteristics；antifungal agents

蠶豆（Vicia faba L.）是重要的糧食、蔬菜、飼料和綠肥兼用豆科作物，適應性廣，有較強的固氮能力^[1]。蠶豆營養(yǎng)價值高，蛋白質含量極為豐富，富含人體必須氨基酸、維生素A、維生素B2和鈣、鐵、鋅等礦質元素^[2]。真菌病害是限制蠶豆生產的主要因素，目前為止，蠶豆上常見的真菌病害有銹病、赤斑病、根腐病、枯萎病、褐斑病和葉斑病等^[3]，其中赤斑病是世界蠶豆產區(qū)的一種主要病害。赤斑病發(fā)生在蠶豆生長發(fā)育的各個時期，最初葉子上出現紅褐色斑點，在適宜的條件下，病斑上產生大量的分生孢子，借助風雨的傳播侵染蠶豆，在連續(xù)陰雨的天氣，病斑迅速擴大，最終葉片變黑并脫落，嚴重時整株萎蔫死亡^[4]。

蠶豆赤斑病的病原菌主要為葡萄孢屬（Botrytis）真菌^[5-6]，目前被分離出來的主要有3種，分別為蠶豆葡萄孢（B. fabae）、灰葡萄孢（B. cinerea）和擬蠶豆葡萄孢（B. fabiopsis）^[7]。蠶豆葡萄孢被認為是引起蠶豆赤斑病的主要病原菌，其致病性和危害大于灰葡萄孢，其主要寄主有蠶豆、草莓、三葉草等^[8-9]?；移咸焰叩募闹鞣秶顝V，能侵染200多種植物^[10]?；移咸焰呦驳蜏馗邼?，其菌株具有豐富的多樣性，菌絲生長速度快。擬蠶豆葡萄孢是2010年在湖北省發(fā)現和命名的1個新種，其對蠶豆的危害程度與蠶豆葡萄孢相近，均比灰葡萄孢引起的病害程度嚴重^[11]。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，擬蠶豆葡萄孢的生長速度與蠶豆葡萄孢相近，比灰葡萄孢慢，其產生的菌核為同心環(huán)狀，數量多于灰葡萄孢，少于蠶豆葡萄孢。近年來，在青海省又發(fā)現并命名了5種引起蠶豆赤斑病的病原菌，分別為歐美灰霉菌（B. euroamericana）、牡丹葡萄孢（B. paeoniae）、卡羅萊納葡萄孢（B. caroliniana）、桉樹灰霉菌（B. eucalypti）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）^[12]。

赤斑病的防治主要有3種方式，分別為使用藥劑處理、改變作物栽培模式和尋找抗病品種，目前農業(yè)生產上的赤斑病防治主要還是采用藥劑處理的方式^[12]。藥劑防治分為生物防治和化學防治，在南通市如皋市，曾使用井岡·枯草芽孢桿菌進行生物防治，但效果不如化學藥劑明顯，因此需要篩選出對赤斑病病原菌有明顯殺菌效果的化學藥劑。本研究擬以江蘇省南通市如皋市的發(fā)病蠶豆為研究對象，從病株上分離純化病原菌，根據其形態(tài)學特征和多基因序列構建系統(tǒng)進化樹，明確病原菌的種類，同時對病原菌進行生物學特性分析及室內藥劑的防治篩選，以期為當地蠶豆赤斑病的有效防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品為2022年在南通市吳窯鎮(zhèn)鑫磊生態(tài)家庭農場采集具有典型赤斑病發(fā)病特點的蠶豆葉片樣品，拍照后帶回實驗室，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、察氏（CZ）培養(yǎng)基、燕麥瓊脂（OMA）培養(yǎng)基、水瓊脂（WA）培養(yǎng)基。

試劑及儀器：Simgen Plant DNA提取試劑盒購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；其他試劑均為國產分析純。TL3200B光學顯微鏡購自南京澤洋生物科技有限公司；RTOP-310Y人工氣候箱購自浙江托普云農科技股份有限公司。

