【摘 要】 目的：運用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化姬松茸多糖的提取工藝。方法：以超聲波提取與復(fù)合酶酶解法提取姬松茸中的多糖成分，以復(fù)合酶添加量、pH值、超聲溫度、提取時間為考察因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化姬松茸多糖的提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝條件為復(fù)合酶添加量0.03 g、pH6.5、超聲溫度70 ℃、提取時間20 min，此條件下姬松茸多糖的得率為10.67%，與預(yù)測值11.06%接近。結(jié)論：優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定可行，有助于姬松茸的合理運用，為姬松茸多糖有效提取和科學開發(fā)提供了參考。

【關(guān)鍵詞】 姬松茸；超聲波；酶提法；響應(yīng)面設(shè)計；多糖提取

【中圖分類號】R284.2

【文獻標志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）14-0048-08

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.14.zgmzmjyyzz202414009

Optimization of Agaricus Blazei Polysaccharide Extraction Process Based on Response Surface Design

XU Qing1 CHEN" Ronglin1 WU Qianyuan1 WANG Yinghao1 LIN Jianying2*

1.College of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350001，China;

2.Fuzhou Dongxing Biotechnology Co.， Ltd， Fuzhou 350001，China

Abstract：Objectives The aim of this project is to optimise the extraction process of Agaricus blazei polysaccharides by using Box-Benhnken. Methods The polysaccharide components in Agaricus blazei were extracted by ultrasonic wave extraction and complex enzyme hydrolysis， and the complex enzyme addition， pH value， ultrasonic temperature and extraction time were investigated， Box-Benhnken was used to optimize the extraction process of Agaricus blazei polysaccharide. Results The optimum extraction process conditions were 0.03g of complex enzyme addition， pH 6.5， ultrasonic temperature of 70°C and extraction time of 20min. The yield of Agaricus blazei polysaccharide under these conditions was 10.67%， which was close to the predicted value of 11.06%. Conclusion The extraction process is stable and feasible， promoting the rational use of Agaricus blazei， and providing a reference for the effective extraction and scientific development of Agaricus blazei polysaccharides.

Key words：Agaricus Blazei; Ultrasound; Enzymatic Extraction; Box-Benhnken

姬松茸（Agaricus blazei Murill.）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇，是一種美味的藥、食用真菌［1］，原產(chǎn)于巴西、秘魯和美國等地。同時姬松茸也是一種中藥材，在我國主要分布于東北、華北、華中、華南和西南地區(qū)［2］。姬松茸味甘，性溫，具有補益肝腎、健脾和胃、益精氣、潤燥、安神、益氣等功效，其有效成分有多糖［3］、酚類［4］、氨基酸［5］、脂肪類［6］等，還含有多種微量元素［7］，其中多糖是其主要的活性成分。西醫(yī)學中，姬松茸常被廣泛應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)［8］、抗腫瘤［9］、降血脂［10］、降血糖［11］等方面的健康保健，因此受到了人們廣泛關(guān)注。

響應(yīng)面法最早起源于20世紀50年代的統(tǒng)計學理論和實踐中，并應(yīng)用于化學工業(yè)中的實驗問題。隨著計算機技術(shù)的進步和數(shù)據(jù)分析方法的發(fā)展，逐漸出現(xiàn)多種改進和擴展的響應(yīng)面方法，如中心組合設(shè)計、Box-Behnken設(shè)計、混合設(shè)計等。其中Box-Behnken是采用二次回歸方程，擬合多個因素與多個響應(yīng)值之間關(guān)系進行建模和分析，再通過回歸方程分析優(yōu)選出最佳提取工藝參數(shù)的方法［12］，已被廣泛用于中藥及其制劑的有效成分提取工藝優(yōu)化。姬松茸多糖在傳統(tǒng)的提取方法的得率較低，而超聲波技術(shù)和酶提法都大大提高了其提取率［13-15］，因此，本實驗以超聲波提取與復(fù)合酶酶解法提取姬松茸中的多糖成分，運用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化姬松茸多糖的提取工藝，為姬松茸多糖的有效提取和科學開發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 木瓜蛋白酶、纖維素酶均購自福州精銳生物技術(shù)有限公司；95%乙醇、硫酸均購自西隴科學股份有限公司；苯酚、無水葡萄糖均購自阿拉??；姬松茸子實體購自福州東星生物技術(shù)有限公司，粉碎后過40目篩，得姬松茸粉，備用。

