關鍵詞：丹參；SmREM1.2基因：基因克??；生物信息學分析；表達分析；亞細胞定位

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)大宗類中藥材之一，臨床上廣泛應用于心腦血管疾病等的治療，經濟價值高，市場需求大，在我國栽培廣泛。隨著全球變暖和環(huán)境污染等問題的加重，丹參生長發(fā)育受到多種逆境脅迫（干旱脅迫、鹽脅迫等）的影響，阻礙了丹參種植業(yè)的發(fā)展。因此，研究丹參應對逆境脅迫的調控機制，開發(fā)耐逆基因資源，對于培育丹參耐逆品種至關重要。

Remorin蛋白是一類與質膜脂筏相連的蛋白，介導脂筏微區(qū)的形成：它分布廣泛，在苔蘚植物、裸子植物及被子植物中都有存在。Remorin蛋白N末端結構差異大，為可變結構域，含有介導Remorin蛋白與多種蛋白互作的保守的脯氨酸富集區(qū)域，決定了Remorin蛋白的功能多樣性：C末端包含疏水的coiled - coil區(qū)域，結構高度保守，被認為是Remorin蛋白的標志性區(qū)域。Re-morln蛋白可以聚合形成寡聚體，組裝成絲狀纖維結構發(fā)揮功能。Remorin蛋白在細胞內存在多樣的翻譯后修飾作用，其C末端可以發(fā)生棕櫚?；⒍罐Ⅴ；弱；揎椬饔?，以調節(jié)其膜定位：還可以發(fā)生磷酸化修飾，磷酸化位點分布在N端可變區(qū)，研究表明CDPK3磷酸化Re-morln可影響其促進質膜微區(qū)組裝的功能，調節(jié)病菌等在細胞間的傳遞與侵染。

越來越多的研究表明Remorin基因的表達受激素、逆境脅迫等多種信號刺激的誘導，參與植物免疫應答、生長發(fā)育調控及逆境響應等多種信號轉導通路，具有廣泛的生物學功能。在生物脅迫方面，Remorin蛋白參與植物免疫應答過程，響應水楊酸的信號刺激，介導調節(jié)質膜脂筏的組裝，調控胞間連絲的開閉，通過降低胞間連絲通透性來阻止病毒在宿主植物細胞間的擴散；也有研究表明，當細胞受到病毒入侵時，體內的Re-morln蛋白可以加快細胞自噬的進程，進而提高生物體的抗病性：同時，Remorin蛋白可以通過組裝聚集影響微絲結合蛋白formin的聚合，從而改變微絲重排，調節(jié)植物的免疫應答。在非生物脅迫方面．Badawi等發(fā)現(xiàn)小麥的耐寒性與Re-morln基因的高表達具有相關性，多個耐寒小麥品種中Remorin基因表達明顯升高；Zhang等發(fā)現(xiàn)Remorin蛋白可顯著提高胡楊質膜囊泡的H+-ATP水解酶活性和H+轉運活性，進而顯著提高了植株的耐鹽性：Yue等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達谷子的SiREM6基因可以促進鹽脅迫下種子萌發(fā)率的升高，增強植物的耐鹽能力。

目前關于丹參中Remorin蛋白功能的研究還較少。本研究基于丹參轉錄組及基因組數(shù)據(jù)庫信息，克隆丹參SmREM1.2基因，并對其進行生物信息學分析，明確SmREM1.2蛋白的理化特性，構建GFP標簽融合表達載體，分析其亞細胞定位，并檢測鹽脅迫處理下SmREM1.2的表達水平，以探討SmREM1.2的功能，為Remorin蛋白在植物中的應用開拓新的思路，并為丹參耐逆調控機制的深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料培養(yǎng)及處理

本研究使用的丹參材料為紫花丹參，種子由中國中醫(yī)科學院中藥資源中心贈與，保存于山東師范大學生命科學學院趙雙雙實驗室。2021年1月將丹參種子經由次氯酸鈉消毒液（NaClO濃度為20%，TritonX-100濃度為0.1%）滅菌后，置于濕潤的濾紙上，待萌發(fā)后轉移至培養(yǎng)土（營養(yǎng)土和蛭石按體積比1：1配制）中，在人工氣候室（溫度23℃，濕度70%，光照16h/黑暗8h）培養(yǎng)，正常生長2個月后，選取長勢相同的丹參幼苗，使用250mmol/L NaCl采用澆灌法進行鹽脅迫處理，分別在處理0、3、6、12h取樣，液氮冷凍后于-80℃保存。