供試化學藥劑：10.0%多抗霉素可濕性粉劑為陜西麥可羅生物科技有限公司產品，75.0%百菌清可濕性粉劑為利民化工股份有限公司產品，70.0%甲基硫菌靈可濕性粉劑為山東鄒平農藥有限公司產品，80.0%波爾多液可濕性粉劑為美國仙農有限公司產品，10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑為先正達南通作物保護有限公司產品，12.5%腈菌唑乳油為深圳諾普信農化股份有限公司產品，24.0%腈苯唑懸浮劑為美國陶氏益農公司產品，3.0%甲霜口惡霉靈水劑為山東東合生物科技有限公司產品，2.0%苦參堿水劑為河北瑞寶德生物化學有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 蠶豆赤斑病病原菌的分離純化 采用組織分離法分離病原菌^[13-14]。將采集的蠶豆葉片樣品用清水沖洗并晾干，在病健交界處剪取5 mm×5 mm的組織。先用75%的酒精消毒45 s，然后用3%的NaClO溶液消毒35 s，再用無菌水清洗2～3次，轉移至滅菌濾紙吸干水分后，接種于PDA培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基放置5個組織。25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)約5 d，待組織周圍長出菌落后，挑取菌落邊緣的菌絲轉接至新的PDA培養(yǎng)基上進行純化。

1.2.2 蠶豆赤斑病病原菌的鑒定 形態(tài)學鑒定：從純化的菌落邊緣用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌落的生長速度、大小、顏色等特征。同時，用光學顯微鏡觀察其菌絲形態(tài)，菌株是否產生分生孢子和孢子梗，拍照記錄觀察結果，進行形態(tài)學的鑒定^[15-16]。

分子生物學鑒定：從PDA培養(yǎng)基上挑取培養(yǎng)約7 d的菌絲，利用Simgen Plant DNA提取試劑盒提取病原菌的DNA。用rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTC￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣G￣ATATGC-3′）和葡萄孢屬特異性引物G3PDH正向引物（￣5￣′￣-￣A￣T￣T￣G￣A￣C￣A￣T￣C￣G￣T￣C￣G￣C￣T￣G￣T￣C￣A￣ACGA-3′）/G3PDH反向引物（5′-ACCCCACTCGTTGTCGTACCA-3′）進行PCR擴增，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。擴增產物送至北京擎科生物科技股份有限公司測序，將獲得的堿基序列與GenBank數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中與葡萄孢相關的內部轉錄間隔區(qū)（ITS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（G3PDH）堿基序列進行比對，下載葡萄孢屬內各近緣種模式菌株和參考菌株的目的堿基序列，利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，確定病原菌的種類^[17-19]。

1.2.3 蠶豆赤斑病病原菌的致病性測定 根據柯赫氏法則，采用活體葉片菌餅接種法進行病原菌的致病性測定^[20]。選取6～7葉期第3～4葉位葉片，刺傷，用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種于刺傷葉片上，以接種PDA培養(yǎng)基的葉片作為對照，在人工氣候箱25 ℃黑暗培養(yǎng)，每隔24 h觀察并記錄葉片的發(fā)病情況，這期間噴水并用加濕器保濕。待接種葉片發(fā)病后，對接種病葉進行病原菌的再次分離，比較分離出來的菌株與原菌株形態(tài)是否一致^[21]。

1.2.4 蠶豆赤斑病病原菌的生物學特性測定 溫度對菌絲生長的影響：將病原菌轉接在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)5～7 d。用直徑9 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種至新的PDA培養(yǎng)基中央，分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃條件下黑暗培養(yǎng)^[22]。5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。

光照對菌絲生長的影響：用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種至PDA培養(yǎng)基上，將平板置于25 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)。將3個人工氣候箱設置成3種光照條件，分別為24 h連續(xù)光照、12 h光照+12 h黑暗和24 h連續(xù)黑暗^[23]。5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。

pH對菌絲生長的影響：用1 mol/L的HCl溶液和1 mol/L的NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH調節(jié)為5、6、7、8、9和10。用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種至不同pH的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)^[24]。5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。

