摘要：目的 探討解毒祛瘀滋陰方治療狼瘡腎炎（LN）的潛在機制，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。方法 利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫獲得解毒祛瘀滋陰方治療狼瘡腎炎（LN）的潛在作用靶點；構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖及“藥物—成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡圖，確定核心作用靶點；進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，探討解毒祛瘀滋陰方治療狼瘡腎炎的潛在機制。利用AutoDock軟件進行分子對接驗證有效成分和靶點的結(jié)合活性。結(jié)果 解毒祛瘀滋陰方與治療狼瘡腎炎相關(guān)的成分有136種，作用靶點有85個。其中槲皮素、木犀草素、山柰酚等為核心成分，AKT1、TNF、IL6等為核心靶點。作用機制可能為參與氧化應激等生物過程。分子對接顯示，有效成分和靶點之間結(jié)合能較高。結(jié)論 解毒祛瘀滋陰方含有多種成分，可作用于多個靶點，并參與多個生物過程和信號通路，治療狼瘡腎炎療效明顯。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡藥理學；分子對接；解毒祛瘀滋陰方；狼瘡腎炎；腎痹

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種原因不明的系統(tǒng)免疫性疾病，可導致多種組織和器官損傷，其中最嚴重的器官表現(xiàn)之一便是狼瘡腎炎（LN）[1]，這也是導致SLE患者死亡的重要原因[2～3]。LN的治療通常選用免疫抑制劑，然而接受免疫抑制療法的患者仍有一定的復發(fā)率，同時藥物毒性也是不容忽視的問題。中醫(yī)學將LN歸屬于“腎臟風毒、腎痹”等范疇[4～5]。研究認為[6]，LN屬本虛標實之證，病因病機復雜多樣，大致歸納為虛、熱、瘀、毒。解毒祛瘀滋陰方主要組成是生地、鱉甲、積雪草、赤芍、青蒿、薏苡仁、升麻、白花蛇舌草、佛手和生甘草，臨床發(fā)現(xiàn)此方協(xié)同糖皮質(zhì)激素治療SLE可以起到減毒增效的作用，對于LN也有著良好療效[7]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法探討解毒祛瘀滋陰方治療LN的潛在作用機制。

1材料與方法

1.1 藥物有效成分及作用靶點收集

在TCMSP數(shù)據(jù)庫、HERB數(shù)據(jù)庫中，以生物利用度＞30%、類藥性＞0.18為限定條件，檢索得到解毒祛瘀滋陰方組成藥物積雪草、赤芍、青蒿、薏苡仁、升麻、白花蛇舌草、佛手、生甘草的有效成分，以及有效成分的靶點蛋白。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將蛋白信息轉(zhuǎn)換為基因信息，用于后續(xù)分析。

使用關(guān)鍵詞結(jié)合自由詞的方法在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫以及DrugBank數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取LN相關(guān)靶點基因信息。將解毒祛瘀滋陰方靶點信息和LN靶點信息導入Rstudio中，運行代碼對兩者取交集，得到兩者共同靶點，即解毒祛瘀滋陰方治療LN的潛在靶點。

1.2 “藥物—成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡圖的繪制

構(gòu)建解毒祛瘀滋陰方組成藥物、有效成分、作用靶點、LN四者之間映射關(guān)系，將相關(guān)文件導入Cytoscape中進行可視化處理，繪制“藥物—成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡圖，并利用Analyze Network工具，分析得到網(wǎng)絡圖的拓撲學信息。

1.3 PPI網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中，上傳作用解毒祛瘀滋陰方治療狼瘡腎炎的靶點信息，將物種選擇“Homo sapiens”，可信度設置為≥0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖，并導出文件“string_hires_image.png”和“string_interactions.tsv”。

1.4 PPI網(wǎng)絡核心靶點的獲取

將上述得到的“string_interactions.tsv”文件導入Rstudio中，對PPI網(wǎng)絡進行分析，計算PPI網(wǎng)絡中的各節(jié)點的度值，度值高的節(jié)點則為核心節(jié)點，其代表的靶點則為核心靶點。

1.5 富集分析

利用Rstudio和clusterProfiler包，對作用靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并繪制氣泡圖，預測解毒祛瘀滋陰方治療LN作用的細胞組分、發(fā)揮的分子功能，以及參與的生物過程和信號通路。

1.6 有效成分與靶點的分子對接驗證

根據(jù)有效成分和靶點在“藥物—成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡圖與PPI網(wǎng)絡圖的度值排名，同時參考相關(guān)文獻的報道，選取部分有效成分和靶點進行分子對接，對其結(jié)合活性進行驗證。本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得有效成分的立體結(jié)構(gòu)文件，并通過PDB數(shù)據(jù)庫獲取靶點蛋白立體結(jié)構(gòu)文件。將相關(guān)文件導入AutoDock軟件進行分子對接，并將對接結(jié)果導入Rstudio繪制結(jié)合能熱圖，利用PYMOL軟件展示對接結(jié)果立體結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