OHAUS型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、FWJ-04型高速萬能粉碎機（浙江省永康市敏業(yè)工貿(mào)有限公司）、KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SK-1型快速混勻器（國華常州儀器制造有限公司）、5804R型臺式大容量離心機（德國Eppendrof公司）、SHB-Ⅲ型循環(huán)多用真空水泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、LGJ-12型真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）、HH-2型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、Infinite-200·Pro型酶標儀（瑞士·TECAN公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 姬松茸粗多糖不同干燥方法的對比 自然干燥法精密稱取姬松茸粉末1.0 g，加入5 mL純水，混勻，酶解一定時間后70℃超聲20 min，在恒溫水浴鍋中加熱浸提2 h，離心（4000 r/min）15 min，抽濾，加入所得濾液3倍量的95%乙醇醇沉過夜，離心（4000 r/min）15 min，抽濾，最后置于陽臺通風處自然風干。

熱風干燥法前面步驟同自然風干法，最后置于電熱鼓風干燥箱干燥。

真空冷凍干燥法前面步驟同自然風法，抽濾完將沉淀復(fù)溶，離心（4000 r/min）15 min，取上清液于-20℃冰箱冷藏過夜，預(yù)凍成固體后再放置到真空冷凍干燥機里干燥。

上述3種方法干燥完成后收集粗多糖成品，稱重后放置到120℃干燥箱干燥至恒重，之后分別計算不同方法的粗多糖得率、含水率以及多糖含量。

粗多糖含水率=（m1-m2）/（m1-m0）×100%

其中m1為干燥前的粗多糖及瓶子的重量；m2為干燥后的粗多糖及重量；m0為瓶子的重量。

1.2.2 單因素分析 在查閱文獻和前期實驗的基礎(chǔ)上，從料液比、超聲溫度、提取時間、復(fù)合酶添加量、粉末粒度、超聲功率、pH值等因素中選取復(fù)合酶添加量、pH值、超聲溫度、提取時間這4個對提取結(jié)果影響較大的因素進行考察。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計 以粗多糖提取率為響應(yīng)值，依據(jù)單因素分析：包括超聲溫度、超聲時間、pH值、復(fù)合酶添加量，以這4個因素為自變量，結(jié)合Box-Behnken法，設(shè)計分析實驗，表1為各因素水平情況。

1.2.4 姬松茸水溶性粗多糖的提取 量取一定體積的純水于離心管中，吸取一定量的稀鹽酸緩慢加入純水中，邊加邊攪拌，并測定pH，將pH分別調(diào)至5.5、6.0、6.5。

精密稱取姬松茸粉末1.0 g于15 mL離心管中，再稱取各水平所需的復(fù)合酶加入離心管，隨后根據(jù)響應(yīng)面水平精密量取5 mL各pH水平的純水加入離心管，再于快速混勻器上混勻，酶解一段時間后在超聲清潔器中按各水平的條件超聲，超聲功率為80 W。

超聲結(jié)束后加入Sevag試劑（氯仿∶[KG-*3/5]正丁醇為4∶[KG-*3/5]1）1 mL，離心（4000 r/min）15 min，取上清液加入濾液三倍量的95%乙醇醇沉過夜，再離心（4000 r/min），抽濾，待濾紙無醇味后復(fù)溶，沉淀完全溶解后離心，取上清液進行真空冷凍干燥，干燥結(jié)束所得即為多糖粗品。

粗多糖提取率=粗多糖的質(zhì)量/藥材粉末的質(zhì)量×100%

1.2.5 多糖含量的測定 選用苯酚硫酸法測定多糖含量，該方法快速、準確、簡便易行。標準曲線的繪制：精密稱取0.0115 g葡萄糖于50 mL小燒杯中，溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，備用；分別精密量取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL葡萄糖標準溶液于離心管中，準確補水至2.00 mL，加入苯酚1 mL，搖勻，再加入濃硫酸5 mL，搖勻，置于恒溫水浴鍋中沸水浴加熱15 min，冷卻后使用酶標儀于490 nm測定吸光度；以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸作圖，以此得到葡萄糖標準曲線以及線性回歸方程。

精密稱取0.0050 g姬松茸粗多糖，精確移取10 mL純水加入使其溶解，溶解后準確移取200 μL至另一離心管中，加入200 μL純水稀釋，加入苯酚0.2 mL，混勻，再加入硫酸1 mL，混勻，于恒溫水浴鍋上沸水浴加熱15 min，加速該反應(yīng)，冷卻，于490 nm測定吸光度，將吸光度代入葡萄糖標準曲線線性回歸方程得出粗多糖中的多糖濃度，并計算多糖含量。