碳源、氮源對菌絲生長的影響：用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，分別接種至碳源為蔗糖、葡萄糖、乳糖和麥芽糖的察氏培養(yǎng)基上，采用同樣的方法將菌餅分別接種至氮源為酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨、甘氨酸和蛋白胨的察氏培養(yǎng)基上，以缺碳源和氮源的察氏培養(yǎng)基作為對照，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)^[25]。5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。

培養(yǎng)基對菌絲生長的影響：用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，分別接種至PDA、CZ、OMA和WA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)^[26]。5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。

1.2.5 蠶豆赤斑病抑菌藥劑的篩選 抑菌藥劑初篩：配制9種化學藥劑（10.0%多抗霉素可濕性粉劑、75.0%百菌清可濕性粉劑、70.0%甲基硫菌靈可濕性粉劑、80.0%波爾多液可濕性粉劑、10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、12.5%腈菌唑乳油、24.0%腈苯唑懸浮劑、3.0%甲霜口惡霉靈水劑、2.0%苦參堿水劑）母液，將藥劑與PDA培養(yǎng)基按體積比1∶9制成含藥PDA培養(yǎng)基，藥劑最終質量濃度為1 000 mg/L。用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，分別接種至含不同農藥的PDA培養(yǎng)基上，以接種至含等體積無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對照，25 ℃黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，測量菌落直徑，每種藥劑重復3次。觀察病原菌生長是否受到抑制，選擇有抑制效果的化學藥劑進行進一步的質量濃度篩選試驗。

抑菌藥劑復篩：將對赤斑病病原菌有抑制效果的化學藥劑進行梯度稀釋，將藥劑與PDA培養(yǎng)基按體積比1∶9配制不同質量濃度的PDA培養(yǎng)基，藥劑最終質量濃度為250.0 mg/L、100.0 mg/L、10.0 mg/L、1.0 mg/L和0.1 mg/L。接種菌餅，以含無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照，25 ℃黑暗培養(yǎng)。5 d后，測量菌落直徑，每種藥劑每個質量濃度各重復3次。通過DPS軟件計算各藥劑處理對菌絲生長的抑制率和毒力回歸方程、半數效應濃度（EC50）和相關系數^[27-28]。

2 結果與分析

2.1 蠶豆赤斑病的病害癥狀

蠶豆赤斑病病原菌早期主要侵染蠶豆葉片，發(fā)病初期葉片上出現紅褐色小斑點，后來逐漸擴大，形成圓形或橢圓形的病斑。病斑中間略凹陷，周圍稍隆起，病健交界處明顯。嚴重時，病斑處葉片表皮破裂或者病斑擴大合并，葉片變黑、枯萎，導致落葉（圖1A、圖1B）。

2.2 病原菌的分離和致病性

從病健交界處分離蠶豆赤斑病的病原菌，得到1株疑似菌株，命名為VFL39。將該菌株活體接種到蠶豆葉片，接種2 d后，葉片開始出現黑色的病斑，隨著接種天數的增加，病斑逐漸擴大至葉片邊緣，最終葉片變黑、枯萎（圖1C），而接種PDA培養(yǎng)基的葉片未出現任何病斑（圖1D）。從接種后的發(fā)病葉片上重新分離病原菌，得到與原接種病原菌形態(tài)學特性一致的病原菌。因此，通過柯赫氏法則，確定VFL39是蠶豆赤斑病的病原菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學特征 在25 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)，蠶豆赤斑病病原菌VFL39菌落初期呈現白色，菌絲絨毛狀，不易挑起（圖2A），約7 d后菌絲開始變黃。培養(yǎng)約15 d開始有菌核產生，排列較規(guī)則，呈同心環(huán)狀排列，菌核的形狀大小不一，呈球形或橢球形（圖2B），20 d后，菌核開始變褐變黑，25 d后菌核已完全變黑，菌核個數150～200個/皿（圖2C）。VFL39在PDA培養(yǎng)基上菌絲為二叉型（圖2D），產生很少量的分生孢子，分生孢子淺褐色，長棒狀（圖2E）。形態(tài)學觀察發(fā)現，VFL39的形態(tài)特征與葡萄孢屬的擬蠶豆葡萄孢、卡羅萊納葡萄孢以及核盤菌屬的核盤菌類似。

