摘 要：目的：建立超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）同時測定飲品中鞣花酸和野漆樹苷含量的方法。方法：采用Waters Acquity BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（10∶90，V/V），流速為0.4 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長分別為254 nm

（鞣花酸）和203 nm（野漆樹苷）。結(jié)果：鞣花酸和野漆樹苷在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.998 5和0.999 5，平均加標(biāo)回收率分別在95.01%～104.59%和96.49～104.51%，均符合要求。結(jié)論：該方法便捷、可靠、重復(fù)性好，適用于測定飲品中鞣花酸和野漆樹苷的含量。

關(guān)鍵詞：飲品；鞣花酸；野漆樹苷；超高效液相色譜法（UPLC）

Establishment of UPLC Method for Determining the Content of Ellagic Acid and Rhoifolin in Drinks

YAN Fangliang， LI Yuzhen

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： Objective： To establish a ultra performance liquid chromatography （UPLC） method for simultaneous determination of ellagic acid and rhoifolin content in drink. Method： Waters Acquity BEH C18 liquid chromatography column （2.1 mm×50 mm， 1.7 μm） was used， and the mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid aqueous solution （10∶90， V/V）， the flow rate was 0.4 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was 254 nm （ellagic acid） and 203 nm， respectively. Result： The linear relationships of ellagic acid and aracin were good in their respective concentration ranges， and the correlation coefficients were 0.998 5 and

0.999 5， respectively. The average recoveries were from 95.01% to 104.59% and from 96.49% to 104.51%， respectively，" which met the requirements. Conclusion： The method is convenient， reliable and reproducible， and is suitable for the determination of ellagic acid and rhoifolin in drinks.

Keywords： drink; ellagic acid; rhoifolin; ultra performance liquid chromatography （UPLC）

鞣花酸，別名并沒食子酸和胡頹子酸，是一種含有多酚結(jié)構(gòu)的化合物[1]，存在于葡萄、草莓、石榴等水果以及核桃等堅果中[2]。鞣花酸具有抗氧化的作用，能延緩皮膚的衰老[3-5]，因此被廣泛應(yīng)用于各種具有保健作用的食品和化妝品中[6]。

野漆樹苷，又名芹菜素-7-O-β新橙皮糖苷，是一種黃酮苷類化合物，存在于蕓香科柑橘屬的植物或中藥材（枳實、山香圓、化橘紅、柚葉）中，一些糧食作物中也有存在[7]。目前，已有研究報道野漆樹苷具有抗氧化、抗炎、降血壓、壯骨、神經(jīng)保護、降糖、抗癌和抗病毒等多種生理功能[8-10]。

當(dāng)前，市售飲品中已有包含鞣花酸和野漆樹苷兩種成分的產(chǎn)品。鞣花酸或野漆樹苷含量的檢測方法主要包括近紅外光譜法[11]、高效液相色譜法

（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[12-15]和超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）等，而同時檢測兩種成分的方法還未見報道?；诖耍疚慕PLC法同時檢測飲品中鞣花酸和野漆樹苷含量的方法，以便更好監(jiān)控飲品中有效成分的質(zhì)量水平，也為鞣花酸和野漆樹苷的質(zhì)量研究提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

H-Class液相色譜儀（配備TUV紫外檢測器），美國沃特世公司；XS205分析天平（精確至0.1 mg），瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 材料與試劑

供試品（活妍飲品），市售。

鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究所；野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究所；乙腈、甲酸（色譜級），德國默克公司；PVDF針頭式過濾器（0.22 μm），美國密理博公司。

1.3 色譜條件

Waters Acquity BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-0.1甲酸水溶液（10∶90，V/V）；流速：0.4 mL·min-1；進樣體積：2 μL；檢測波長：鞣花酸為254 nm，野漆樹苷為203 nm；柱溫：30 ℃。

1.4 供試品溶液的配制

精密稱定供試品1.0 g，用50%二甲基亞砜甲醇溶液（V/V）于5 mL容量瓶中定容至刻度線，即得濃度為0.2 g·mL-1的供試品溶液。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制

分別稱取適量的鞣花酸和野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)品，加入二甲基亞砜溶解，配成濃度為1.0 mg·mL-1的鞣花酸和野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

移取一定量的鞣花酸和野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液至合適的容量瓶中，用50%二甲基亞砜甲醇溶液（V/V）定容，得到鞣花酸和野漆樹苷混合工作溶液。鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為9.68 mg·L-1、

15.50 mg·L-1、38.70 mg·L-1、96.80 mg·L-1、194.00 mg·L-1及387.00 mg·L-1；野漆樹苷濃度分別為5.26 mg·L-1、8.42 mg·L-1、21.00 mg·L-1、52.60 mg·L-1、105.00 mg·L-1及210.00 mg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

分別在波長為190～400 nm對制備的鞣花酸和野漆樹苷樣品進行光譜掃描，根據(jù)所得光譜圖可知鞣花酸樣品最大吸收波長在254 nm左右，野漆樹苷樣品最大吸收波長在203 nm左右。因此，選擇254 nm和203 nm作為兩種樣品的檢測波長。