多糖含量=C×稀釋倍數(shù)×Vm×100%

其中C為多糖濃度；V為多糖溶液體積；m為稱取的粗多糖質(zhì)量。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同干燥方法的對比 由表2可知，自然風干的粗多糖得率最高，但含量較低；熱風干燥的含水率最低，但多糖得率不高；真空冷凍干燥的含水率最高，但多糖得率最高，所以真空冷凍干燥的方式最優(yōu)。

2.2 基于響應(yīng)面優(yōu)化的姬松茸多糖提取工藝

2.2.1 回歸方程的建立與分析 運用軟件design expert 10.0對表3的數(shù)據(jù)進行多元擬合分析，可得如下多元擬合方程：Y=9.24-0.21A+0.22B-0.35C-0.54D+1.30AB+0.33AC-0.49AD+0.14BC+0.22BD+0.71CD-1.29A2-0.36B2+0.13C2+0.46D2

由表4的回歸方程分析可知，實驗?zāi)Ｐ偷腜robgt;F的值小于0.05即模型顯著，失擬項不顯著，說明實驗?zāi)Ｐ椭械亩雾椃匠谭蠈嶋H提取情況，能夠較好地反應(yīng)超聲溫度、pH值、復(fù)合酶添加量、提取時間與姬松茸粗多糖提取率之間的關(guān)系。殘差分析如圖1至圖4所示。

2.2.2 響應(yīng)面因素間的交互作用 圖5為在固定超聲溫度為75℃、超聲時間為25 min時，pH值和復(fù)合酶添加量間的交互作用對粗多糖提取率的影響。當pH不變時，粗多糖提取率隨復(fù)合酶添加量的增加而先增長后減??；當復(fù)合酶添加量不變時，粗多糖提取率隨pH的增大而呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。因此，pH與復(fù)合酶添加量之間的交互作用顯著。當pH處于低水平而復(fù)合酶添加量處于較高水平時，粗多糖的提取率達最大值；當pH處于高水平而復(fù)合酶添加量處于低水平時，粗多糖的提取率最低。

圖6為在pH值固定為6、超聲時間固定25 min的情況下，超聲溫度和復(fù)合酶添加量的交互作用對粗多糖提取率的影響。當超聲溫度不變時，粗多糖提取率隨復(fù)合酶添加量的增加而增大；復(fù)合酶添加量不變時，粗多糖提取率隨溫度地上升而緩慢下降，這說明超聲溫度和復(fù)合酶添加量的交互作用明顯。當復(fù)合酶添加量處于高水平、超聲溫度處于低水平時，粗多糖的提取率最大；當復(fù)合酶添加量處于低水平、超聲溫度處于高水平時，粗多糖提取率最低。

圖7為pH值固定為6、超聲溫度固定75℃時，超聲時間和復(fù)合酶添加量交互作用對粗多糖提取率的影響。當復(fù)合酶添加量不變時，粗多糖提取率隨超聲時間地增加而緩慢上升；當超聲時間不變時，粗多糖提取率隨復(fù)合酶添加量地增加顯著提升，這說明超聲時間和復(fù)合酶添加量交互作用明顯。當復(fù)合酶添加量處于高等水平且超聲時間處于高水平時，粗多糖提取率最高；當復(fù)合酶添加量和超聲時間都處于低水平時，粗多糖提取率最低。

圖8為超聲時間固定25 min、復(fù)合酶添加量固定0.03 g時pH值和超聲溫度對粗多糖提取率交互作用的影響。由圖8可知，pH值不變時，提取率隨超聲溫度地增大緩慢上升；超聲溫度不變時，提取率隨pH地增大緩慢上升，這說明pH和超聲溫度的交互作用對提取率的影響不顯著。

圖9為超聲溫度固定75℃、復(fù)合酶添加量固定0.03 g時pH和超聲時間對粗多糖提取率的交互作用。由圖9知，當pH不變時，粗多糖提取率隨超聲時間的增大而減小；當超聲時間不變時，提取率隨pH的增大先增大后趨于穩(wěn)定。當pH處于較高水平，超聲時間處于高水平時，粗多糖提取率最大；當兩者都處于低水平時，提取率最低。

圖10為pH固定為7、復(fù)合酶添加量固定為0.03 g時，超聲溫度和超聲時間對粗多糖提取率交互作用的影響。當超聲溫度不變時，提取率隨超聲時間的增大而減小；當超聲時間不變時，提取率隨超聲溫度的增大而減小，這說明超聲時間和超聲溫度的交互作用較為顯著。當超聲溫度和超聲時間都處于低水平時，提取率最高。

