摘 要：本文采用高效液相色譜-柱后衍生法中光化學(xué)衍生測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量。結(jié)果表明，樣品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量分別為（0.873±0.039） μg·kg-1、（0.227±0.011） μg·kg-1、（0.811±0.054） μg·kg-1和（0.214±0.014） μg·kg-1，（k=2）。通過(guò)系統(tǒng)分析整個(gè)測(cè)定過(guò)程的影響因素，評(píng)估不確定度來(lái)源，對(duì)各個(gè)不確定度分量進(jìn)行評(píng)定，可以看出對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較大的是測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度，而對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較小的是樣品稱量、樣品處理后所定容的體積和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）；不確定度；黃曲霉毒素；食品

Uncertainty Evaluation for The Measurement of Aflatoxins in Foods Using High Performance Liquid Chromatography with Post Column Photochemical Derivatization

LI Junwei， LU Dixun， SU Junmei， YANG Jing， CHEN Hanfeng， LIU Chunli*

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： High performance liquid chromatography （HPLC）-post column photochemical derivatization was used to determine the content of aflatoxins B1， B2， G1， G2 in food. The results indicate that when the contents of aflatoxins B1， B2， G1 and G2 in the test samples are （0.873±0.039） μg·kg-1， （0.227±0.011） μg·kg-1，（0.811±0.054） μg·kg-1 and

（0.214±0.014） μg·kg-1， （k=2）， respectively. By systematically analyzing the influencing factors throughout the determination process， assessing the sources of uncertainty， and evaluating each component of uncertainty， it was found that the measurement repeatability and the uncertainty introduced by the preparation of standard solutions have a significant impact on the measurement results， while the impact of sample weighing， the volume after sample treatment and final volume， and the fitting of the standard curve on the measurement results is relatively minor.

Keywords： high performance liquid chromatography （HPLC）; uncertainty; aflatoxins; food

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是一類具有相似結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，它們是自然界中發(fā)現(xiàn)的理化性質(zhì)較穩(wěn)定的一類霉菌毒素。它們的分子量在312～346，熔點(diǎn)在200～300 ℃。黃曲霉毒素在水中、乙醚、己烷和石油醚中難以溶解，但易溶于甲醇、乙醇、乙腈和氯仿等有機(jī)溶劑。黃曲霉毒素對(duì)光、熱和酸穩(wěn)定，具有耐熱性，因此傳統(tǒng)的加熱處理對(duì)其破壞很小，其只在熔點(diǎn)溫度下才會(huì)分解。黃曲霉毒素在中性溶液、弱酸性溶液中非常穩(wěn)定，在pH值為1～3的酸性溶液中略有分解，在pH值為9～10的堿性溶液中會(huì)迅速分解，成為接近無(wú)毒的鹽，但這種分解反應(yīng)是可逆的，即在酸性條件下可以復(fù)原[1]。

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等霉菌代謝產(chǎn)生的一類強(qiáng)效生物毒素，它們會(huì)對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，特別是對(duì)肝臟和腎臟的損害尤為顯著。黃曲霉毒素常見(jiàn)類型根據(jù)毒性大小排列依次為B1、M1、G1、B2和G2，其中B1被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)分類為I類致癌物。黃曲霉毒素可以在農(nóng)作物生長(zhǎng)、收獲、干燥、加工和儲(chǔ)存中的任何階段污染食物，因此大豆、花生、大米、玉米和食用植物油等農(nóng)產(chǎn)品很容易被黃曲霉毒素污染，從而直接進(jìn)入食物鏈。人們食用被黃曲霉毒素污染的食品可導(dǎo)致急性中毒，引起肝臟壞死和出血，長(zhǎng)期慢性中毒可誘發(fā)肝癌。由于黃曲霉毒素的高毒性和穩(wěn)定性，它們?cè)谌蚴称钒踩腿祟惤】殿I(lǐng)域被重點(diǎn)關(guān)注[2-3]。

測(cè)量不確定度是表征測(cè)量結(jié)果可信程度的一個(gè)參數(shù)，它反映了測(cè)量結(jié)果的可變性或分散性。評(píng)定測(cè)量結(jié)果的不確定度，有助于發(fā)現(xiàn)測(cè)量過(guò)程中的主要誤差來(lái)源，進(jìn)而可以采取適當(dāng)?shù)拇胧?，以提升測(cè)量的準(zhǔn)確性和可信度。本實(shí)驗(yàn)按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》