2.3.2 多基因序列分析 將菌株VFL39的ITS堿基序列提交至GenBank數據庫中進行比對，并構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現其屬于葡萄孢屬，但無法與某個具體的菌株聚為一支（圖3A）。將VFL39的G3PDH堿基序列提交至GenBank進行比對并構建進化樹，發(fā)現其與模式菌株B. fabiopsis BroadbeanBC-2聚為一支（圖3B）。因此，結合形態(tài)學特征和多基因序列分析結果，最終將VFL39鑒定為擬蠶豆葡萄孢（B. fabiopsis）。

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 不同溫度對病原菌生長的影響 由圖4A可知，5～30 ℃的條件下病原菌菌絲能生長，35 ℃以上的高溫條件下病原菌菌絲不能生長，10 ℃以下病原菌菌絲生長非常緩慢。隨著溫度的升高，菌絲的生長速度呈現先升高后降低的趨勢。在25 ℃時，菌絲的生長速度最快，培養(yǎng)5 d，菌落直徑達到63.00 mm（圖4A）；溫度低于25 ℃，菌絲生長速度顯著降低，20 ℃培養(yǎng)5 d，直徑為28.33 mm；溫度高于25 ℃，菌絲生長速度降低更為顯著，30 ℃培養(yǎng)5 d，菌落直徑僅為6.83 mm。因此，該菌株對溫度比較敏感，最適宜的生長溫度為25 ℃左右，溫度偏高或偏低均會嚴重影響其生長。

2.4.2 不同光照條件對病原菌生長的影響 圖4B顯示，在3種光照條件下，病原菌菌絲均能生長。在12 h光照+12 h黑暗條件下，生長速度最快，培養(yǎng)5 d，菌落直徑達到68.67 mm；其次為24 h連續(xù)黑暗條件，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為52.83 mm；24 h連續(xù)光照條件下，菌絲生長速度最慢，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為39.17 mm。因此，最適宜該菌株生長的光照條件是12 h光照+12 h黑暗。

2.4.3 不同pH對病原菌生長的影響 由圖4C可知，pH為5～10的條件下，病原菌菌絲均能生長，且差異不顯著。在5～10的pH范圍內，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為43.83～49.17 mm（圖4C）。因此，該菌株對pH不敏感。

2.4.4 不同碳源、氮源對病原菌生長的影響 由圖4D可知，在4種碳源條件下，病原菌菌絲均能生長，在無碳條件下，菌絲也能生長。以不加碳源的培養(yǎng)基作為對照，在4種供試碳源中，菌株對葡萄糖的利用效果最好，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為22.50 mm（圖4D）；菌株對麥芽糖和蔗糖的利用效果均不好，與無碳條件差異不顯著。因此，最適宜該菌株生長的碳源為葡萄糖。

由圖4E可知，在6種氮源條件下，病原菌菌絲均能生長，在無氮條件下，菌絲也能生長。以不加氮源的培養(yǎng)基作為對照，在6種供試氮源中，菌株對酵母膏、牛肉膏和硫酸銨的利用效果最好，培養(yǎng)5 d，菌落直徑分別為56.67 mm、56.00 mm和55.83 mm（圖4E）；菌落對其他氮源的利用效果均不好，與無氮條件差異不顯著，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為7.83～10.17 mm。因此，適宜該菌株生長的氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨。

2.4.5 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響 由圖4F可知，在4種培養(yǎng)基上，病原菌菌絲均能生長。在PDA培養(yǎng)基上，菌絲的生長速度最快，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為54.00 mm；其次為OMA培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為43.50 mm；在CZ和WA培養(yǎng)基上，菌絲生長速度無顯著差異，培養(yǎng)5 d，直徑分別為27.33 mm和25.50 mm。因此，最適宜該菌株生長的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

