摘要目的：探究miR-182-5p對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而以更好的闡明miR-182-5p在心肌梗死中的作用和意義。方法：構(gòu)建大鼠心肌梗死模型，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法（TUNEL）法檢測(cè)心肌凋亡、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）及蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)miR-182-5p及凋亡相關(guān)分子的表達(dá)。使用miR-182-5p mimics及inhibitor轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞H9c2，構(gòu)建缺氧模型，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力，Western Blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平，半胱氨酰蛋白酶3/7（Caspase-3/7）活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3/7的活性。使用pAAV9-CMV腺相關(guān)病毒構(gòu)建miR-182-5p的過(guò)表達(dá)病毒，通過(guò)尾靜脈注射至心肌梗死模型小鼠體內(nèi)，檢測(cè)AAV9-miR-182-5p對(duì)心肌梗死誘導(dǎo)的心肌凋亡水平的影響。結(jié)果：大鼠心肌梗死模型中miR-182-5p表達(dá)水平減少，且細(xì)胞凋亡水平增加。在H9c2心肌缺氧模型中，miR-182-5p可以加重缺氧對(duì)心肌細(xì)胞活力的抑制，并減少抗凋亡分子B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、增加促凋亡分子Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)，同時(shí)對(duì)Caspase-3/7的活性有明顯的促進(jìn)作用。而AAV9-miR-182-5p的注射可以顯著加重小鼠心肌梗死模型中心肌細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)論：miR-182-5p可以加重心肌梗死下的心肌損傷，其途徑是通過(guò)促進(jìn)凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞心肌梗死；miR-182-5p；心肌缺氧；細(xì)胞凋亡；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.011

Mechanism of miR-182-5p Promoting Myocardial Cell Apoptosis in Rats with Myocardial Infarction

PEI Yajun， WANG Yanhong

Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， Shanxi， China; Third Hospital of Shanxi Medical University（Shanxi Bethune Hospital， Shanxi Academy of Medical Sciences， Tongji Shanxi Hospital）， Taiyuan 030032， Shanxi， China

Corresponding AuthorWANG Yanhong， E-mail： wangyanhongmail@126.com

AbstractObjective：To investigate the mechanism of miR-182-5p promoting myocardial cell apoptosis in rats with myocardial infarction.Methods：Myocardial infarction model of rats was constructed.Myocardial apoptosis was detected by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.The expression of miR-182-5p and apoptosis-related molecules were detected by real-time quantitative fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western Blot.miR-182-5p mimics and inhibitor transfected rat cardiomyocytes H9c2 to construct hypoxia model.Cell count Kit 8（CCK-8） was used to detect cardiomyocyte cell viability.The expression levels of apoptosis-related factor were detected by Western Blot.Caspase-3/7 activity detection kit was used to detect the activity of Caspase-3/7.The overexpression virus of miR-182-5p was constructed using pAAV9-CMV adeno-associated virus and injected into the mouse model of myocardial infarction through the tail vein to detect the effect of AAV9-miR-182-5p on the level of myocardial apoptosis induced by myocardial infarction.Results：The expression level of miR-182-5p decreased and the apoptosis level increased in the rat model of myocardial infarction.In H9c2 myocardial hypoxia model，miR-182-5p could aggravate the inhibition of hypoxia on cardiomyocyte viability，reduce the anti-apoptotic molecule B-cell lymphoma 2（Bcl-2），and increase the expression of pro-apoptotic molecule Bcl-2 associated X protein（Bax）.At the same time，the activity of Caspase-3/7 was significantly promoted.The injection of AAV9-miR-182-5p significantly increased the level of apoptosis of cardiomyocytes in mouse myocardial infarction models.Conclusion：miR-182-5p can aggravate myocardial damage after myocardial infarction by promoting apoptosis.

