關(guān)鍵詞:海稻86;HD-ZIP Ⅰ;基因克??;生物信息學(xué);亞細(xì)胞定位;表達(dá)分析
中圖分類號(hào):S511:Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2024)11-0021-07
土壤鹽堿化是一個(gè)全球性問題,影響到約200/0的灌溉土地,并大大降低作物產(chǎn)量。受鹽影響的土壤通常分為鹽漬土、堿土和鹽堿土。鹽漬土中不含鈉,但含有大量的可溶性鹽,對(duì)大多數(shù)作物的生長(zhǎng)有不利影響:堿土中鈉離子水平升高,由于某些物理過程(粘土的消化、膨脹和分散)和特定條件(表面結(jié)殼和硬化)而表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)性問題,危害植物生長(zhǎng);鹽堿土中可溶性鹽和鈉離子含量高,在耕作時(shí)會(huì)形成大塊而阻礙水分流動(dòng),導(dǎo)致作物水分分布和生長(zhǎng)不良。
HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子是同源異型盒蛋白家族成員,由同源異型結(jié)構(gòu)域(Homeodomain.HD)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(Leucine zipper,LZ)兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成,根據(jù)序列保守性和功能性質(zhì),分為HD-ZIP Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)亞家族。DNA通過結(jié)合HD-ZIP蛋白亮氨酸拉鏈基序LZ結(jié)構(gòu)域來實(shí)現(xiàn)與其互作,HD-ZIP Ⅰ蛋白可與含CAAT(A/T)ATTG雙重對(duì)稱基序的DNA結(jié)合,HD-ZIPⅡ蛋白優(yōu)先選擇結(jié)合CAAT(C/G) ATTG基序,HD-ZIPⅢ蛋白優(yōu)先識(shí)別GTAAT(G/C) ATTAC序列,而CATT(A/T)AATG基序是DNA與HD-ZIPⅣ蛋白結(jié)合所必需的核心元件。各亞家族由于結(jié)構(gòu)的差異,在植物中發(fā)揮的調(diào)控功能和表達(dá)模式也不同。其中,HD-ZIP Ⅰ亞家族蛋白結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單,不與其他家族成員含有共同的結(jié)構(gòu)域或基序。多項(xiàng)研究表明,HD-ZIP Ⅰ亞家族參與調(diào)節(jié)植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)干旱、鹽堿、寒冷和重金屬脅迫的耐受性。關(guān)于HD-ZIP Ⅰ亞家族基因響應(yīng)植物鹽脅迫的研究已有報(bào)道。沉默鷹嘴豆CaHD212基因,植株對(duì)鹽脅迫的敏感性增加,基因在根和莖組織中表達(dá)量均明顯升高;在芥藍(lán)中過表達(dá)擬南芥AtHDG11基因,可誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉,增強(qiáng)植株耐鹽能力201;Zhang等在純合水稻植株OsHOX22基因啟動(dòng)子中插入T-DNA,發(fā)現(xiàn)突變體在苗期對(duì)鹽脅迫的耐受性明顯增強(qiáng)。表明HD-ZIP Ⅰ亞家族在植物響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
鹽脅迫為典型的非生物脅迫之一,嚴(yán)重制約著作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。水稻對(duì)鹽敏感,挖掘耐鹽水稻種質(zhì)資源,解析水稻耐鹽遺傳機(jī)制和分子機(jī)制,可為培育耐鹽水稻新品種奠定良好理論基礎(chǔ)。同時(shí),對(duì)最大化地利用鹽堿地土壤資源、提高土地利用效率、改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。海稻86是一種耐鹽性強(qiáng)的種質(zhì)資源,其生理機(jī)制和關(guān)鍵耐鹽基因尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)海稻86中OsHDZ1基因進(jìn)行克隆及相關(guān)生物信息學(xué)分析,以期為后續(xù)培育抗鹽脅迫品種提供基因資源。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
植物材料為本氏煙草和海稻86種子,均為本實(shí)驗(yàn)室留存。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;2×Rapid Taq Master Mix酶、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司:大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101(PSoup+P19)購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司;載體pNC-Green-SubC、Nimble Cloning試劑盒購(gòu)自海南壹田生物科技有限公司:多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2材料處理
2022年9月8日,將海稻86的種子平整、均勻地散布于濕潤(rùn)濾紙上,28℃培養(yǎng)2~3d,待長(zhǎng)出根后轉(zhuǎn)移至含有霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液的植物水培盒中,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)生長(zhǎng)7d,培養(yǎng)條件:濕度60%,溫度30℃,14 h光照/10 h黑暗。于2022年9月18日開始鹽脅迫處理,用200mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行培養(yǎng),并分別于處理后0、6、15、24、60、72 h取植株地上部分,經(jīng)液氮速凍后保存至超低溫冰箱備用。
1.3RNA提取及cDNA合成
取-80℃保存的葉片經(jīng)液氮研磨成粉末狀,參照多糖多酚總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。將提取得到的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察RNA的質(zhì)量和完整性,并利用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度,隨后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅢlst Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)說明書,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,得到的產(chǎn)物保存至-20℃冰箱。
