關(guān)鍵詞：米日穗披堿草：1HtS染色體：探針：熒光原位雜交標(biāo)記

銹病和白粉病是小麥的主要病害，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量。小麥近緣物種含有眾多抗小麥病害優(yōu)異基因，導(dǎo)入這些抗性基因是改良小麥的重要手段。粗穗披堿草（Elymus trachycaulus，2n=4x=28，基因組為S S H H）高抗小麥白粉病、葉銹病、稈銹病、大麥黃矮病和梭條花葉病等病害。研究發(fā)現(xiàn)，雖然小麥一粗穗披堿草羅伯遜易位系1HtS.1BL喪失了白粉病抗性，但因粗穗披堿草1HtS染色體臂上含有抗葉銹病基因Lr55和一個(gè)暫未命名的抗條銹病基因，該易位系目前仍然對(duì)09-9-1441-1、09-9-1426-1、09-7-922-1、09-7-949-1和09-9-1505-1等葉銹菌混合生理小種以及CY32、CY33、CY34和Su-4等條銹菌混合生理小種表現(xiàn)為近免疫，仍是改良小麥的優(yōu)異基因源。前期，我們團(tuán)隊(duì)開發(fā)了粗穗披堿草IHtS特異的部分分子標(biāo)記：Gill B S團(tuán)隊(duì)建立了粗穗披堿草1HtS細(xì)胞學(xué)標(biāo)記。然而，相對(duì)于精確鑒定小麥一粗穗披堿草lHtS染色體小片段易位系易位斷點(diǎn)的需求，這些分子標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的數(shù)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足材料精準(zhǔn)鑒定需求。因此，非常有必要繼續(xù)開發(fā)粗穗披堿草1HtS細(xì)胞學(xué)標(biāo)記及DNA標(biāo)記。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是鑒定小麥背景中外源染色質(zhì)的有效手段，已被廣泛用于外源染色質(zhì)的鑒定。早期的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記主要根據(jù)染色體的大小、隨體的有無、長短臂的比值等核型特征來鑒定外源染色體；其后，依據(jù)C帶、N帶、Q帶和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等技術(shù)建立的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記先后發(fā)展起來，其中FISH技術(shù)是目前最常用的小麥外源染色質(zhì)鑒定手段。依據(jù)探針的不同，原位雜交可分成三種類型：第一類是以基因組總DNA為探針的基因組原位雜交：第二類是以重復(fù)DNA序列為探針的原位雜交：第三類是以單拷貝DNA序列作為探針的原位雜交技術(shù)。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)，非變性熒光原位雜交技術(shù)（non-denaturingFISH，ND-FISH）由于其簡(jiǎn)便易操作和經(jīng)濟(jì)高效的優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于小麥族物種染色質(zhì)鑒定，而針對(duì)物種特異染色體片段開發(fā)的寡核苷酸探針以及合成的串聯(lián)重復(fù)序列探針在ND-FISH分析中應(yīng)用廣泛。

為了獲得小麥一粗穗披堿草1HtS小片段易位系，我們利用中國春ph1b基因突變體與粗穗披堿草1HtS.1BL易位系進(jìn)行了雜交回交，已經(jīng)獲得了大量后代材料。為了開發(fā)用于鑒定小麥一粗穗披堿草1HtS染色體小片段易位系的FISH標(biāo)記，本研究利用小麥及其近緣種探針以及利用生物信息學(xué)開發(fā)的小麥1BS染色體新探針對(duì)中國春一粗穗披堿草1HtS．1BL羅伯遜易位系和對(duì)照中國春進(jìn)行ND-FISH分析，建立能夠覆蓋粗穗披堿草1HtS染色體的FISH標(biāo)記，以期為后續(xù)小麥一粗穗披堿草1HtS抗病小片段易位篩選和鑒定提供新的檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1供試材料

中國春一粗穗披堿草1HtS．1BL羅伯遜易位系（TA5072），由美國堪薩斯州立大學(xué)BerndFriebe教授惠贈(zèng)。中國春（Chinese Spring，CS），由電子科技大學(xué)楊足君教授提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1探針設(shè)計(jì)與合成實(shí)驗(yàn)所用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo -pTa535-1由成都瑞信生物公司合成，序列同文獻(xiàn)。根據(jù)前人研究合成小麥及其近緣種探針21個(gè)，由寧波康貝生化有限公司合成。

