摘要" 為探討呂梁黑豬BACE2基因特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)，本研究采用PCR技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行克隆，并對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)開(kāi)展生物信息學(xué)分析，分析內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，以及互作關(guān)系；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，研究BACE2基因在呂梁黑豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和脂肪組織中的表達(dá)情況。生物信息學(xué)結(jié)果顯示，該黑豬BACE2基因的編碼序列大?。–DS）為1 545"bp，包含514個(gè)氨基酸；BACE2蛋白是一種疏水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽，具有明顯的跨膜作用，是一種非分泌型的蛋白質(zhì)；序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)呂梁黑豬同山羊、牛親緣關(guān)系較近，同家鼠親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲（49.03%）、α-螺旋（18.48%）、延伸連（27.24%）和β-轉(zhuǎn)角（5.25%）構(gòu)成，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（55.6 %）。qPCR 結(jié)果顯示，其腎臟組織中BACE2基因的表達(dá)水平最高，肌肉組織中的表達(dá)量最低。研究結(jié)果揭示了BACE2蛋白擁有的多種獨(dú)特屬性及BACE2基因的分布特點(diǎn)，為該蛋白更深層次的科學(xué)探究提供參考。

關(guān)鍵詞" 呂梁黑豬；BACE2基因；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)" S85"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A"""""" 文章編號(hào)" 1007-7731（2024）22-0043-07

DOI號(hào)" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.22.010

基金項(xiàng)目 山西省教育科學(xué)“十四五”規(guī)劃課題“高質(zhì)量教育體系下高校動(dòng)醫(yī)專業(yè)基礎(chǔ)課程實(shí)驗(yàn)數(shù)字化教學(xué)探索與實(shí)踐”（SZH-230078）。

作者簡(jiǎn)介 楊梓杰（2003—）男，山西太原人，從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。

通信作者 趙丹（1986—），男，山西太原人，碩士，講師，從事動(dòng)物生物化學(xué)研究。

收稿日期 2024-08-07

Cloning and expression analysis of BACE2 gene in Lyuliang black pig

YANG Zijie""" ZHANG Jin""" ZHAO Dan

（Jinzhong College of Information， Taigu 030800， China）

Abstract" In order to investigate the characteristics and structure of the BACE2 gene in Lyuliang black pigs， the BACE2 gene was cloned by PCR technology，and the encoded protein was analyzed by bioinformatics， including physical and chemical properties， signal peptide， hydrophobicity， transmembrane structure， sequence alignment， secondary and tertiary structure prediction， subcellular localization， and interaction. The expression of the BACE2 gene in the heart， liver， spleen， lung， kidney， muscle and adipose tissue of this pigs was measured by real-time quantitative PCR. The results of bioinformatics showed that the coding sequence （CDS） of BACE2 gene size was 1 545"bp， containing 514"amino acids. BACE2 protein is a hydrophobic protein， no signal peptide， has obvious transmembrane function， and is a non-secretory protein. Sequence alignment showed that the pig had a close genetic relationship with goat and cattle， and the furthest genetic relationship with Mus musculus. The secondary structure of the protein was composed of random curl （49.03%）， α-helix （18.48%）， extension link （27.24%） and β-corner （5.25%）， mainly distributed in the endoplasmic reticulum （55.6%）.qPCR results showed that the expression level of BACE2 gene was the higher in kidney tissue and the lower in muscle tissue of this pigs. The results revealed a variety of unique properties of BACE2 protein and the distribution characteristics of BACE2 gene， which provided a reference for further scientific exploration of this protein.