2.5 病原菌抑菌藥劑的室內篩選

藥劑初篩試驗結果表明，9種化學藥劑中有2種對赤斑病病原菌幾乎無抑制效果，分別為10.0%多抗霉素可濕性粉劑和80.0%波爾多液可濕性粉劑。另外7種化學藥劑中，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對病原菌的抑制效果最好，EC50lt;1.000 0 mg/L；24.0%腈苯唑懸浮劑、12.5%腈菌唑乳油和75.0%百菌清可濕性粉劑對病原菌的抑制效果次之，1.000 0 mg/Llt;EC50lt;5.000 0 mg/L；其次為70.0%甲基硫菌靈可濕性粉劑，5.000 0 mg/Llt;EC50lt;10.000 0 mg/L；3.0%甲霜口惡霉靈水劑的抑制效果最差，EC50gt;10.000 0 mg/L（表1）。

3 討論

赤斑病是世界各地蠶豆最主要的病害之一，蠶豆葡萄孢是最早發(fā)現的致病菌，其次是灰葡萄孢^[29]。擬蠶豆葡萄孢最早是在中國湖北省被發(fā)現的^[11]，后來在中國其他省份及其他國家也發(fā)現了擬蠶豆葡萄孢能引起蠶豆赤斑病^[30-32]。不同蠶豆產區(qū)的不同蠶豆品種，引起赤斑病的病原菌也有所不同。黃燕等^[30]發(fā)現甘肅省、青海省、江蘇省、四川省、河北省、重慶市的蠶豆赤斑病是由蠶豆葡萄孢、灰葡萄孢、擬蠶豆葡萄孢引起的，但在安徽省、湖北省僅分離到灰葡萄孢^[33]。馬生彪等^[7]發(fā)現甘肅省渭源縣的蠶豆赤斑病是由蠶豆葡萄孢引起的，未發(fā)現另外2種病原菌。喻敏博^[12]在青海省不僅發(fā)現了上述3種主要赤斑病病原菌，還分離出另外6種病原菌。本研究在江蘇省南通市吳窯鎮(zhèn)僅鑒定出擬蠶豆葡萄孢1種病原菌，其原因可能是蠶豆病樣僅來自吳窯鎮(zhèn)1個試驗點的1個蠶豆品種，病原菌的分離范圍和數量較小所致。

研究病原菌的生物學特性有助于了解病害的發(fā)生規(guī)律及其與環(huán)境之間的關系，從而便于在實際生產中通過控制環(huán)境條件減少病害的發(fā)生。本研究結果表明，擬蠶豆葡萄孢菌絲在5～30 ℃能夠生長，最適生長溫度為25 ℃，這與張靜^[15]對湖北省擬蠶豆葡萄孢的生物學特性研究結果一致。擬蠶豆葡萄孢菌絲在pH為5～10范圍內也均能正常生長，且生長速度無顯著差異，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨。本研究在pH和碳/氮源上的研究結果與張靜^[15]對湖北省擬蠶豆葡萄孢的生物學特性研究結果存在差異，這可能是采集病樣的品種及生長區(qū)域不同導致的。有研究結果表明，擬蠶豆葡萄孢的生長溫度范圍和pH范圍比蠶豆葡萄孢廣，且致病力較強^[15]，其對蠶豆的危害可能會進一步加重，在今后的蠶豆田間生產中要重視對擬蠶豆葡萄孢引起的赤斑病的防治。

抑菌藥劑室內篩選試驗結果表明，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對擬蠶豆葡萄孢的抑制效果最好?？鄥A水劑是天然植物性農藥，在生產上是一種廣譜的殺蟲劑，其對蔬菜的霜霉病、疫病、炭疽病等也有很好的防治效果，殺菌機理是抑制菌體生物合成，影響菌體的生物氧化過程。有研究結果表明，苦參堿水劑對小麥赤霉病、水稻稻瘟病和芍藥紅斑病、炭疽病、根腐病的病原菌生長均有一定的抑制作用^[34]。苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑屬于三唑類殺菌劑，其對梨黑星病、蘋果斑點落葉病、番茄早疫病、辣椒炭疽病等均有較好的防治效果，殺菌機理是抑制真菌細胞壁的合成和細胞膜的功能，從而有效抑制真菌的生長和繁殖。藥劑篩選田間試驗結果表明，80.0%代森錳鋅可濕性粉劑和75.0%的百菌清可濕性粉劑對蠶豆赤斑病的防治效果最好^[35]。在本研究中，75.0%百菌清可濕性粉劑對擬蠶豆葡萄孢也有抑制效果，但不如2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑效果明顯，這可能是由室內試驗和田間試驗的環(huán)境差異導致?？鄥A水劑是植物源農藥，苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑也是三唑類殺菌劑中毒性較低的一種，對環(huán)境友好，可以安全使用，但本研究僅為室內篩選結果，還需進行相關的田間試驗以便在生產上推廣應用。