在IWGSC網(wǎng)站（https：//iwgsc. nal. usda. gov）下載中國春的參考基因組序列，將1BS染色體上的序列按50bp窗口依次截取，然后用BLASTN軟件將這些序列與IBS染色體全序列進(jìn)行比對(duì)。按照在IBS染色體上的拷貝數(shù)從多到少的順序?qū)@些序列進(jìn)行排序，選取并合成拷貝數(shù)最高的前61個(gè)序列作為探針，編號(hào)為B1-B61，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果選“ATC-GATCGATCGATCG”為種子序列，按每次1bp對(duì)種子序列向前滑動(dòng)，每次滑動(dòng)窗口選取3個(gè)堿基，重復(fù)8次這3個(gè)堿基的為一條選定序列，總共獲得60條序列。用bowtie軟件將這些序列與1B染色體全序列進(jìn)行比對(duì)，剔除已發(fā)表的，最終得到40條新序列，將其分別編號(hào)為B62-B85、B87-B90、B92-B101、B105和B108，送北京擎科生物科技股份有限公司合成探針備用。

1.2.2根尖處理和原位雜交根尖處理方法參考文獻(xiàn)[31]：將種子置于鋪有濾紙且濕潤的培養(yǎng)皿中，放人22℃恒溫光照培養(yǎng)箱中：待種子萌動(dòng)后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)到4℃冰箱中放置24h，之后再次放入22℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：待種子根尖長至2～3cm時(shí)，剪下根尖，放入離心管中，用一氧化二氮?dú)怏w處理2h，向離心管（置于冰水混合物中）中加入500uL 90%乙酸，8～10min后用吸管吸掉乙酸，并用ddH20沖洗兩遍，然后用刀片切下根尖分生組織部分，用1%果膠酶Y23（YakultPharmaceutical Tokyo）和2%纖維素酶R-10的酶解液（稱量0.1g果膠酶和0.2g纖維素酶，加入2mL 5x檸檬酸緩沖液，再分多次加入8mL滅菌ddH20，搖晃使固體完全溶解、溶液透亮）37℃酶解1h，用70%乙醇沖洗根尖兩遍，隨后用解剖針將根尖搗碎，4000r/min離心2min，倒掉70%乙醇，最后加入30uL冰醋酸滴片備用。

FISH方法參見文獻(xiàn)[30]：先用寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo -pTa535-1對(duì)供試材料TA5072和CS的染色體制片進(jìn)行雙色FISH分析，照相后洗脫FISH信號(hào)，再用試驗(yàn)探針對(duì)Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1雜交的同——細(xì)胞進(jìn)行FISH分析并照相，比對(duì)TA5072和CS的FISH信號(hào)，獲得TA5072中IHtS．1BL易位染色體的雜交信號(hào)。

2結(jié)果與分析

2.1 122個(gè)探針在IHtS染色體上的信號(hào)檢測(cè)

ND- FISH結(jié)果顯示，小麥及其近緣種的21個(gè)（不含Oligo-pSc119.2-1和Oligo -pTa535-1）探針中，僅Oligo-HvT01、Oligo-713、Oligo-H12-404三個(gè)（14.29%）探針在粗穗披堿草IHtS染色體上有明顯雜交信號(hào)。根據(jù)IBS染色體序列設(shè)計(jì)合成的61個(gè)探針中，僅B14和B24兩個(gè)（3.28%）探針在粗穗披堿草1HtS染色體上有雜交信號(hào)。根據(jù)j堿基重復(fù)序列合成的40個(gè)探針中，B62、B64和B66等3 1個(gè)（77.50%）探針在粗穗披堿草1HtS染色體有明顯雜交信號(hào)。綜上，本研究合成的122個(gè)探針中共有36個(gè)（29.51%）在粗穗披堿草1HtS染色體上有雜交信號(hào)，列于表1，其中33個(gè)（27.05%）為新開發(fā)探針。