Keywords" Lyuliang black pigs; BACE2 gene; bioinformatics

豬是一種脊椎動(dòng)物，也是雜食類哺乳動(dòng)物。由于品種的不同，其體貌特征也各不相同，通常以耳大、頭長(zhǎng)、四肢短小、鼻直、身體肥壯和腰背窄為主要形體特征[1]。呂梁黑豬是引進(jìn)生豬進(jìn)行自繁自養(yǎng)得到的品種，其全身體毛黑色、結(jié)構(gòu)勻稱、四肢健壯，頭型稍長(zhǎng)，額部有橫行皺紋，具有肉質(zhì)鮮美、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)[2]。BACE2（Beta-site app-cleaving enzyme 2，BACE2）是BACE1的同源物，是一種θ分泌酶，也是一種條件性β分泌酶，其能夠水解β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）產(chǎn)生β淀粉樣蛋白（Amyloid-β peptide，Aβ）[3]。在體外，發(fā)現(xiàn)BACE2是一種特別活躍的Aβ降解蛋白酶（Aβ-degrading proteases，AβDP），其催化效率超過(guò)了除胰島素降解酶（Insulin degrading enzymes，IDE）以外的已知的 AβDPs[3]，是治療或預(yù)防阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）的一種強(qiáng)有力的候選藥物。謝建等[4]研究表明，敲除BACE2可抑制細(xì)胞侵襲、遷移和腫瘤生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)BACE2可促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖。王會(huì)志[5]通過(guò)BACE2激活NF-κB通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)BACE2在膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色，敲低BACE2可減弱膠質(zhì)瘤侵襲遷移及增殖能力，是治療該疾病的潛在靶點(diǎn)。

目前，將呂梁黑豬作為研究對(duì)象的相關(guān)研究相對(duì)較少，在其肌肉發(fā)育和脂肪沉積中，BACE2基因的作用機(jī)制有待進(jìn)行充分研究。因此，對(duì)其BACE2基因的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，有助于深入理解該物種在遺傳層面的特性，尤其是在肌肉發(fā)育和脂肪沉積等性狀方面。本研究采用PCR技術(shù)對(duì)BACE2基因進(jìn)行克隆，并對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)開(kāi)展生物信息學(xué)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，研究BACE2在呂梁黑豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、肌肉和脂肪組織中的表達(dá)情況，為BACE2蛋白更深層次的科學(xué)探究提供參考，為該豬種的保種和改良工作提供分子生物學(xué)層面的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在山西呂梁萊蕪黑豬養(yǎng)殖基地，挑選3頭體質(zhì)強(qiáng)健的呂梁黑豬作為試驗(yàn)對(duì)象。屠宰后，迅速采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、肌肉以及脂肪8個(gè)組織。為確保組織的完整性和活性，采集后立即放入液氮中進(jìn)行冷凍保存。隨后，將組織樣本運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)移至-80"℃冰箱中，備用。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

PCR儀（NEW VeritiPro）、電泳儀（GH600E）、超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000），凝膠成像系統(tǒng)（Invitrogen E-Gel Power Snap G8100）；DL2000 DNA Marker、LATaq DNA聚合酶以及M-MLV反轉(zhuǎn)錄測(cè)試盒，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法提取組織的總RNA。采用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，其OD260和OD280在1.8～2.0。通過(guò)以上處理，得到一個(gè)完備且有代表性的核酸序列數(shù)據(jù)，滿足相關(guān)必要的標(biāo)準(zhǔn)后，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄測(cè)試盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品存置于-20"℃的冰箱，備用。

1.3.2 BACE2基因引物設(shè)計(jì)與合成 基于GenBank提供的BACE2基因序列（登記編號(hào)：XP 020926661.1.1），設(shè)計(jì)用于克隆和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的引物。引物序列送至西安擎科生物科技公司合成，詳情如表1所示。