Keywords myocardial infarction; miR-182-5p; myocardial hypoxia; cell apoptosis; experimental study

心血管疾病是全球三大死亡疾病之一，其中，心肌缺血導(dǎo)致的心肌梗死是其主要因素，心肌梗死已成為最常見(jiàn)的單一死亡病因［1-2］。目前，針對(duì)心肌梗死的治療主要是通過(guò)冠狀動(dòng)脈搭橋、溶栓等恢復(fù)心肌血流供應(yīng)的再灌注療法，但是由缺血再灌注造成的心率失常發(fā)作、心肌功能失常及心肌梗死面積的增加等又成為治療過(guò)程中新的難題［3-5］。因此，探究心肌梗死的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于心肌梗死的診治非常重要。

miR-182-5p是一種內(nèi)源性短鏈非編碼的RNA分子，在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)抑制翻譯或誘導(dǎo)降解靶mRNA的功能。研究表明，miR-182-5p在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心室重塑等心血管疾病方面具有重要作用［6-8］。miR-182-5p可作為慢性心力衰竭病人預(yù)后良好的預(yù)測(cè)因素，為心肌疾病的診斷、治療以及預(yù)后提供新的策略［9-11］。在心肌梗死的體內(nèi)外模型中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-182-5p可顯著減少缺血缺氧造成的心肌損害［12-13］。而促進(jìn)miR-182-5p的表達(dá)，可緩解心肌梗死、提高心肌存活，體現(xiàn)miR-182-5p對(duì)心肌功能的保護(hù)作用［14］。然而miR-182-5p在心肌梗死中的確切作用機(jī)制尚不明確。

由缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞死亡最主要的表現(xiàn)形式之一為細(xì)胞凋亡，是心肌梗死后心肌細(xì)胞持續(xù)丟失，從而造成心室重構(gòu)、心力衰竭、心源性猝死的重要原因［15-17］。減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生是改善梗死心肌損傷的重要研究方向，并成為判斷分子/藥物/處理因素等對(duì)心肌梗死影響的重要參考指標(biāo)［18-19］。本研究擬觀察心肌梗死及缺氧前后，miR-182-5p對(duì)心肌凋亡的影響，為闡明miR-182-5p對(duì)心肌梗死的分子病理機(jī)制研究提供更為確切的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)8～10周齡成年健康雄性SD大鼠36只，實(shí)驗(yàn)大鼠心肌梗死模型用于檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡、miR-182-5p及凋亡相關(guān)分子的表達(dá)水平。體質(zhì)量220～280 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。SD大鼠自購(gòu)回后保持自由飲水、進(jìn)食，溫度23～25 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為假手術(shù)（Sham）組和心肌梗死組。

SPF級(jí)8周齡C57BL/6雄性小鼠60只，實(shí)驗(yàn)小鼠心肌梗死模型主要用于驗(yàn)證miR-182-5p在體內(nèi)對(duì)心肌梗死的影響。體質(zhì)量20 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

所有動(dòng)物飼養(yǎng)于北京邁德康納動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度60%，采用明暗各12 h交替的動(dòng)物照明光循環(huán)照明，動(dòng)物飲用水及籠具經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌處理，飼料及墊料均經(jīng)輻照處理，自由飲水，每天更換1次墊料。動(dòng)物在動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模。

1.2主要試劑

DMEM（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，胰酶和Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京生東科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，Lipofectamine3000和TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）和活性氧（ROS）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。

1.3心肌梗死模型的構(gòu)建

大鼠心肌梗死模型的構(gòu)建：將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組，每組3只。實(shí)驗(yàn)組采用苯巴比妥鈉麻醉大鼠（用量為100 mg/kg），無(wú)菌環(huán)境下切開(kāi)氣管并插管，連接呼吸機(jī)，調(diào)整頻率為60次/min。左側(cè)胸部去毛碘伏消毒，于第3、第4肋間開(kāi)胸，撕開(kāi)心包，暴露心臟，擠出心臟在左心耳的右緣下1～2 mm處、肺動(dòng)脈圓錐左緣處用圓針穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支下方的心肌表層，用5-0線結(jié)扎，結(jié)扎成功后，可觀察到結(jié)扎血管以下心室壁稍變白，立即將心臟放入胸腔并縫合胸腔，用注射器將胸腔內(nèi)空氣抽出，確定無(wú)開(kāi)放性氣胸后依次縫合胸壁各層組織。對(duì)于假手術(shù)組，僅穿線不結(jié)扎，其他同實(shí)驗(yàn)組。