2.2 36個(gè)探針在1HtS染色體上的信號(hào)分布類型

首先，利用寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對(duì)TA5072和CS進(jìn)行雙色FISH分析，鑒定出1HtS.IBL染色體；其后，洗脫掉FISH信號(hào)，再利用新合成的探針對(duì)二者進(jìn)行FISH分析。結(jié)果表明，根據(jù)探針在粗穗披堿草1HtS染色體上的分布位置及信號(hào)強(qiáng)弱（圖1），可將36個(gè)探針的雜交信號(hào)分為五種類型（表1、圖2）。第1類探針信號(hào)只分布在染色體1HtS的末端，1HtS其他位置沒有信號(hào)，僅包括1個(gè)探針，即Oligo-HvT01。第Ⅱ類探針信號(hào)覆蓋染色體1HtS的3/4．該類探針包括Oligo-713和Oligo-H12-404。第Ⅲ類探針信號(hào)覆蓋染色體1HtS的絕大部分，包括B74、B76、B77共3個(gè)探針。第Ⅳ類探針包括B14、B24和B64等12個(gè)探針，信號(hào)僅分布在著絲粒處。第V類探針信號(hào)分布在著絲粒和近著絲粒處，包括B62、B66等18個(gè)探針。

3討論與結(jié)論

目前，ND-FISH已經(jīng)被廣泛用于小麥近緣屬物種染色質(zhì)鑒定研究。Tang等開發(fā)的探針Oligo-HvTOI可以有效鑒定大麥染色體；Fu等設(shè)計(jì)開發(fā)的探針Oligo-1162、Oligo-pSc200和Oli-go-pSc250可有效區(qū)分小麥背景中的黑麥染色體；Yu等根據(jù)Liu等開發(fā)的LTR pDbH12探針開發(fā)了寡核苷酸探針Oligo-pDb12H，用其替代LTR pDbH12可使實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)單快捷；Wang等利用寡核苷酸探針Oligo -pDb12H和Oligo-B11建立了簇毛麥2Vb染色體的最新FISH核型：Xi等根據(jù)已發(fā)表的特異重復(fù)序列合成寡核苷酸探針Oligo-B11和Oligo-pThp3.93，可以代替GISH（基因組原位雜交）區(qū)分部分長穗偃麥草、中間偃麥草和十倍體長穗偃麥草。然而，目前未發(fā)現(xiàn)利用寡核苷酸探針建立披堿草染色體FISH標(biāo)記的報(bào)道。本研究利用122個(gè)合成的寡核苷酸探針對(duì)TA5072和CS進(jìn)行FISH分析，發(fā)現(xiàn)Oligo-HvT01、Oligo-713和Oligo-H12-404等36個(gè)探針在1HtS染色體上有信號(hào)，建立了檢測(cè)小麥背景中粗穗披堿草1HtS染色體的FISH標(biāo)記。

前人研究發(fā)現(xiàn)，探針Oligo-HvT01在大麥染色體短臂末端均有雜交信號(hào)。本研究也發(fā)現(xiàn)探針Oligo-HvTO1雜交信號(hào)分布在粗穗披堿草短臂1HtS末端，說明此探針是大麥和粗穗披堿草染色體短臂末端共有特異序列。探針Oligo-k566和Oligo-713雜交信號(hào)分布在簇毛麥2Vh染色體的短臂近著絲粒處和長臂近著絲粒處。探針Oligo-H12-404可雜交簇毛麥、大麥和偃麥草JS等染色體，在粗穗披堿草1HtS著絲粒處也有強(qiáng)雜交信號(hào)，因此，Oligo-H12-404探針可能是小麥近緣物種著絲粒處共有特異序列。Bards-ley等根據(jù)SSR重復(fù)序列（AAC）、（ACG）和（CGT）在小麥和一些外緣物種中的雜交位置，判定這些序列是C帶的主要組成部分；同樣的，Gong等發(fā)現(xiàn)（GAA）重復(fù)序列是單芒山羊草N染色體的C帶主要組成部分。Cuadrado等發(fā)現(xiàn)（AC）、（AAC）s和（AAG）s等序列是大麥染色體著絲粒處、近著絲粒處和染色體臂近末端處重要序列組成部分。本研究開發(fā)的40個(gè)簡(jiǎn)單三堿基重復(fù)序列探針中的B74等33個(gè)探針能夠雜交粗穗披堿草1HtS染色體不同部位，說明這些探針序列是1HtS染色體的異染色質(zhì)組成部分，這為后續(xù)研究粗穗披堿草異染色質(zhì)組成、類型和進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)。

綜上，本研究新開發(fā)的探針可以完全覆蓋粗穗披堿草1HtS染色體，為后續(xù)篩選和鑒定小麥一粗穗披堿草染色體1HtS小片段易位系提供了新的檢測(cè)方法。