1.3.3 BACE2基因的克隆與測(cè)序 PCR試驗(yàn)以呂梁黑豬肝臟組織cDNA為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25 μL，具體組成：ddH2O 8.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL（濃度10 μmol/L）。擴(kuò)增條件：首先94"℃預(yù)變性30"s；然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)98"℃變性10"s，56.02"℃退火30"s，72"℃延長(zhǎng)1"min，循環(huán)結(jié)束后72"℃延伸2"min。將產(chǎn)物保存于4"℃冰箱。為驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用高達(dá)瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行檢測(cè)，將符合預(yù)期的條帶送至西安擎科生物科技公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.4 BACE2基因的生物信息學(xué)分析 采用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序分析得到的氨基酸殘基序列及其次級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入研究，以揭示蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。使用Protparam工具，分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。在https//prosite.expasy.org網(wǎng)站查找蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究資料。采用基于密度泛函原理的策略，對(duì)蛋白質(zhì)的分子構(gòu)造與其綁定作用之間的聯(lián)系進(jìn)行初步研究。通過(guò)SignaIP軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；通過(guò)https：//web.expasy.org/protscale預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親疏水性；利用TMHMM2.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用NCBI軟件里的BLASTX工具進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性比對(duì)，利用MEGA7軟件繪制蛋白質(zhì)演變樹(shù)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)https：//predictprotein.org預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的次級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)https：//swissmodel.expasy.org預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)PSORT 在線軟件進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位?；谝陨蠑?shù)據(jù)，應(yīng)用機(jī)械學(xué)習(xí)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)，成功建立了一個(gè)以計(jì)算機(jī)模擬為核心的三維蛋白質(zhì)模型。利用在線軟件STRING對(duì)來(lái)自多個(gè)數(shù)據(jù)平臺(tái)的蛋白質(zhì)氨基酸組成及其之間的功能性關(guān)聯(lián)進(jìn)行詳細(xì)的比較分析，構(gòu)建BACE2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以8個(gè)組織的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。試驗(yàn)的反應(yīng)總體系為20 μL，詳細(xì)組分：10 μL的2× SYBR Green Pro Taq HS Premix，上游和下游引物（濃度為10 μmol/μL）各0.4 μL，cDNA模板1 μL，以及8.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序：首先進(jìn)行95"℃預(yù)變性30"s；隨后進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95"℃變性5"s，57"℃退火30"s，65"℃延伸5"s；循環(huán)結(jié)束后95"℃延伸5"min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件和2-ΔΔCt方法對(duì)qPCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BACE2基因克隆與測(cè)序

以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增該基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，目的條帶大小約為1 500"bp，符合預(yù)期（圖1）。收集測(cè)序數(shù)據(jù)后，采用DNAstar軟件中的Seqman子程序來(lái)完成序列的拼接工作。將拼接序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BACE2基因的CDS區(qū)使用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，呂梁黑豬的BACE2基因編碼區(qū)域長(zhǎng)度達(dá)到了1 545"bp?；陂_(kāi)放閱讀框（ORF Finder）的計(jì)算，這一序列被編碼為514個(gè)氨基酸。

M為DL2000 Maker。

2.2 BACE2蛋白的理化性質(zhì)

使用 Protparam 軟件分析該蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果如表2所示，BACE2蛋白的分子式C2541H3948N646O725S17、氨基酸數(shù)量為514個(gè)，其分子量為55 692.21 Da、理論等電點(diǎn)（PI）5.27，在氨基酸組分中含量最高的是亮氨酸（Leu），占總氨基酸數(shù)的11.7%，組氨酸（Cys）含量最低，占總氨基酸數(shù)的0.6%。BACE2蛋白帶正、負(fù)電荷殘基總數(shù)分別為38、45個(gè)，脂肪系數(shù)（AI）98.52、不穩(wěn)定系數(shù)（）44.41、總平均親水性指數(shù)（GRAVY）0.183。

2.3 BACE2蛋白的信號(hào)肽

信號(hào)肽的構(gòu)造可細(xì)分為3個(gè)主要部分。首先是n區(qū)（n-region），是一個(gè)富含正電荷的氨基酸序列；緊接著是疏水區(qū)（h-region），由9個(gè)以上的中性氨基酸組成，共同構(gòu)建了一個(gè)疏水性的界面；最后加工區(qū)（c-region），是信號(hào)肽酶作用的關(guān)鍵區(qū)域，負(fù)責(zé)切割信號(hào)肽，從而完成其生物學(xué)功能。

使用了SignaIP工具，對(duì)BACE2蛋白的信號(hào)肽狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)分析，該黑豬BACE2蛋白的信號(hào)肽實(shí)際上是不存在的，并且未形成跨膜的結(jié)構(gòu)。這一發(fā)現(xiàn)有利于更深入地了解該基因編碼產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置和其調(diào)節(jié)機(jī)制。BACE2蛋白可能作為一種酶，直接與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的代謝底物發(fā)生相互作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生各種化學(xué)變化，被歸類為非分泌型蛋白質(zhì)。