本研究所用煙草為本生煙（Nicotiana bentha-miana），種子由山東師范大學生命科學學院趙雙雙實驗室保存。2021年8月，將煙草種子經由次氯酸鈉消毒液滅菌后，于MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，生長10天后，將煙草幼苗轉移至培養(yǎng)土（營養(yǎng)土和蛭石的體積比為1：1）中，于人工氣候室（溫度23℃，濕度70%，光照16h/黑暗8h）培養(yǎng)4～6周。

1.2總RNA的提取及cDNA合成

使用RNA提取試劑盒（購自諾唯贊公司）提取丹參樣品總RNA．用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用超微量紫外分光光度計NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer（Thermo Scientific）對所提取的總RNA進行定量分析，然后使用反轉錄試劑盒（購自全式金公司）進行反轉錄，獲得cDNA，存于-20℃。

1.3SmREM1.2基因克隆

利用擬南芥基因組網站（https：//www. arabi-dopsis.org/）下載擬南芥REM家族成員AtREM1.2的蛋白序列，以其為探針，在丹參基因組數(shù)據(jù)庫中比對，鑒定得到SmREM1.2基因（SMil_00007417）的序列信息。用Clone Manager軟件設計該基因特異性引物，上游引物序列為5'-GCGTCGACATGGCGGAGGAGCAAGTGAAA-3'．下游引物序列為5'-GCGGTACCTCAGAAACAGC-CAAGTAGTTTCTTT-3'．并由生工生物工程（上海）有限公司合成。以丹參cDNA為模板運用Toyobo公司KOD高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR反應條件：98℃預變性2min;98℃變性30s，57℃退火30s，68℃延伸30s，35個循環(huán)；68℃終延伸5min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，并切膠回收目的產物，使用諾唯贊DNA回收試劑盒對膠回收產物進行純化。用限制性內切酶BamH I和Sal I對PCR產物進行酶切，并連接至克隆載體pCAMBIA1300-GFP，轉化至大腸桿菌DH5ca感受態(tài)細胞中，挑取單克隆菌落，進行PCR檢測，將陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司青島分公司測序分析。

1.4生物信息學分析

運用在線數(shù)據(jù)庫ExPASy（https：//web. expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）預測SmREM1.2蛋白的等電點、分子質量等理化特性；運用ProtScale（http：//web. expasy. org/protscale/）進行蛋白親疏水性預測；運用TMHMM Server 2.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/servlces/TMHMM/）對SmREM1.2蛋白進行跨膜結構域預測；運用SignalP 6.0 Server（ht-tps： //services.healthtech.dtu.dk/servlces/SignalP-6.0/）對SmREM1.2蛋白進行信號肽序列預測：運用SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？ page=npsa_sopma.html）在線數(shù)據(jù)庫進行蛋白二級結構預測；運用CDD（http：//www.ncbi．nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）對SmREM1.2蛋白進行保守結構域分析。

運用TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www. Arabidopsis.org）檢索擬南芥Remorin家族蛋白氨基酸序列信息，使用Clone Manager軟件將SmREM1.2與4個擬南芥REM成員進行氨基酸多重序列比對分析。

運用NCBI數(shù)據(jù)庫，根據(jù)SmREM1.2蛋白的氨基酸序列，通過Blast分析（http：//blast. ncbi.nlm.nihgov/Blast.cgi）篩選其他植物中SmREM1.2的同源序列，運用MEGA11.0軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）將SmREM1.2與擬南芥、玉米、水稻等的REM家族成員構建進化樹，將booststrap設置為1000。

1.5亞細胞定位分析

通過液氮一熱激法分別將1.3中獲得的重組質粒pCAMBIA1300-SmREM/.2-GFP及質膜標記pCAMBIA1300-AtCBLl-mCherry轉化至農桿菌GV3101感受態(tài)中，PCR篩選鑒定陽性菌落，擴大培養(yǎng)，收集菌體，于滲透液[10mmol/L MES（pH 5.7），10mmol/L MgCl2，100umol/L乙酰丁香酮]中共孵育2h；運用針管將農桿菌注射進煙草葉片細胞中，于人工氣候室培養(yǎng)72h，取共表達pCAMBIA1300-SmREM/.2-GFP及質膜標記pCAMBIA1300-AtCB//-mCherry的煙草葉片，在Leica Sp8共聚焦顯微鏡下進行觀察，用波長488nm和561nm的激發(fā)光檢測GFP和mCherry通道熒光信號。

