摘要：新建一種采用HPLC–RID，同時測定銀杏葉中奎寧酸、莽草酸含量的方法，評價不同樹齡和采摘期對銀杏葉中2種物質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明：銀杏葉中奎寧酸和莽草酸分別在0～250.00 μg/mL和0～121.76 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：Y=108.83X-182.19（r=0.993 0）和Y=132.125X+0.19（r=0.999 2），平均回收率分別為99.47%和99.40%，RSD分別為0.94%和1.32%。三年生、四年生銀杏葉中奎寧酸和莽草酸含量較其他樹齡的高，分別達77.39～58.57 mg/g和76.80～52.37 mg/g；4—5月采摘的銀杏葉中奎寧酸和莽草酸含量較其他采摘月份高，分別達70.35～72.91 mg/g和71.06～72.44 mg/g。綜合可知新方法重復性好、操作簡便、快速穩(wěn)定、易于普及，同時能有效測定銀杏葉中奎寧酸和莽草酸含量，且探明了奎寧酸和莽草酸的工業(yè)生產(chǎn)最優(yōu)原料為三年生、四年生及4—5月采摘的銀杏葉。

關(guān)鍵詞：銀杏葉；奎寧酸；莽草酸； HPLC–RID；樹齡；采摘月份

中圖分類號：R917 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）11-0072-04

Effects of Different Tree Ages and Harvesting Months on the Content of Quinic Acid and Shikimic Acid in Ginkgo biloba Leaves

WANG Qiu-ping1，LI Jun2，HE Jun2，LEI Yang1，ZHANG Cheng3，YANG Bang-zhu1，SONG Shan-min1

（1. Department of Food and Medicine， Guizhou Vocational College of Agriculture， Qingzhen 551400， PRC; 2. Research Center of Biochemistry Engineering of Guizhou Province， Guizhou University， Guiyang 550025， PRC; 3. School of Public Health，

Guizhou Medical University， Guiyang 550000， PRC）

Abstract： A HPLC-RID method was established to determine the content of quinic acid and shikimic acid in Ginkgo biloba leaves， and the effects of different tree ages and harvesting months on their content were evaluated. The results showed that quinic acid and shikimic acid had good linear relationships within the ranges of 0-250.00 μg/mL and 0-121.76 μg/mL， with the regression equations of Y=108.83X-182.19 （r=0.993 0） and Y=132.125X+0.19 （r=0.999 2）， average recovery of 99.47% and 99.40%， and RSD of 0.94% and 1.32%， respectively. Moreover， the content of quinic acid and shikimic acid in the leaves of 3 to 4-year-old G. biloba was higher than that in the plants of other years old， reaching 77.39-58.57 mg/g and 76.80-52.37 mg/g， respectively. In addition， the content of quinic acid and shikimic acid in G. biloba leaves harvested from April to May was higher than that harvested in other months， reaching 70.35-72.91 mg/g and 71.06-72.44 mg/g， respectively. A method for simultaneous determination of quinic acid and shikimic acid in G. biloba leaves was established in this study， with good repeatability， simple operation， short determination time， reliable results， and easy popularization. Furthermore， this study proved that the optimal raw materials for industrial production of quinic acid and shikimic acid were leaves from G. biloba of 3 to 4 years old and harvested from April to May.

Key words： Ginkgo biloba leaves; quinic acid; shikimic acid; HPLC-RID; tree ages; harvesting month

銀杏（Ginkgo biloba L.）是一種古老的裸子植物，是我國珍稀的植物資源[1-2]。銀杏葉富含多種活性物質(zhì)，按藥理活性作用主要成分有銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、有機酸類、酚類和聚戊烯醇類等[3-4]，其中奎寧酸和莽草酸均為有機酸類的一種[5-9]，是流感治療藥物磷酸奧司他韋（Oseltamivir phosphate）的合成原料[10-15]。由于銀杏葉隨著生長周期的變化和氣候差異，所含物質(zhì)可能會發(fā)生分解或富集，從而導致奎寧酸含量存在差別，又由于奎寧酸與莽草酸在銀杏葉中共生，且采用同一方法可同時得出兩者含量。因此，筆者針對不同年生長周期、不同采摘期銀杏葉，建立新方法同時測定銀杏葉奎寧酸、莽草酸含量，并評價不同生長年周期和采摘期對奎寧酸和莽草酸含量的影響，旨在為提高銀杏葉藥理成分綜合利用度，降低各產(chǎn)品的綜合生產(chǎn)成本，增強銀杏生產(chǎn)廠的市場競爭力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和藥劑