2.2.3 最佳提取工藝的確定及驗證 運用design expert 10.0處理數(shù)據(jù)，結(jié)合實驗可操作性，分析認為：姬松茸粗多糖最佳提取工藝為復(fù)合酶添加量0.03 g、pH值6.5、超聲溫度70℃、提取時間20 min，在此條件下的粗多糖得率預(yù)估為11.06%。采用上述最佳提取工藝驗證，平行試驗3次，平均提取率為10.67%，與預(yù)測值接近，說明該提取工藝條件的穩(wěn)定性和準確性。

2.3 多糖含量的測定

2.3.1 標準曲線的繪制 圖11為葡萄糖標準曲線，以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標的線性回歸方程：Y=7738.8X+0.1153。

2.3.2 多糖含量的測定 測完粗多糖樣品溶液吸光度后按式多糖含量=C×稀釋倍數(shù)×Vm×100%計算。結(jié)果見表5。

由表6可知，樣品提取的姬松茸多糖含量在50%以上的有28份，占總數(shù)的96.55%；多糖含量在60%以上的有16份，占總數(shù)的55.17%；多糖含量在70%以上的有6份，占總數(shù)的20.69%；多糖含量在80%以上的有2份，占總數(shù)的6.90%，說明該方法下姬松茸多糖的提取率較好。

3 討論

姬松茸是一種珍貴的食藥兼用的真菌，其中多糖含量豐富，具有廣闊的開發(fā)利用前景。目前，關(guān)于姬松茸提取方式主要有熱水浸提法、溶劑提取法、超聲提取法和復(fù)合酶提取法。熱水浸提法成本低、操作簡便、污染小，楊開［16］運用此法提取姬松茸子實體及粉末的多糖，提取率相對較高，但發(fā)現(xiàn)浸提溫度過高、時間過久會導致多糖鏈被破壞。溶劑提取法操作簡便、準確度高、提取純度較高，已成為多糖提取的常用方法之一。沈愛英等［17］及張云凌等［18］發(fā)現(xiàn)運用不同溶劑提取姬松茸多糖的得率會比傳統(tǒng)水提法高，但酸堿環(huán)境下多糖的糖苷鍵及其立體結(jié)構(gòu)和活性易被破壞。超聲提取法是一種利用超聲波作用對樣品實行有效提取的方式，通過超聲波的高頻振動，極大地加速了細胞壁破裂和多糖溶解過程，具有效率高［19］、操作簡潔等優(yōu)點?；艨▲P等［15］運用超聲波技術(shù)優(yōu)化了姬松茸粗多糖的提取工藝，該方法下多糖得率比單純的水提顯著提升，且純度也較高。復(fù)合酶提取法通常使用多種酶的混合物，通過協(xié)同作用來提高對特定分子的識別和分解能力，從而提高提取效率，沈愛英等［13］采用此方法提取姬松茸子實體中的多糖，提取率為15.67%，相比于單純熱水浸提，該方法提取效率提升了1倍，與酸堿浸提法對比效率也更高。因此該方法與傳統(tǒng)提取方法相比快速、高效、無殘留物，特別適用于提取具有復(fù)雜化學結(jié)構(gòu)的化合物，在許多領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。

通過實驗前查閱相關(guān)文獻，選擇超聲時間［20］、超聲溫度、pH、復(fù)合酶添加量［22-23］這些4個對多糖提取率影響較為顯著的因素，運用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化姬松茸多糖的提取工藝。未來隨著人類科技的進步以及科研的發(fā)展，姬松茸的提取工藝與應(yīng)用領(lǐng)域也會不斷優(yōu)化，其發(fā)展前景可觀。

姬松茸中多糖含量豐富，具有非常好的食用、保健功能和開發(fā)利用前景，因此研究姬松茸多糖的提取工藝和開發(fā)其相關(guān)產(chǎn)品具有重要意義。本實驗以干燥的姬松茸粉末為原料，以純水為提取溶劑，在單因素試驗基礎(chǔ)上用design expert10.0軟件對多糖成分提取工藝參數(shù)進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化，結(jié)果表明最佳的提取工藝條件為：復(fù)合酶添加量0.03 g、pH值6.5、超聲溫度70℃、提取時間20 min，此條件下姬松茸多糖的得率為10.67%，與預(yù)測值11.06%接近。因此使用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化出的姬松茸多糖提取工藝穩(wěn)定可行，為促進姬松茸的合理運用及姬松茸多糖有效提取和科學開發(fā)提供了參考。

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（收稿日期：2023-10-27 編輯：陶希睿）