1.6基因表達分析

采用實時熒光定量PCR法進行測定。使用Primer Premier 5.0軟件對克隆的SmREMl.2基因CDS序列設計特異引物（SmREMl.2 F：5'-AG-CAAGTGAAAACGGTCGAG-3';SmREMl.2 R：5'-GGAGGGCTCCGTAAACAGAG-3'）。選用TaKa-Ra生物技術有限公司的熒光定量試劑盒（SYBRGreen）進行實驗。反應體系：2xSYBR Green ProTaq Premix 5.0uL，cDNA 2.0uL，上、下游引物各0.2uL，用ddH20補足至10.0uL。運行程序：95℃預變性2min；95℃變性Ss，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。熔解曲線測定程序設置為95℃變性5s．60℃退火1min．95℃持續(xù)5s，50℃保溫30s。實驗收集的數(shù)據(jù)以丹參Actin基因為內參基因進行均一化處理（引物為SmActinF：5'-GCCCTCGACTATGAACAAGAGC-3'：SmAc-tin R：5'-GATGGAGTTGTAGGTGGTTTCGTG-3'）。每個基因3次重復，依據(jù)2-△△法計算SmREM1.2的相對表達量。

2結果與分析

2.1SmREM1.2基因的克隆與鑒定

擬南芥包含16個Remorin蛋白家族成員，分為6個亞家族（REMl-REM6），其中REMI在植物體內表達豐度高，分布廣泛，功能多樣，調節(jié)下胚軸及根的伸長，調控植物對病原菌的抵御能力。本研究以擬南芥AtREMl.2蛋白序列為探針，依據(jù)丹參基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定獲得與AtREM1.2同源性較高的SmREM1.2序列，以丹參cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，克隆到目的條帶（圖1），測序得知SmREM1.2基因CDS序列全長為585 bp，編碼194個氨基酸。

2.2SmREM1.2的生物信息學分析

2.2.1SmREM1.2蛋白理化性質及親疏水性分析

ProtParam預測結果顯示，SmREM1.2蛋白的分子式為C944 H1563 N255 0295 S5，分子量為21365.63Da，脂肪系數(shù)為75.57，理論等電點為6.69，不穩(wěn)定指數(shù)達59.75，為不穩(wěn)定的弱酸性蛋白。SmREM1.2蛋白的194個氨基酸中包含酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）及堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）各37個。利用ProtScale預測SmREM1.2蛋白的親／疏水性，結果（圖2）顯示，蛋白序列中第38位脯氨酸（Pro）處具有親水性最大值，達1.553，第103位賴氨酸（Lys）處具有親水性最小值（-1.254），親水性平均值為-0.818，表明該蛋白主要表現(xiàn)親水性。

2.2.2SmREM1.2蛋白跨膜結構及信號肽預測利用TMHMM對SmREM1.2的跨膜區(qū)進行預測，經分析SmREM1.2蛋白的氨基酸序列不存在跨膜結構。

運用SignalP 6.0對SmREM1.2蛋白進行信號肽序列預測，未預測到信號肽裂解位點，表明SmREMl.2蛋白不具有信號肽，該蛋白屬于非分泌型蛋白。

2.2.3SmREM1.2蛋白保守結構域預測

利用NCBI的CDD（Conserved

Domain

Database）數(shù)據(jù)庫分析SmREM1.2蛋白序列中的保守結構域，結果（圖3）顯示，該蛋白中存在Remorin家族保守的Remorin_N和Remorin_C結構域，表明其屬于Re-monn基因家族。

2.2.4SmREM1.2蛋白二級結構SOPMA預測分析結果（圖4）顯示，SmREM1.2蛋白的二級結構中存在由116個氨基酸組成的a螺旋、由59個氨基酸組成的無規(guī)則卷曲、由14個氨基酸組成的延伸鏈、由5個氨基酸組成的I3轉角，分別占比59.79%、30.41%、7.22%、2.58%。

2.2.5SmREM1.2蛋白的同源性分析

將SmREM1.2蛋白序列與AtREM1亞家族的4條蛋白序列進行多重比對，結果（圖5）發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2與擬南芥AtREM1亞家族蛋白的同源性均達到90%，且C端都具有高度保守的coiled-coil模體，屬于典型的REM蛋白。