2.4 BACE2蛋白的親疏水性

通過(guò)在線分析平臺(tái)研究BACE2蛋白的疏水特性，結(jié)果如圖3所示。研究發(fā)現(xiàn)，黑豬的BACE2蛋白疏水性氨基酸的數(shù)量多于親水性氨基酸，其中第133號(hào)氨基酸的位置展現(xiàn)了最高的疏水性（最小的親水性）；在第481號(hào)氨基酸的位置，其疏水性最低（親水性最高）。表明BACE2蛋白實(shí)際上是一種疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)。

正值越高，代表疏水性越強(qiáng)；負(fù)值越高，代表其親水性也越強(qiáng)。

2.5 BACE2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)

運(yùn)用在線技術(shù)平臺(tái)對(duì)BACE2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示。圖4橫軸呈現(xiàn)了氨基酸在蛋白質(zhì)中的位置，而縱軸揭示了可能存在的膜上跨越結(jié)構(gòu)。與現(xiàn)存生物材料進(jìn)行比較，認(rèn)為該理論模型可精確地解釋BACE2蛋白的膜層跨接結(jié)構(gòu)的形成。結(jié)果表明，呂梁黑豬體內(nèi)的BACE2蛋白中有12個(gè)區(qū)域具備穿透細(xì)胞膜的能力。基于這些數(shù)據(jù)，可以假設(shè)該蛋白質(zhì)具有3個(gè)膜間結(jié)構(gòu)。

2.6 BACE2蛋白序列比對(duì)與進(jìn)化

使用DNA MAN軟件將呂梁黑豬BACE2蛋白的氨基酸序列與牛（NP 001192991.1）、山羊（XP 017907120.1）、馬（XP 023485970.1）、智人（NP 036237.2）、獼猴（XP 014988337.1）、長(zhǎng)尾龍貓（XP 013360729.1）、小埃及跳鼠（XP 004654549.1）、中國(guó)倉(cāng)鼠（XP 027271511.1）和家鼠（NP 062390.3）的BACE2序列進(jìn)行比對(duì)，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖5所示。呂梁黑豬與山羊和牛的親緣關(guān)系較近，與家鼠的較遠(yuǎn)。不同物種的BACE2蛋白序列之間存在一定程度的相似性。

2.7 BACE2蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)作為一級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的紐帶，對(duì)其預(yù)測(cè)可為三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能提供大量信息，如設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)突變體或確定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及功能。使用SWISS-MODEL軟件進(jìn)行BACE2蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，BACE2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)為不規(guī)則的卷曲形態(tài)，包含252個(gè)氨基酸，占總氨基酸的49.03%。α-螺旋結(jié)構(gòu)包含95種氨基酸，占總氨基酸的18.48%。擴(kuò)展部分包含140種氨基酸，占總氨基酸的27.24%；除此之外，這些也是由不包含肽鍵和不規(guī)則連接點(diǎn)的短鏈組成的。在β-轉(zhuǎn)角中，存在27種氨基酸，占總氨基酸的5.25%；還存在其他蛋白質(zhì)中的一些小片段，這些片段呈現(xiàn)了一定的相似性，這些特征表明其是一個(gè)具有巨大開(kāi)發(fā)潛力的動(dòng)物資源庫(kù)。

在對(duì)呂梁黑豬BACE2蛋白的結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行深入研究的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是基于二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)構(gòu)建的，并且通過(guò)多肽鏈進(jìn)行進(jìn)一步的盤繞和折疊，最終形成了一種復(fù)雜的三維形態(tài)（圖6C）。在這些元素中，存在許多具有不同構(gòu)型空間的非共價(jià)鍵連接模式的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元。這些次級(jí)結(jié)構(gòu)單元具有多樣的形狀，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角，以及各種不規(guī)則的卷曲感。β-折疊與其他3個(gè)類別之間有一定的聯(lián)系。在次級(jí)鍵的驅(qū)動(dòng)下，這些結(jié)構(gòu)在側(cè)鏈基團(tuán)間的相互作用中共同轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。由于氨基酸殘基間的相互作用力不同，以及受分子內(nèi)氫和氧形成共價(jià)鍵等各種因素影響，其空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性。分析結(jié)果表明，該蛋白達(dá)到了三級(jí)結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)，但仍然呈現(xiàn)出不規(guī)則的卷縮形態(tài)，這進(jìn)一步突顯了其結(jié)構(gòu)成分的多樣性和高度的復(fù)雜性。