1.4基因克隆及載體構(gòu)建
將前期保存的cDNA取出作為模板,根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)http://rice.uga.edu/中LOC_Os04g45810的序列,設(shè)計(jì)特異性引物Os HDZl-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物具體序列見表1。反應(yīng)體系:模板cDNA1.0μL,正向引物1.0μL,反向引物1.0μL,2x Taq Master Mix 12.5μL,ddH20 9.5μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min;95℃15s,60℃15s,72℃30 s,72℃5 min,共33個(gè)循環(huán)。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增產(chǎn)物,并按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書對(duì)目的條帶進(jìn)行純化回收。利用Nimble Cloning試劑盒將回收得到的DNA產(chǎn)物連接到亞細(xì)胞定位載體pNC-Green-SubC上,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10中,涂布至抗性平板后于37℃下培養(yǎng)過夜,通過菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆,測(cè)序驗(yàn)證正確后,提取質(zhì)粒并保存至-20℃冰箱。
1.5生物信息學(xué)分析方法
利用NCBI BLAST中的CD-search功能查找OsHDZ1的保守結(jié)構(gòu)域,并獲取其他物種中HD-ZIP蛋白的同源序列信息,使用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析:通過TBtools分析并可視化Os HDZ1基因結(jié)構(gòu);通過在線網(wǎng)站SOMPA、TM-HMM分析目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu):利用SWISS-MODEL在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析;利用Netphos進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè);使用Ex-PASy-ProtParam獲得其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)信息。
1.6亞細(xì)胞定位
將保存的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101(PSoup+P19),通過瞬時(shí)表達(dá)法將農(nóng)桿菌菌液注射至煙草表皮細(xì)胞,隨后將煙草置于26℃、14h光照/10 h黑暗的條件下培養(yǎng)48~72 h,利用FluoViewTM FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光在煙草細(xì)胞中的分布情況。
1.7基因表達(dá)分析
提取鹽脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)海稻86樣品的RNA,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,水稻Actin基因?yàn)閮?nèi)參,設(shè)計(jì)引物qRT-OsHDZ1-F/R、OsActin-F/R(表1)檢驗(yàn)OsHDZ1在鹽脅迫下的表達(dá)譜。熒光定量PCR的反應(yīng)體系20.0μL:2× ChamQ Univer-sal SYBR qPCR Master Mix 10.0μL,上、下游引物各0.4μL,cDNA模板2.0μL,ddH20 7.2μL。使用儀器:Mx3005P熒光定量PCR儀(上海吉泰生物科技有限公司)。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30s;95℃10s,60℃30s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),采用2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。
2結(jié)果與分析
2.1OsHDZ1的克隆及編碼蛋白特征分析
以海稻86葉片cDNA為模板,通過引物Os-HDZl-F、Os HDZl-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得約800bp的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示,目的基因編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)度為831bp,編碼276個(gè)氨基酸,命名為OsHDZ1基因。蛋白分子量為30.65 kDa,理論等電點(diǎn)為5. 19,為酸性蛋白;平均親水性為-0.714,為親水性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)為66.6,為不穩(wěn)定蛋白。
2.2 OsHDZl生物信息學(xué)分析
通過PlantCARE網(wǎng)站對(duì)OsHDZ1基因啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),除了TATA-box和CAAT-box等真核基因啟動(dòng)子的特征序列元件,還存在較多與激素、環(huán)境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件,包括特異性厭氧誘導(dǎo)元件(GC-motif,CCCCCG),分生組織表達(dá)順式調(diào)控元件(CAT-box,GCCACT)以及脫落酸(ABRE,ACGTG、CACGTG、CGCACGTGTC)、茉莉酸(CGT-CA-motif,CGTCA;TGACG-motif,TGACG)調(diào)控響應(yīng)元件等(圖2),說明Os HDZ1基因可能參與多種脅迫過程的調(diào)控。
對(duì)OsHDZl蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3A)顯示,OsHDZl在第73~127位和第129~164位氨基酸處分別含有HD結(jié)構(gòu)域和LZ結(jié)構(gòu)域,證明克隆得到的轉(zhuǎn)錄因子屬于HD-ZIP家族成員。此外,基因結(jié)構(gòu)組成信息(圖3B)顯示,OsHDZ1有2個(gè)外顯子,說明可能存在可變剪接。