4 結論

江蘇省南通市蠶豆赤斑病的病原菌為擬蠶豆葡萄孢（Botrytis fabiopsis）。該病原菌菌絲最適生長溫度為25 ℃，最適光照條件為12 h光照+12 h黑暗，對pH不敏感，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。室內抑菌藥劑篩選結果表明，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對病原菌的抑制效果最好，在今后的田間生產中可用于蠶豆赤斑病的化學防治。

參考文獻：

[1] ZHOU R， HYLDGAARD B， YU X Q， et al. Phenotyping of faba beans （Vicia faba L.） under cold and heat stresses using chlorophyll fluorescence[J]. Euphytica，2018，214（4）：68.

[2] DHULL S， KIDWAI M K， NOOR R， et al. A review of nutritional profile and processing of faba bean （Vicia faba L.）[J]. Legume Science，2022，4（3）：e129.

[3] 李仁慧，閆智臣，段廷玉. 蠶豆真菌病害及其研究進展[J]. 草業(yè)科學，2019，36（8）：1976-1987.

[4] WAKOYA F， ABDISSA T， DUGASA A. Epidemics of chocolate spot （Botrytis fabae Sard.） disease on faba bean （Vicia faba L.） at Shambu and Guduru，Western Oromia，Ethiopia[J]. Indian Phytopathology，2021，74（8）：625-631.

[5] WUBSHET M L， CHALA A. Management of faba bean chocolate spot （Botrytis fabae） through varieties and fungicide application frequencies in Southern Tigray，Ethiopia[J]. Archives of Phytopathology and Plant Protection，2021，54（17/18/19/20）：2233-2246.

[6] MENGESHA G G， TEREFE H， CHELEKO D C. Progression of chocolate spot （Botrytis fabae） and grain yield of faba bean as influenced by integration of fungicide rate and host resistance in Southern Ethiopia[J]. Journal of Crop Science and Biotechnology，2022，25（1）：73-90.

[7] 馬生彪，王 立，蔣晶晶，等. 蠶豆赤斑病病原菌分離鑒定及生物學特性研究[J]. 西北農業(yè)學報，2021，30（11）：1724-1732.

[8] OGILVIE L， MUNRO M. Occurrence of Botrytis fabae Sardia in England[J]. Nature，1947，159（4055）：96.

[9] YOU M P， YANG H A， SIVASITHAMPARAM K， et al. A new leaf blight disease of Trifolium dasyurum caused by Botrytis fabae[J]. European Journal of Plant Pathology，2009，123（1）：99-103.

[10]JIN M J， YANG C D， WEI L J， et al. First report of Botrytis cinerea causing gray mold on Astragalus membranaceus in China[J]. Plant Disease，2022，5：106.

[11]ZHANG J， WU M D， LI G Q， et al. Botrytis fabiopsis，a new species causing chocolate spot of broad bean in central China[J]. Mycologia，2010，102（5）：1114-1126.

[12]喻敏博. 青海省蠶豆赤斑病病原菌的種類鑒定及抗性資源篩選[D]. 西寧：青海大學，2022.

[13]TIAN F H， LI C T， LI Y. First report of Penicillium brevicompactum causing blue mold disease of Grifola frondosa in China[J]. Plant Disease，2017，101（8）：1549.

[14]劉 瑜，魏彩霞，周世興，等. 天山野果林塞威士蘋果和短距鳳仙花葉斑病病原真菌的鑒定[J]. 植物保護學報，2019，46（2）：345-351.