（GB 5009.22—2016）[4]第三法高效液相色譜-柱后衍生法中光化學(xué)衍生測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量，遵循《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[5]的方法程序，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)估，旨在提升測(cè)量結(jié)果的可信度與準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈，均為色譜純，德國(guó)默克公司；氯化鈉、氯化鉀，均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、吐溫-20，均為分析純，德國(guó)默克公司；黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國(guó)羅默實(shí)驗(yàn)室公司；水符合《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/T 6682—2008）中規(guī)定的一級(jí)水。

Waters Premier 2475高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司；液相色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國(guó)安捷倫公司；XP205 Mettler Toledo分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；Pribolab KRC光化學(xué)衍生器，青島普瑞邦生物工程有限公司；IKA LAB DANCER S25渦旋混合器，德國(guó)艾卡公司；Milli-Q? IQ 7000超純水系統(tǒng)，德國(guó)默克公司；QSC-12T氮吹儀，上海雙旭電子有限公司；Agela Technologies BAC09001-3-X免疫親和柱，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》（GB 5009.22—2016）第三法高效液相色譜-柱后衍生法中的前處理要求進(jìn)行。

1.2.2 色譜條件

流動(dòng)相：A相為水（68%）；B相為甲醇-乙腈（50+50）（32%），等度洗脫；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：50 μL；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.2.3 數(shù)學(xué)模型

樣品中黃曲霉毒素的計(jì)算公式為

（1）

式中：Xi為樣品中黃曲霉B1、B2、G1或G2的含量，μg·kg-1；P為樣品中黃曲霉B1、B2、G1和G2根據(jù)外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃度，ng·mL-1；V1為試樣提取液體積，mL；V2為樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，mL；V3為用于免疫親和柱的分取樣品體積，mL；V4為濾液的定容體積，mL；

V5為用于定容的提取液體積，mL；m為樣品稱樣質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別通過(guò)色譜儀進(jìn)樣分析后得到對(duì)應(yīng)峰面積，用最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，擬合得到直線方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

校準(zhǔn)曲線為A=bc+a，則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為

（2）

（3）

式中：s為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；b為回歸直線方程的斜率；a為回歸直線方程的截距；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)；p為用于計(jì)算樣品溶液濃度c0的測(cè)定次數(shù)；c0為由擬合校準(zhǔn)曲線求得的樣品溶液的平均濃度，ng·mL-1；Aj為校準(zhǔn)時(shí)第j次的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；cj為校準(zhǔn)時(shí)第j次的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng·mL-1；為標(biāo)準(zhǔn)工作液的平均濃度，ng·mL-1。

由AFTB1校準(zhǔn)曲線計(jì)算得出6次樣品平均濃度為c0=1.133 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得出s=6 722.15；=72.6；b=1 204 497.64；a=-1 686.152，則AFTB1 c0引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB1 c0引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

根據(jù)AFTB2校準(zhǔn)曲線計(jì)算得出6次樣品平均濃度為c0=0.294 4 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得出s=6 050.48；=4.6；b=2 474 866.22；a=4 550.51，則AFTB2 c0引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB2 c0引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

根據(jù)AFTG1校準(zhǔn)曲線計(jì)算得出6次樣品平均濃度為c0=1.052 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得出s=3 208.32；=73.3；b=434 189.25；a=

2 287.88，則AFTG1 c0引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG1 c0引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

根據(jù)AFTG2校準(zhǔn)曲線計(jì)算得出6次樣品平均濃度為c0=0.277 4 ng·mL-1；由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得出s=3 677.58；=4.6；b=1 152 564.81；a=3 135.37，則AFTG2 c0引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG2 c0引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度評(píng)定。黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度及擴(kuò)展不確定度如表2所示。其中，包含因子k=2，為B類評(píng)定，各組分標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB1：

AFTB1：

AFTG1：

AFTG2：

根據(jù)各組分濃度，得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB1：

AFTB2：

AFTG1：

AFTG2：

表2 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度及擴(kuò)展不確定度

組分 濃度/（μg·mL-1） 擴(kuò)展不確定度/（μg·mL-1）

AFTB1 2.00 0.03

AFTB2 0.504 0.007

AFTG1 2.01 0.03

AFTG2 0.504 0.007

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程量器校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。①標(biāo)準(zhǔn)工作液配制中使用了50 mL單標(biāo)線容量瓶，準(zhǔn)確度A級(jí)，按照《常用玻璃量器》（JJG196—2006）[6]的要求，容量允差為±0.050 mL，依照三角分布考慮，k=，計(jì)算容量允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（V1）=0.020 4 mL，則容量允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V1）=0.000 408。②使用0.5 mL移液器，根據(jù)移液器的校準(zhǔn)證書(shū)，擴(kuò)展不確定度為0.003（k=2），則移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V2）=0.001 5。量器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[7]。溫差變化會(huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。從量具生產(chǎn)商提供的信息可知，該量具在20 ℃處有校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室的溫度變化在±3 ℃，要想估算溫差對(duì)不確定度的影響，需要考慮溫度范圍和體積膨脹系數(shù)。乙腈的體積膨脹系數(shù)是1.37×10-3 ℃-1，按照溫度變化是矩形分布的設(shè)定來(lái)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度。根據(jù)表3數(shù)據(jù)計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，AFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2 樣品稱量m引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