2.8 BACE2蛋白亞細(xì)胞定位

通過(guò)PSORT Ⅱ在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，呂梁黑豬的BACE2蛋白主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（55.6%），同時(shí)還分布于高爾基（22.2%）、細(xì)胞外（11.1%）、細(xì)胞壁和質(zhì)膜，占比11.1%。

2.9 BACE2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用在線軟件STRING構(gòu)建BACE2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖7所示，BACE2蛋白與CLK4、RTN3、RTN4、AKT3、MFSD11、BACE1、METTL23、PSENEN、MGAT5B和SEC14L1蛋白存在相互作用。網(wǎng)絡(luò)互作節(jié)點(diǎn)11個(gè)，邊數(shù)22個(gè)，平均局部聚類系數(shù)0.897。

2.10 BACE2基因在不同組織中的表達(dá)量

由圖8可知，BACE2基因在呂梁黑豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢和脂肪組織中均有表達(dá)，其中在腎臟中的表達(dá)量最高，其次是肝臟，肌肉組織中的表達(dá)量最低。

3 結(jié)論與討論

BACE2與BACE1具有同源性，在APP代謝途徑中扮演類似的角色，可以水解APP。BACE2的重要功能之一是調(diào)節(jié)Aβ的生成，而Aβ是AD中神經(jīng)纖維斑塊的主要成分[6]。目前，已有研究證明BACE2在其他生理和病理過(guò)程中同樣發(fā)揮重要作用。Sun等[7]和虞永峰[8]在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中敲減BACE2基因，發(fā)現(xiàn)其能明顯影響癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力以及骨轉(zhuǎn)移。劉希等[9]研究發(fā)現(xiàn)，引入人源性BACE2基因可以降低小鼠腦組織內(nèi)APP的表達(dá)，減少海馬區(qū)Aβ淀粉樣斑塊沉積，明顯改善了小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。鑒于BACE2基因在動(dòng)物生理和病理過(guò)程中的重要作用[10-11] ，本研究在呂梁黑豬中開(kāi)展了相關(guān)研究，成功克隆了黑豬BACE2基因的CDS區(qū)序列，全長(zhǎng)1 545"bp，編碼514個(gè)氨基酸。BACE2蛋白是堿性的，缺少信號(hào)肽，表明其合成后會(huì)直接在核糖體中發(fā)揮作用，不需要經(jīng)歷分泌過(guò)程，因此被歸類為非分泌型蛋白。這類蛋白質(zhì)不僅展現(xiàn)了出色的疏水性和穩(wěn)定性，而且還表現(xiàn)出明顯的跨膜作用。此外，從蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)看，呂梁黑豬BACE2蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主，并伴有α-螺旋及片狀結(jié)構(gòu)分散分布。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分預(yù)測(cè)精度有進(jìn)一步驗(yàn)證的作用，兩者結(jié)論高度吻合。Maloney等[12]和Sáez-valero等[13]研究表明，BACE2蛋白在同系同物種的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。本研究將黑豬BACE2基因序列與牛、山羊等9個(gè)物種進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，呂梁黑豬與山羊和牛的親緣關(guān)系較近，與家鼠的較遠(yuǎn)，表明哺乳動(dòng)物的BACE2基因序列相似性較高。

Sáez-valero等[13]分析表明，BACE2"mRNA在人體外周組織中表達(dá)水平較低，而在結(jié)腸、腎臟、胰腺、胎盤、前列腺、胃和氣管中表達(dá)水平較高；成人和胎兒的全腦和大多數(shù)成人腦亞區(qū)表達(dá)很低或檢測(cè)不到，成年大鼠腦原位雜交顯示，BACE2"mRNA在大部分腦區(qū)以極低水平表達(dá)。本研究檢測(cè)BACE2基因在呂梁黑豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢、脂肪組織中均有表達(dá)，以在腎臟中的表達(dá)量最高，其次是肝臟，肌肉組織中的表達(dá)量最低。結(jié)合亞細(xì)胞定位結(jié)果，BACE2蛋白主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，亞細(xì)胞定位結(jié)果可能與其作為酶的功能有關(guān)。