[15]張 靜. 湖北省灰霉病病菌區(qū)系和灰葡萄孢菌多樣性研究[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2010.

[16]李培謙，馮寶珍，趙燕飛，等. 芍藥紅斑病病原菌鑒定、生物學特性及有效藥劑篩選[J]. 核農學報，2023，37（8）：1533-1541.

[17]CHEN X R， LIU B B， XING Y P， et al. Identification and characterization of Phytopythium helicoides causing stem rot of Shatangju mandarin seedlings in China[J]. European Journal of Plant Pathology，2016，146：715-727.

[18]KUMAR S， STECHER G， LI M， et al. MEGA X：molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms[J]. Molecular Biology and Evolution，2018，35（6）：1547-1549.

[19]高 飛，謝 源，潘 鑫，等. 2019-2020年河南省小麥莖基腐病病原菌鑒定及致病力測定[J]. 植物保護學報，2023，50（2）：298-305.

[20]李培謙，藥 震，馮寶珍，等. 克倫生葡萄內生菌Acremonium sclerotigenum的分離鑒定及致腐能力研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2022，48（15）：131-136.

[21]汪漢成，黃 宇，黃 洋，等. 煙草葉斑病病原菌的鑒定及其生物學特性[J]. 植物保護學報，2023，50（3）：757-766.

[22]許 蓉，劉正慧，付永平，等. 靈芝蛛網病病原菌及其生物學特性[J]. 菌物學報，2019，38（5）：669-678.

[23]席中剛，游景茂，鄭 露，等. 湖北省黃連葉斑病病原鑒定及其生物學特性[J]. 植物保護學報，2018，45（2）：315-321.

[24]劉 俏，寧楠楠，馬永強，等. 青海省櫻桃葉斑病菌生物學特性及室內藥劑毒力測定[J]. 植物保護，2021，47（3）：136-143，176.

[25]陶 航，扎依娜·瑪合巴提，張 燁，等. 芍藥黑斑病病原菌鑒定及其對殺菌劑敏感性分析[J]. 園藝學報，2021，48（1）：173-182.

[26]薛彩英，武海燕，馬慶周，等. 河南省草莓棒孢葉斑病病原菌鑒定及其生物學特性[J]. 植物保護學報，2023，50（2）：402-412.

[27]袁瀟瀟，彭科琴，趙志博，等. 貴州省黑皮雞樅蛛網病病原菌的鑒定及其生物學特性分析和防控藥劑篩選[J]. 植物保護學報，2023，50（3）：780-790.

[28]王秋萍，吳小毛，龍友華，等. 甘藍灰霉病防治藥劑篩選及田間應用[J]. 東北農業(yè)科學，2021，46（4）：43-46.

[29]BILKISS M， SHIDDIKY M J A， FORD R. Advanced diagnostic approaches for necrotrophic fungal pathogens of temperate legumes with a focus on Botrytis spp.[J]. Frontiers in Microbiology， 2019， 1：1889.

[30]黃 燕，段燦星，陸 鳴，等. 蠶豆赤斑病病原菌鑒定[J]. 植物保護，2012，38（6）：115-118.

[31]FAN X， ZHANG J， YANG L， et al. Development of PCR-based assays for detecting and differentiating three species of Botrytis infecting broad bean[J]. Plant Disease，2015，99（5）：691-698.

[32]BANKINA B， STODDARD F L， KANEPS J， et al. Botrytis four species are associated with chocolate spot disease of faba bean in Latvia[J]. Zemdirbyste-Agriculture，2021，108（4）：297-302.

[33]黃 燕. 蠶豆赤斑病病原菌的鑒定及抗性資源篩選[D]. 秦皇島：河北科技師范學院， 2012.

[34]李 麗. 山東地區(qū)芍藥病害調查及主要真菌性病害的病原鑒定[D]. 泰安：山東農業(yè)大學，2014.

[35]湯云霞，桑芝萍，趙 健. 不同藥劑防治蠶豆赤斑病田間藥效試驗[J]. 上海農業(yè)科技，2018（1）：91-93.

（責任編輯：陳海霞）