小鼠心肌梗死模型的構(gòu)建：將小鼠分為空載體組與miR-182過(guò)表達(dá)組，每組3只。其中，空載體組只注射空載體腺相關(guān)病毒，miR-182過(guò)表達(dá)組注射miR-182-5p的腺相關(guān)病毒，兩組均進(jìn)行心肌梗死模型的構(gòu)建。麻醉小鼠，用帶6-0不可吸收絲線的小圓針在左心耳下緣2～3 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD），結(jié)扎成功后心尖瞬間變白，立即用止血鉗撐開(kāi)切口將心臟送回胸腔，收緊荷包關(guān)閉胸腔。

1.4大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

H9c2大鼠胚胎心肌細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，在95%空氣＋5%CO2環(huán)境下進(jìn)行常氧培養(yǎng)。在細(xì)胞匯合度為80%時(shí)使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶消化并傳代，待細(xì)胞匯合度為60%～80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5大鼠心肌細(xì)胞缺氧模型的建立

缺氧實(shí)驗(yàn)的前1 d，按照2.5×106個(gè)細(xì)胞傳代至60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37 ℃培養(yǎng)箱中貼壁過(guò)夜。第2天，預(yù)先使用缺氧操作臺(tái)將氧氣濃度降低到1%以下，在缺氧操作臺(tái)中使用氮?dú)忸A(yù)處理完全培養(yǎng)基以除去氧氣，然后將細(xì)胞放置在缺氧操作臺(tái)進(jìn)行換液，更換完液體，使用缺氧轉(zhuǎn)移倉(cāng)將細(xì)胞放置在1%氧氣濃度的三氣培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)。在0、6、12、24、48 h后分別取樣后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至缺氧操作臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6腺相關(guān)病毒的構(gòu)建與注射

使用pAAV9-CMV_bGI-EGFP-3xFlag-mmu構(gòu)建miR-182-5p的腺相關(guān)病毒，病毒構(gòu)建相關(guān)過(guò)程委托天津舍維斯生物進(jìn)行。病毒收集后保存至－80 ℃冰箱備用。然后進(jìn)行病毒尾靜脈的注射，將小鼠放置在固定槽中，固定槽背部有數(shù)個(gè)可將尾巴穿過(guò)的小孔，將尾巴從小孔中穿出后，暴露尾靜脈，75%乙醇擦拭，使尾靜脈充分?jǐn)U張，使用4號(hào)針頭，將純化后的腺相關(guān)病毒按照3×1011 PFU的病毒滴度，每只注射50 μL，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，觀察小鼠活動(dòng)、進(jìn)食、飲水等生命體征，取生長(zhǎng)狀況良好的小鼠，取心肌組織后，觀察綠色熒光以及miR-182-5p的表達(dá)水平。將鑒定成功的小鼠用于之后的心肌梗死實(shí)驗(yàn)。

1.7末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

取材后，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定。將組織浸泡乙醇脫水10 min。將脫水后的組織分別浸泡在二甲苯中透明10 min。將透明處理過(guò)的組織浸泡于融化的石蠟中3 h后，包埋，用切片機(jī)將石蠟塊中的組織切成5 μm厚的薄片，并平鋪于防脫玻片上。將切片放置于55 ℃烤片機(jī)上，使組織片緊貼于防脫玻片上，然后進(jìn)行石蠟切片脫蠟復(fù)水后，加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于樣本上，放入濕盒，恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）中孵育60 min；用1×PBS洗滌樣本3次，每次3 min；再使用蘇木素染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色。最后，PBS洗滌3次，用中性樹(shù)脂封固，光鏡下檢查。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè) miR-182-5p的表達(dá)水平