本研究成功地克隆了黑豬BACE2基因，并對(duì)該基因編碼的BACE2蛋白使用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行詳細(xì)的預(yù)測(cè)與分析，包括其是否含有信號(hào)肽、親水和疏水屬性、膜之間的結(jié)構(gòu)特征，以及蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等。結(jié)果表明，黑豬BACE2基因的CDS序列長(zhǎng)度1 545"bp，編碼了514種氨基酸；BACE2蛋白是堿性的，缺少信號(hào)肽，展現(xiàn)了出色的疏水性和穩(wěn)定性，而且還表現(xiàn)出了明顯的跨膜作用；其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)高度吻合，主要存在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與多種蛋白具有互作作用；在不同的哺乳物種之間表現(xiàn)出高度的同源性。本研究通過(guò)檢測(cè)不同組織的BACE2基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其在腎臟中的表達(dá)量最高，肌肉中的表達(dá)量最低。本研究為BACE2蛋白未知生物學(xué)功能的研究提供一個(gè)新的角度，為了解動(dòng)物細(xì)胞侵襲機(jī)制及色素沉著預(yù)防與控制奠定基礎(chǔ)，為相關(guān)方面的研究工作提供參考。未來(lái)將綜合運(yùn)用生物信息學(xué)研究手段，對(duì)黑豬BACE2基因表達(dá)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

參考文獻(xiàn)

[1] 周亭，呂月琴. 憨態(tài)敦厚的豬[J]. 少兒美術(shù)，2023（11）：24-27.

[2] 崔海紅. 丹麥養(yǎng)豬業(yè)生態(tài)建設(shè)對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展的啟示[J]. 世界農(nóng)業(yè)，2020（6）：98-103.

[3] WANG Z，XU Q，CAI F，et al. BACE2，a conditional β-secretase，contributes to Alzheimer’s disease pathogenesis[J]. JCI insight，2019，4（1）：e123431.

[4] 謝建，劉勝春. BACE2在人體胰腺和胰島素瘤中的表達(dá)[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，37（1）：6-9.

[5] 王會(huì)志. BACE2激活NF-κB通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的機(jī)制研究[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2022.

[6] 王瑞山，張?jiān)莆洌瑥埾?，? HIF-1調(diào)控小鼠bace1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，46（4）：564-568.

[7] SUN X L，HE G Q，SONG W H. BACE2，as a novel APP θ-secretase，is not responsible for the pathogenesis of Alzheimer’s disease in Down syndrome[J]. The FASEB journal，2006，20（9）：1369-1376.

[8] 虞永峰. BACE2在非小細(xì)胞肺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制[D]. 上海：上海交通大學(xué)，2018.

[9] 劉希，鄭娜，盧宏. 人源性BACE2對(duì)阿爾茨海默病小鼠海馬區(qū)淀粉樣斑塊形成及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2021，56（2）：195-199.

[10] QIU K X，LIANG W P，WANG S，et al. BACE2"degradation is mediated by both the proteasome and lysosome pathways[J]. BMC molecular and cell biology，2020，21（1）：13.

[11] DíAZ-CATALáN D，ALCARRAZ-VIZáN G，CASTA?O C，et al. BACE2"suppression in mice aggravates the adverse metabolic consequences of an obesogenic diet[J]. Molecular metabolism，2021，53：101251.

[12] MALONEY B，GE Y W，GREIG N H，et al. Characterization of the human beta-secretase 2 （BACE2） 5’-flanking region：identification of a 268-bp region as the basal BACE2 promoter[J]. Journal of molecular neuroscience，2006，29（1）：81-99.

[13] SáEZ-VALERO J，PéREZ-GONZáLEZ R. BACE2 beyond β-processing of APP，its neuroprotective role in cerebrovascular endothelium[J]. Journal of neurochemistry，2023，166（6）：887-890.

（責(zé)任編輯：胡立萍）