對(duì)OsHDZ1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果(圖4A)顯示,OsHDZ1蛋白中包括42.03%的α-螺旋、7.97%的B-轉(zhuǎn)角、10.14%延伸鏈以及39.86%無規(guī)則卷曲。通過在線軟件SWISS-MODE預(yù)測(cè)OsHDZ1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4B),結(jié)果與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果保持一致。
利用NetPhos在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsHDZ1蛋白有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)(17個(gè)絲氨酸、5個(gè)蘇氨酸和3個(gè)酪氨酸),并存在多個(gè)蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)(圖SA);對(duì)OsHDZ1蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè),結(jié)果(圖5B)顯示OsHDZ1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,為非分泌蛋白。
從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他已知物種的HD-ZIP蛋白序列,與OsHDZ1蛋白序列進(jìn)行同源性分析(圖6),發(fā)現(xiàn)OsHDZ1與禾本科植物彎葉畫眉草(Er-agrostis curvula)的HD-ZIP蛋白(TVU15031.1)氨基酸序列同源性最高,為61.13%。此外,與小麥(Tritic-um aestivum,XP_044320230.1)和野生二粒小麥(Triti-cum dicoccoides,XP_037486551.1)同源性也較高,均為59.87%。表明海稻86 OsHDZ1蛋白與小麥HD-ZIP蛋白親緣關(guān)系近,基因功能可能更相似。
2.3 OsHDZl蛋白亞細(xì)胞定位分析
將構(gòu)建好的pNC-Green-SubC-OsHDZ1載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染本氏煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察GFP熒光信號(hào),發(fā)現(xiàn)pNC-Green-SubC-OsHDZl在細(xì)胞核上發(fā)出特異綠色熒光信號(hào)(圖7),表明OsHDZl蛋白定位于細(xì)胞核。
2.4 OsHDZ1基因表達(dá)量分析
為了解析OsHDZ1在海稻應(yīng)答鹽脅迫過程中的功能,利用熒光定量PCR分析OsHDZ1在鹽脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果(圖8)表明,隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),Os HDZ1表達(dá)量逐漸上升,在60 h達(dá)到最高,約是Oh表達(dá)水平的10.07倍。72 h時(shí)表達(dá)量下降,但仍顯著高于Oh。推測(cè)OsHDZ1的表達(dá)受鹽脅迫的持續(xù)誘導(dǎo),在響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
3討論與結(jié)論
鹽堿化是影響土地質(zhì)量的重要因素之一,為困擾全世界的生態(tài)問題,對(duì)生態(tài)結(jié)構(gòu)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等造成極大的破壞。我國(guó)鹽堿化土地占全國(guó)可耕地面積的五分之一,主要分布于北方地區(qū),土地鹽堿化導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)吸收差,生長(zhǎng)發(fā)育停滯而產(chǎn)量大幅下降。培育耐鹽堿作物對(duì)于有效利用鹽堿地土壤資源,改善生態(tài)環(huán)境具有重要戰(zhàn)略意義。
作為高等植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,HD-ZIP家族根據(jù)其序列保守性和功能特性,進(jìn)一步分為HD-ZIP Ⅰ~Ⅳ4個(gè)亞家族,大量研究表明HD-ZIP Ⅰ主要參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng),如鹽脅迫。近年來關(guān)于HD-ZIP家族參與鹽脅迫響應(yīng)的研究也逐漸深入。沉默SlHB2的番茄,在鹽脅迫條件下,葉片中葉綠素和水含量較高,失水率和丙二醛含量較低,從而提高了植株對(duì)鹽脅迫的耐受性;Wang等對(duì)玉米進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的鹽處理,qRT-PCR結(jié)果顯示,ZmHDZ1表達(dá)量呈下降趨勢(shì),進(jìn)一步在水稻中過表達(dá)ZmHDZ1,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性不如野生型植株,表明Zm-HDZ1參與鹽脅迫調(diào)控:陸地棉Gh HB1基因在1% NaCl脅迫下的表達(dá)活性顯著提高,同樣表明GhHB1基因參與鹽脅迫反應(yīng)。這些結(jié)果表明HD-ZIP Ⅰ亞家族在植物抗鹽脅迫中具有重要調(diào)控作用。海稻86是一種重要的耐鹽堿水稻種質(zhì)資源,探究其耐鹽機(jī)制對(duì)于耐鹽作物的培育具有重要的意義。
本研究克隆了HD-ZIP Ⅰ亞家族基因Os-HDZ1,并對(duì)其進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明,Os-HDZ1基因CDS全長(zhǎng)為831 bp,編碼276個(gè)氨基酸,且含有HD結(jié)構(gòu)域和LZ結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位分析顯示OsHDZ1蛋白定位于細(xì)胞核,屬于核蛋白,符合轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控功能的特點(diǎn)。利用熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),OsHDZ1在海稻86植株中的表達(dá)量逐漸上升,在60 h達(dá)到最高點(diǎn),之后逐漸下降,但整體呈上調(diào)趨勢(shì),說明Os HDZ1基因在海稻響應(yīng)鹽脅迫過程中起重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果可為后續(xù)深入解析HD-ZIP應(yīng)答鹽脅迫的分子機(jī)制奠定良好的理論基礎(chǔ),具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。