2.2.6SmREM1.2的系統(tǒng)進化分析

以SmREM1.2蛋白序列為目的序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索鑒定出9個不同物種的同源序列，進行比對分析并構建進化樹，結果（圖6）發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2與同屬物種芡歐鼠尾草的REM蛋白同源性較高，聚類關系最近。

2.3SmREM1.2的亞細胞定位分析

蛋白亞細胞定位分析可以反映目的基因編碼的蛋白在細胞內的定位及空間分布，而由基因的空間分布可知基因發(fā)揮功能的場所，從而為基因功能的研究提供線索。為了進一步分析SmREM1.2在細胞內的生物學功能，本研究構建了pCAMBIA1300-SmREM1.2-GFP重組載體（以下簡稱SmREM1.2-CFP），并以AtCBL1-mCherry作細胞質膜標記，將其轉化進農桿菌中，用農桿菌注射煙草葉片，使其在煙草葉片細胞中表達，取SmREM1.2-GFP和AtCBL1-mCherry共表達的煙草葉片，運用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，對SmREM1.2進行亞細胞定位分析，結果（圖7）顯不SmREM1.2-GFP與質膜定位的AtCBL1蛋白具有明顯共定位，表明SmREM1.2定位于細胞膜上，是質膜結構相關蛋白。

2.4SmREM1.2基因在鹽脅迫下的表達分析

已有報道表明REM蛋白是植物逆境脅迫應答相關蛋白，參與植物耐鹽脅迫調控過程。為了探索SmREM1.2對鹽脅迫的響應情況，本研究對丹參幼苗進行鹽脅迫（250 mmol/L NaCl）處理，測定處理0、3、6、12h的SmREM1.2相對表達量，結果（圖8）顯示，鹽脅迫使SmREM1.2基因顯著上調表達，處理6h的相對表達量最高，約為0h的5.1倍，之后該基因的表達量又顯著下降。

3討論與結論

Remorin蛋白是陸生植物特有的蛋白之一，可與細胞質膜上的脂筏相連，調控脂筏微區(qū)的形成，改變膜的流動性，影響胼胝體的積累，控制胞間連絲的關閉，調節(jié)植物對病原菌侵染的抵御能力及對逆境脅迫的響應過程。Remorin蛋白通常以聚集形式發(fā)揮功能，可以組裝成纖維狀聚合體，但這種聚集會影響Remorin蛋白被招募上膜的過程。Remorin蛋白包含N端可變區(qū)、中央盤繞（coiled-coil，CC）結構域及C端的膜錨定區(qū)（C-terminal anchor，CA）。其中，CC結構域參與Remorin蛋白多聚體的組裝．CA影響其錨定上膜的過程。本研究通過氨基酸序列比對分析，確定SmREMI.2包含Remorin蛋白家族特征性CC結構域，初步證明了SmREM1.2屬于Remorin蛋白家族成員，推測其也具備形成多聚體的理化特性。

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2蛋白與多種植物Remorin蛋白的同源性都較高，說明Remorin蛋白進化較穩(wěn)定，在多物種間具有普遍功能，對于植物細胞內生命活動具有重要意義。進一步的生物信息學預測發(fā)現(xiàn)SmREM1.2蛋白是親水性蛋白，無明顯的信號肽切割點，不是分泌蛋白，這與已報道的Remorin蛋白的性質相似。二級結構預測表明SmREM1.2蛋白存在大量的a螺旋和無規(guī)則卷曲，僅含有極少量的延伸鏈及轉角，這間接證實了SmREM1.2蛋白包含CC結構域，是Remorin蛋白家族的成員。跨膜結構域預測表明Remorin蛋白不包含明顯的跨膜結構，不是典型的跨膜蛋白。本研究將SmREM1.2克隆到GFP融合表達載體上，并進行亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其定位于細胞膜上，這為探索該蛋白的細胞膜功能提供了依據(jù)。

研究表明，Remorin蛋白參與植物對逆境脅迫的應答過程，可增強植物對干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫等的抵御能力。本研究利用qRT-PCR法分析發(fā)現(xiàn)SrnREM1.2基因受到鹽脅迫的誘導顯著上調表達，表明其可能參與調控丹參對鹽脅迫的應答。

本研究結果為探索SmREM1.2在丹參耐逆調控上的功能奠定了理論基礎，也為研究丹參中Remorin蛋白的作用模式提供了新思路。