試驗儀器有分析型HPLC，1100 series（Agilent Technology，U.S）；Agilent C18柱色譜柱（大連依利特分析儀器有限公司）；BSA124S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]等。

試驗藥劑包括D–（–）–奎寧酸對照品（GC≥98%）和莽草酸對照品（HPLC≥98%），均購于北京萬佳首化生物科技有限公司；甲醇（色譜純，德國MWE–CK）；磷酸（分析純，成都金山化學試劑有限公司）；娃哈哈純凈水（貴陽娃哈哈昌盛飲料有限公司）；其他試劑均為分析純。為確保試驗不受其他因素的干擾，試驗所用的銀杏葉均于4—9月采摘自貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學南校區(qū)（均為實生苗，樹齡1～8年，即一至八年生）。采用五點取樣法取樣，樣品置于60℃烘箱烘干粉碎備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測器選擇 參考現(xiàn)有文獻報道，采用HPLC–UV檢測器對于奎寧酸的含量進行檢測。試驗配制相同濃度的奎寧酸標準溶液，分別采用UV和RID 2種檢測器進行測定。對比發(fā)現(xiàn)，在條件相同的情況下，UV檢測器所得響應(yīng)值低，RID檢測器的響應(yīng)值高，兩者響應(yīng)值相差千倍。響應(yīng)值低對于含量測定所帶來誤差較大，因此采用RID可避免由于響應(yīng)值低而對檢測帶來的誤差。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.4%磷酸水∶甲醇（99∶1，v/v）；流速：0.80 mL/min；柱溫：35℃；示差檢測器，進樣量10 μL，樣品上機前過0.45 μm微孔濾膜。

1.2.3 對照品溶液的制備 （1）奎寧酸對照品溶液。精密稱定奎寧酸對照品12.5 mg，置于50 mL容量瓶中，加適量水溶解，定容，混勻，制得濃度為250.00 μg/mL的奎寧酸對照品溶液。

（2）莽草酸對照品溶液。精密稱定7.61 mg莽草酸對照品置于50 mL容量瓶中，加水溶解，定容，混勻，得到濃度為152.20 μg/mL的莽草酸對照品溶液。

（3）混合對照品溶液：取0.124 mg/mL的D–奎寧酸標準溶液0.5 mL，0.096 04 mg/mL的莽草酸標準溶液0.5 mL混勻制成混標。

1.2.4 供試品溶液制備 通過“五點取樣法”采摘的銀杏葉樣品置于60℃烘箱干燥24 h，粉碎混勻。精密稱定1.00 g于具塞試管中，加水10 mL，水浴超聲30 min，取1 mL續(xù)濾液稀釋至10 mL，再將稀釋后的溶液過0.45 μm微濾膜，注入進樣小瓶，即得供試品溶液。

1.2.5 方法學考察 （1）專屬性試驗。取奎寧酸、莽草酸對照品溶液進行測定，記錄色譜圖。

（2）線性關(guān)系考察。奎寧酸標準曲線：分取0、2.4、4、6和8 mL的250.00 μg/mL奎寧酸標準儲備液于10 mL試管中，加水稀釋至刻度線，混勻，得到濃度為0、60.00、100.00、150.00和200.00 μg/mL的奎寧酸溶液。莽草酸標準曲線：莽草酸標準工作液：分取0、1.6、3.2、4.8和8.0 mL的152.20 μg/mL莽草酸標準儲備液于10 mL試管中，加水稀釋至刻度線，混勻，得到濃度為0、24.4、48.7、73.1和121.76"μg/mL的莽草酸溶液。采用HPLC–RID進行檢測，進樣量為10 μL ，按同一色譜條件在HPLC上進樣分析并記錄色譜圖，以奎寧酸、莽草酸的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行回歸分析。

（3）重復性試驗。供試品溶液按色譜條件重復進樣6次，按標準曲線法計算奎寧酸、莽草酸含量及RSD值。

（4）穩(wěn)定性試驗。精密吸取供試品溶液，在同一色譜條件，于0、2、4、8、12和24 h分別進樣，記錄色譜圖，按標準曲線法計算奎寧酸、莽草酸含量及RSD值。

（5）精密度試驗。精密吸取奎寧酸、莽草酸對照品溶液，在同一色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，按標準曲線法計算奎寧酸、莽草酸含量及RSD值。

（6）回收率試驗。用供試品溶液取續(xù)濾液6份。2份精密加入對照品溶液1 mL（含奎寧酸146.96 μg、含莽草酸177.28 μg）；2份精密加入對照品溶液1 mL（含奎寧酸183.70 μg、含莽草酸221.6 μg）；2份精密加入對照品1 mL（含奎寧酸220.44 μg、含莽草酸265.92 μg）。在同一色譜條件分別進樣、測定，記錄色譜圖，求得平均回收率和RSD值。