超凈工作臺(tái)中備好去除RNA酶的實(shí)驗(yàn)用品，將不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS沖洗2遍，TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，正向、反向引物（10 mmol/L）各0.5 μL，PCR混合液10 μL，過(guò)氧化氫溶液8 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，引物退火34 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解溫度95 ℃ 1 min，55 ℃ 1min，95 ℃ 15 s。以U6為內(nèi)參對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，使用公式2－ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見(jiàn)表1）。

1.9蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平

配制含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，裂解液成分為：50 mmol/L氯化氫三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCL），150 mmol/L氯化鈉（sodium chloride，NaCl），1%曲拉通 X-100（Triton X-100，Triton X），1%去氧膽酸鈉（sodium deoxycholate），0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）。蛋白酶抑制劑成分為：2 μg/mL抑肽酶（aprotinin）、1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、1 μg/mL亮肽素（Leupeptin）的蛋白酶抑制劑。以上試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。所有實(shí)驗(yàn)操作均在冰上進(jìn)行。裂解蛋白后，雙縮脲蛋白定量法（bicinchoninic acid assay，BCA）法定量，取30 ng的總蛋白上樣。電泳條件為：120 V 15 min，150 V 55 min，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300 mA 2 h。使用含有5%脫脂奶粉的含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with tween-20，PBS-T）封閉1 h，抗體孵育過(guò)夜，使用的抗體稀釋條件為：缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α，NB100-105，1∶1 000；Novus Biologicals），β-肌動(dòng)蛋白（Beta-actin，β-actin，ab49900，1∶10 000，HRP-conjugated；Abcam），B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）（26593-1-ap，1∶1 000；proteintech），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax，ab32503，1∶2 000；Abcam），Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa蛋白相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3，Bnip3，ab109362，1∶1 000；Abcam），腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，P53，ab26，1∶1 000；Abcam），半胱氨酸蛋白酶3（Cysteine-aspartic protease 3，Caspase-3，19677-1-AP，1∶500；proteintech），半胱氨酸蛋白酶7（cleaved Caspase-7）（＃8438，1∶500；CST），裂解多聚ADP核糖聚合酶［cleaved Poly（ADP-ribose）polymerase，cleaved PARP］（#9542，1∶500；CST）。次日，洗膜后，加入山羊抗兔（1∶25000，Bioss Antibodies）、山羊抗小鼠（1∶25 000，Bioss Antibodies）的抗體孵育4 h。使用ChemiDoc MP Imaging System（Bio-Rad Laboratories）進(jìn)行蛋白成像。

1.10miR-182 mimics和inhibitor的轉(zhuǎn)染

miR-182模擬物（mimics）、抑制物（inhibitor）以及對(duì)照物（control）購(gòu)自北京梓熙生物，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）將其轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞，所有操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染完成后，使用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞過(guò)夜，次日更換培養(yǎng)基，24～48 h后驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，驗(yàn)證成功后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.11流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

新鮮心肌組織用眼科剪剪成肉糜狀，磷酸緩沖液反復(fù)清洗去除血細(xì)胞，胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶1∶1比例消化，消化完全后300目網(wǎng)篩過(guò)濾，添加胎牛血清終止消化。160 g/min離心10 min，棄上清，磷酸緩沖液反復(fù)吹打、清洗細(xì)胞，制成心肌細(xì)胞單細(xì)胞懸濁液。5×106個(gè)/mL細(xì)胞取100μL，加 5 μLAnnexinV-PE、1 μL 7-氨基放線菌素D（7-aminoactinomycin D，7AAD）溶液，避光冰上孵育10 min，加400 μL冰的Binding Buffer，30 min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.12CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