2.1.2 柱溫的選擇

設(shè)計實驗配制6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照1.3項色譜條件分別在不設(shè)置柱溫以及柱溫為30 ℃、35 ℃、40 ℃的條件下進樣檢測。結(jié)果顯示，在不同柱溫條件下，目標(biāo)峰面積的保留時間不同，且隨著柱溫的增高，組分的保留時間前移；在同一濃度、不同柱溫條件下，組分的峰面積相差不大，且濃度與峰面積線性關(guān)系良好；當(dāng)不設(shè)置柱溫時，組分的保留時間隨實驗室環(huán)境溫度變化而改變，可能會對檢測的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。綜上，選擇柱溫為30 ℃進行后續(xù)實驗。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶劑的選擇

二甲基亞砜能很好地溶解鞣花酸或野漆樹苷，也被稱為“萬能溶媒”[16]。在配制標(biāo)準(zhǔn)工作液時，分別用50%二甲基亞砜水溶液（V/V）、50%二甲基亞砜甲醇溶液（V/V）和二甲基亞砜作為稀釋溶劑進行進樣檢測。結(jié)果顯示，檢測鞣花酸時，采用二甲基亞砜作為稀釋溶劑線性相關(guān)性最好，其次為50%二甲基亞砜甲醇溶液（V/V）；檢測野漆樹苷時，采用50%二甲基亞砜甲醇溶液（V/V）作為稀釋溶劑時線性相關(guān)性最好，其次為二甲基亞砜。綜合考慮成本和實驗操作的方便性，選擇用50%二甲基亞砜甲醇溶液（V/V）作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶劑。

2.3 優(yōu)化條件下鞣花酸和野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)品及供試樣品的測定

按照上述優(yōu)化后的條件，采用高效液相色譜法對鞣花酸和野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)品及供試樣品分別進行測定，其色譜圖如圖1所示。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品在30 min內(nèi)都能實現(xiàn)良好的分離，基線噪聲較小且峰型良好，在目標(biāo)峰附近沒有出現(xiàn)溶劑干擾和其他干擾峰，表明優(yōu)化后的色譜條件可行性良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以峰面積為縱坐標(biāo)（y），以鞣花酸和野漆樹苷的濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鞣花酸回歸方程為y=28 418 953x-296 017（R2=0.998 5），野漆樹苷回歸方程為y=18 500 100x+43 186（R2=0.999 5），表明鞣花酸和野漆樹苷在濃度分別為9.68～387.00 mg·L-1和5.26～210.00 mg·L-1時具有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 檢出限和定量限

稱取適量供試品，按照方法要求制備樣品溶液，使用50%二甲基亞砜甲醇溶液（V/V）稀釋適當(dāng)倍數(shù)，選取信噪比（S/N）=3時，作為該方法的檢出限；信噪比（S/N）=10時，作為該方法的定量限。經(jīng)計算，本方法中鞣花酸的檢出限為0.002 mg·g-1，定量限為0.007 mg·g-1；野漆樹苷的檢出限為0.013 mg·g-1，定量限為0.043 mg·g-1。

2.4.3 精密度實驗

移取1.5項中混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，用0.22 μm有機濾膜過濾至液相樣品瓶中，按照1.3項色譜條件依次進樣6次，記錄峰面積，計算鞣花酸和野漆樹苷相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所示。由表中結(jié)果可知，鞣花酸和野漆樹苷相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.62%和0.65%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

稱取適量供試品，按照方法要求制備樣品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h及24 h進樣，檢測并記錄峰面積，檢測樣品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果如表2所示。鞣花酸和野漆樹苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.27%和1.96%，表明該樣品溶液在0～24 h較為穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗

稱取適量供試品，按照方法要求制備樣品溶液，進行6次平行實驗，進樣檢測飲品中鞣花酸和野漆樹苷的含量，計算結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，飲品中鞣花酸和野漆樹苷含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.89%、0.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加標(biāo)回收實驗

稱取適量供試品，按照方法要求制備樣品溶液，分別在低、中、高3個水平進行加標(biāo)實驗，每個水平重復(fù)測定3次，計算回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，鞣花酸和野漆樹苷加標(biāo)回收率符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求。

2.5 實際樣品測定

取3批市售飲品，檢測鞣花酸和野漆樹苷含量，結(jié)果如表5所示。結(jié)果顯示，飲品中鞣花酸含量在0.294～0.389 mg·mL-1，平均值為0.327 mg·mL-1，野漆樹苷含量在0.378～0.401 mg·mL-1，平均值為0.386 mg·mL-1，該結(jié)果均符合產(chǎn)品限值要求。

3 結(jié)論

本文建立了UPLC法同時測定飲品中鞣花酸和野漆樹苷含量的方法。結(jié)果表明，鞣花酸和野漆樹苷在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法樣品前處理簡單，儀器條件設(shè)計合理，方法精密準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于檢測飲品中鞣花酸和野漆樹苷的含量。

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