1.2.6 銀杏葉樣品中奎寧酸、莽草酸含量測定 將不同生長年周期、不同采摘月份銀杏葉樣品配制的供試品溶液，在同一色譜條件下分別精密量取10 μL，上機測定，按標準曲線法計算含量，即公式（1），奎寧酸（莽草酸）標準溶液峰面積與濃度的線性關(guān)系即可計算出奎寧酸（莽草酸）的含量。

奎寧酸（莽草酸）含量（mg/g）= [C標×A樣×V×0.98]/（A標×m）" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " （1）

其中，C標為奎寧酸（莽草酸）對照品的質(zhì)量濃度（mg/mL）；A樣為樣品中奎寧酸（莽草酸）的峰面積；V為提取液體積（mL）；0.98為奎寧酸（莽草酸）對照品的純度；A標為奎寧酸（莽草酸）對照品的峰面積；m為樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜

取10 μL混合對照品注入儀器進行分析，如圖1所示，奎寧酸的出峰時間為4.024 min，莽草酸的出峰時間為4.961 min，兩者互不干擾。

2.2 方法學考察

（1）線性關(guān)系考察。奎寧酸回歸方程為Y=108.83X-182.19，r=0.993 0，線性范圍為0～250.00 μg/mL，表明本法建立的回歸方程相關(guān)性良好；莽草酸回歸方程為Y=132.125X+0.19，r=0.999 2，線性范圍為0～121.76 μg/mL，表明本法建立的回歸方程相關(guān)性良好。

（2）重復性試驗。奎寧酸RSD值為0.17%、莽草酸RSD值為0.19%，結(jié)果表明該方法重復性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗?？鼘幩?RSD值為1.51%、莽草酸RSD值為1.72%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

（4）精密度試驗?？鼘幩酭SD值為0.17%、莽草酸RSD值為0.98%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

（5）回收率試驗。結(jié)果如表1所示。

2.3 不同樹齡銀杏葉奎寧酸含量測定

為確保試驗不受其他因素的干擾，分析不同樹齡的銀杏葉時均使用7、8月采摘所得樣品，在同樣操作條件下對銀杏葉中奎寧酸含量進行測定，得出含量最高、最佳采摘樹齡的銀杏葉。由表2可看出，一至三年生銀杏葉中奎寧酸和莽草酸含量隨樹齡增加而增加，其中奎寧酸含量從43.83 mg/g增加至77.39 mg/g，莽草酸含量從39.47 mg/g增加至58.57 mg/g；四至八年生銀杏葉中奎寧酸和莽草酸含量呈整體下降趨勢，其中奎寧酸含量從76.80 mg/g降低至18.37 mg/g，莽草酸含量從52.37 mg/g降低至22.16 mg/g；綜合考慮，三、四年生銀杏葉中奎寧酸和莽草酸含量較其他年生長周期的高，可分別達77.39和58.57 mg/g、及76.80和52.37 mg/g，建議工業(yè)選取三至四年生銀杏葉作為奎寧酸和莽草酸的最佳提取原料葉。

2.4 不同采摘月份銀杏葉中奎寧酸含量測定

由表3可知，當4—5月采摘時，奎寧酸和莽草酸含量最高，分別達70.35～72.91 mg/g和71.06～72.44 mg/g。6—9月采摘銀杏葉中奎寧酸和莽草酸含量降低，其中9月采摘銀杏葉中奎寧酸含量低至25.97 mg/g，莽草酸含量低至31.20 mg/g。因此建議工業(yè)上選取采摘月份為4—5月的銀杏葉作為奎寧酸和莽草酸的生產(chǎn)原料。

3 討論與結(jié)論

（1）綜合可知，新建了采用HPLC–RID同時對奎寧酸、莽草酸進行含量測定的方法，色譜條件為：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.4%磷酸水∶甲醇（99∶1，v/v）；柱溫：35℃；流速：0.80 mL/min；進樣量：10 μL。采用RID可避免由于響應(yīng)值低而對檢測帶來的誤差。

（2）對8種不同樹齡、6種不同采摘月份的銀杏葉中奎寧酸、莽草酸的含量檢測，得出樹齡三至四年生，4—5月采摘的60℃烘干銀杏葉作為奎寧酸和莽草酸的生產(chǎn)原料最合適，為提高銀杏葉藥理成分的綜合利用度，增強銀杏生產(chǎn)廠的市場競爭力和打開新市場提供參考。

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（責任編輯：肖彥資）