檢測(cè)前，計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×104個(gè)/mL的濃度，接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。然后在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，于第2天，將細(xì)胞放置于1%O2、5%CO2、94%N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，同時(shí)設(shè)正常條件下培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后每孔中加入10 μL CCK-8工作液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度（OD）值，去掉最大值與最小值后，每組結(jié)果取平均值，細(xì)胞存活率按照以下公式計(jì)算。細(xì)胞存活率（%）＝（缺氧組OD值－空白組OD值）/（正常組OD值－空白孔OD值）×100。

1.13Caspase-3/7活性水平的檢測(cè)

使用Caspase-3/7細(xì)胞凋亡活性檢測(cè)試劑盒（Sangon Biotech）檢測(cè)Caspase-3/7的活性。準(zhǔn)備兩個(gè)96孔板，每個(gè)96孔板中，將2×104個(gè)細(xì)胞接種于每孔中，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。過(guò)夜貼壁后，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，然后將其中一個(gè)96孔板放置于1%O2、5%CO2、94%N2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，另一個(gè)96孔板放置在5%CO2、95%空氣的正常條件下為對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后，更換Caspase-3/7檢測(cè)緩沖液，并在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育1.5 h，檢測(cè)Ex/Em＝490/525 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.14統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1心肌梗死誘導(dǎo)miR-182-5p降低伴心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生

TUNEL結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠梗死心肌組織凋亡細(xì)胞顯著增加（見(jiàn)圖1），miR-182-5p的表達(dá)水平降低（P＜0.05），詳見(jiàn)圖2，而凋亡相關(guān)分子Bcl-2在心肌梗死后降低，促凋亡分子Bax表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），對(duì)凋亡具有多重影響的HIF-1α表達(dá)水平也上調(diào)（P＜0.05），詳見(jiàn)圖3。H9c2心肌細(xì)胞在缺氧下miR-182-5p的表達(dá)水平隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)（0、6、12、24、48 h）逐漸下降（P＜0.05），展現(xiàn)出與心肌梗死較為一致的趨勢(shì)（見(jiàn)圖4）。表明缺血缺氧造成的心肌細(xì)胞損傷，會(huì)伴隨著凋亡事件的產(chǎn)生，并且會(huì)造成miR-182-5p的表達(dá)水平下降。

2.2抑制miR-182-5p促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞的增殖

結(jié)果顯示，miR-182-5p mimics/inhibitor成功轉(zhuǎn)染至H9c2（見(jiàn)圖5）。在缺氧的不同時(shí)間下（0、24、48 h），miR-182-5p mimics可以抑制心肌細(xì)胞在缺氧48 h下的細(xì)胞活力，miR-182-5p inhibitor可以導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞的活力升高（見(jiàn)圖6）。以上結(jié)果表明，miR-182-5p對(duì)心肌細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.3miR-182-5p對(duì)缺氧心肌細(xì)胞H9c2凋亡水平的影響

結(jié)果顯示，miR-182-5p的過(guò)表達(dá)可以增加心肌細(xì)胞在缺氧下的Caspase-3活性水平，而其抑制可以顯著降低心肌細(xì)胞在缺氧下的Caspase-3活性水平（見(jiàn)圖7）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p的過(guò)表達(dá)可以顯著降低心肌細(xì)胞在缺氧下Bcl-2的表達(dá)、促進(jìn)Bax的表達(dá)，而miR-182-5p inhibitor，可造成心肌細(xì)胞在缺氧下Bcl-2表達(dá)水平的增高以及Bax表達(dá)水平的降低（見(jiàn)圖8、圖9）。以上結(jié)果提示，miR-182-5p對(duì)缺氧心肌凋亡的促進(jìn)作用。