分析天平供應(yīng)商提供的稱量誤差為±0.08 mg，假設(shè)是矩形分布，樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

樣品的稱重m=5 000 mg，則樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 樣品處理后的總體積V引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.1 體積校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品稱取后加入40 mL乙腈水溶液振蕩提取，過(guò)濾后取10 mL定容至50 mL。再取20 mL過(guò)免疫親和柱，氮吹至干后加入0.4 mL定容液復(fù)溶。根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG196—2006），同時(shí)容量瓶按三角分布考慮，移液管按矩形分布考慮，由此估算體積校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，見(jiàn)表4。

2.3.2 溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

從量具生產(chǎn)商提供的信息可知，量具在20 ℃處有校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室的溫度變化在±3℃。乙腈的體積膨脹系數(shù)是1.37×10-3 ℃-1，按照溫度變化是矩形分布的設(shè)定來(lái)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見(jiàn)表5。

綜上，樣品處理后黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的總體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為

2.4 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性主要取決于實(shí)驗(yàn)人員在樣品處理上的統(tǒng)一性，樣品自身的均勻性和儀器的性能。這類不確定度歸類為A類，通過(guò)同一樣品重復(fù)測(cè)試進(jìn)行評(píng)估。黃曲霉毒素重復(fù)性檢測(cè)見(jiàn)表6。

AFTB1的單次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差按sx=

公式計(jì)算，sx=0.042 4。

AFTB1測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB1測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB2測(cè)量重復(fù)性引入的單次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差sx=0.011 8，則AFTB2測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB2測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG1的單次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差sx=0.062 7，AFTG1測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG1測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG2測(cè)量重復(fù)性引入的單次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差sx=0.015 5，AFTG2測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG2測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

AFTB1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度各分量匯總見(jiàn)表7，AFTB2、AFTG1、AFTG2標(biāo)準(zhǔn)不確定度各分量匯總方式和合成同AFTB1，下文不再贅述。

AFTB1的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB2的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG1的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTG2的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

AFTB1：uc（X）=urel（X）×=0.022 6×0.873=0.019 73 μg·kg-1

AFTB2：uc（X）=urel（X）×=0.024 1×0.227=0.005 471 μg·kg-1

AFTG1：uc（X）=urel（X）×=0.033 6×0.811=0.027 25 μg·kg-1

AFTG2：uc（X）=urel（X）×=0.032 0×0.214=0.006 848 μg·kg-1

2.6 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子得到擴(kuò)展不確定度，依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，當(dāng)置信概率設(shè)定為95%，包含因子k=2，所以食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量測(cè)定的擴(kuò)展不確定度為

AFTB1：U=uc（X）×k=0.019 73×2=0.039 μg·kg-1

AFTB2：U=uc（X）×k= 0.005 471×2=0.011 μg·kg-1

AFTG1：U=uc（X）×k=0.027 25×2=0.054 μg·kg-1

AFTG1：U=uc（X）×k= 0.006 848×2=0.014 μg·kg-1

2.7 測(cè)量不確定度結(jié)果

食品中AFTB1測(cè)量結(jié)果為（0.873±0.039） μg·kg-1，

k=2。

食品中AFTB2測(cè)量結(jié)果為（0.227±0.011） μg·kg-1，

k=2。

食品中AFTG1測(cè)量結(jié)果為（0.811±0.054） μg·kg-1，

k=2。

食品中AFTG2測(cè)量結(jié)果為（0.214±0.014） μg·kg-1，

k=2。

3 結(jié)論

應(yīng)用高效液相色譜-柱后衍生法中光化學(xué)衍生測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量，通過(guò)系統(tǒng)分析整個(gè)測(cè)定過(guò)程的影響因素，評(píng)估不確定度來(lái)源，對(duì)各個(gè)不確定度分量予以評(píng)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較大的是測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的不確定度，而對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較不明顯的是樣品的稱量、樣品處理后所定容的體積、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。所以，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可以通過(guò)適當(dāng)增加平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)、充分混勻樣品、選用精度高且允差小的量具量器配制標(biāo)準(zhǔn)溶液等手段降低不確定度，提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。

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