2.4AAV9-miR-182-5p的注入可以加大小鼠心肌梗死的損傷

結(jié)果顯示，AAV9-miR-182-5p注射后，miR-182-5p過(guò)表達(dá)組小鼠心肌組織顯示了明亮的綠色熒光（見(jiàn)圖10），并且較空載體組明顯上升（見(jiàn)圖11），表明成功將AAV9-miR-182-5p感染到小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)。小鼠心肌梗死模型下，AAV9-miR-182-5p可以顯著降低抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)，增加促凋亡分子Bax表達(dá)以及凋亡執(zhí)行分子Caspase-3的活性（見(jiàn)圖12）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，miR-182-5p的表達(dá)可以顯著增加心肌組織凋亡率（見(jiàn)圖13）。以上結(jié)果表明，miR-182-5p是一個(gè)對(duì)梗死心肌有負(fù)面影響的分子，且對(duì)凋亡相關(guān)事件發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。

3討論

本研究結(jié)果顯示，在心肌梗死的體內(nèi)外模型中發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p顯著加重了心肌梗死后的心肌凋亡，并對(duì)心肌功能產(chǎn)生負(fù)面影響。miR-182在人和小鼠中具有相似的表達(dá)模式［20］，但在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)差異較大［21-23］，從而產(chǎn)生特定的調(diào)控作用。研究表明，血清miR-182的上調(diào)可能是慢性心力衰竭的標(biāo)志性分子［6，9，11］，其抑制或表達(dá)增加會(huì)極大地影響心血管疾病的發(fā)展。表明miR-182-5p可能是心肌梗死基礎(chǔ)研究或未來(lái)診治相對(duì)較好的指標(biāo)分子。

研究顯示，抑制miR-182-5p可以改善梗死心肌損傷［24］；而下調(diào)miR-182-5p在缺氧條件下可顯著抑制心肌細(xì)胞的損傷與凋亡［12］。提高miR-182-5p的表達(dá)在缺氧條件下可促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡［25］。另有研究表明，通過(guò)外泌體導(dǎo)入miR-182-5p可靶向調(diào)控TLR4的表達(dá)，抑制多種炎癥通路，顯著提高心肌梗死小鼠的存活率并改善心功能［26］。本研究中，通過(guò)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行不同缺氧梯度處理，以及使用AAV9病毒包裝以實(shí)現(xiàn)基因干預(yù)，觀察到miR-182-5p對(duì)心肌功能和心肌梗死的負(fù)面影響。

缺血性心肌病和一些先天性心臟病的發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞逐漸丟失、膠原支架斷裂、心室擴(kuò)張和心室重塑，是多種心臟不良事件的重要原因［27-29］。目前，針對(duì)miR-182在心肌梗死中對(duì)凋亡途徑的影響，仍有很多不明確的地方。參與凋亡調(diào)控的Bcl家族蛋白，如Bcl-2、Bax等，在啟動(dòng)與抑制凋亡方面起著重要作用。Bcl-2是經(jīng)典的抗凋亡分子，在心肌梗死研究中顯示，其通過(guò)多種機(jī)制抑制凋亡［30-32］。Bax是主要的促凋亡基因，通過(guò)激活Caspase-9和調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體介導(dǎo)的凋亡啟動(dòng)［32-34］。Bax與Bcl-2的比例是決定細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素［35-37］。本研究表明，miR-182-5p通過(guò)促進(jìn)凋亡相關(guān)分子表達(dá)并抑制抗凋亡分子表達(dá)，增加心肌細(xì)胞在缺血缺氧條件下的凋亡，明確了其對(duì)心肌功能的影響。

綜上所述，miR-182-5p是一個(gè)促進(jìn)心肌凋亡的重要指標(biāo)，緩解由其引起的損傷具有重要的臨床意義。探究miR-182-5p在心肌梗死/缺氧條件下對(duì)凋亡分子的具體調(diào)控機(jī)制，尋找關(guān)鍵靶點(diǎn)，是未來(lái)研究的重點(diǎn)，并可能為基因治療心肌梗死提供新的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-10-23）

（本文編輯鄒麗）