2.1 解毒祛瘀滋陰方治療狼瘡腎炎潛在作用靶點

經(jīng)過檢索及篩選，解毒祛瘀滋陰方組成藥物的有效成分為白花蛇舌草7種、鱉甲16種、赤芍29種、丹皮11種、佛手5種、甘草92種、積雪草3種、青蒿22種、生地8種、升麻17種和薏苡仁9種。經(jīng)過篩選，用于后續(xù)研究分析的有效成分為白花蛇舌草5種、鱉甲4種、赤芍13種、丹皮6種、佛手4種、甘草88種、積雪草2種、青蒿19種、生地3種、升麻8種和薏苡仁6種。進行整合去重，最終得到解毒祛瘀滋陰方的有效成分136種，同時得到解毒祛瘀滋陰方有效成分的作用靶點共257個。

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到LN的潛在靶點881個，在OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索得到3個靶點信息，在DrugBank數(shù)據(jù)庫中檢索得到51個靶點信息。經(jīng)過整合及去重，得到用于后續(xù)研究分析的LN潛在靶點917個。對解毒祛瘀滋陰方有效成分的靶點基因和LN潛在靶點基因取交集，得到共同靶點85個，即解毒祛瘀滋陰方治療狼瘡腎炎的潛在作用靶點。

2.2 “藥物—成分—疾病—靶點”網(wǎng)絡圖

利用Cytoscape對解毒祛瘀滋陰方組成藥物、有效成分、作用靶點以及LN之間映射關(guān)系進行可視化處理，繪制“藥物—成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡圖（見圖1）。通過Analyze Network工具分析，得出網(wǎng)絡圖中共有218個節(jié)點，1 035條邊，網(wǎng)絡密度為0.044。其中槲皮素、木犀草素、山柰酚為度值較高的成分，度值分別為72、29、28。因此，槲皮素、木犀草素、山柰酚為解毒祛瘀滋陰方的核心成分，主要存在于青蒿中。

2.3 PPI網(wǎng)絡圖的構(gòu)建及核心靶點的預測

將靶點信息導入STRING數(shù)據(jù)庫，導入作用靶點信息，在物種選擇欄中選擇“Homo sapiens”，將可信度設置為≥0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。在Rstudio中對PPI網(wǎng)絡中各節(jié)點的度值進行分析，發(fā)現(xiàn)度值排名前十的節(jié)點為AKT1、TNF、IL6、TP53、CASP3、PTGS2、CXCL8、IL10、STAT3、MMP9，度值分別為70、70、69、67、61、61、60、59、59、56。因此為核心節(jié)點，其代表的基因則為核心基因。

2.4 富集分析

在Rstudio中，通過clusterProfiler包及相關(guān)代碼，進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，預測解毒祛瘀滋陰方醫(yī)治LN可能的作用機制。進行GO分析時，以P＜0.05為限定條件進行篩選，共在2 161個條目中發(fā)生富集，其中細胞組分方面富集到35個條目，主要為膜區(qū)、囊泡及細胞外基質(zhì)等。生物過程方面富集到2 033個條目，主要為化學應激反應、氧化應激反應以及對藥物的反應等。分子功能方面富集到93個條目，主要與細胞因子結(jié)合及受體活性等相關(guān)。進行KEGG分析時，按照P＜0.05進行篩選，共對144條信號通路發(fā)生富集，主要為Lipid and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis等心血管疾病相關(guān)通路。

2.5 有效成分與靶點分子對接驗證

選取有效成分槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、黃芩素（baicalein）、芒柄花素（formononetin）、異鼠李素（isorhamnetin）、柚皮素（naringenin）、甘草素（glyzaglabrin）、青蒿素（artemisinin）、芍藥苷（paeoniflorin）與靶點AKT1、TNF、PPARG、CASP3、MAPK1、STAT3、MMP9進行分子對接驗證結(jié)合活性。其中，結(jié)合能＞4.25 kcal/mol 表示分子與靶點之間有一定的結(jié)合活性；結(jié)合能＞5.0 kcal/mol 表明結(jié)合活性較好；結(jié)合能＞7.0 kcal/mol 則表示結(jié)合活性很強。對各有效成分與靶點的結(jié)合能繪制熱圖（見圖2）。其中，青蒿素與MMP9的結(jié)合能絕對值最高，顯示其結(jié)合活性最好，其立體結(jié)構(gòu)見圖3。

3討論

SLE可引起多器官和系統(tǒng)的損傷，LN是其中最嚴重的器官表現(xiàn)，也是導致SLE患者死亡的重要原因，因此探討LN的治療方法具有重要意義。中藥復方憑借多成分、多作用靶點、多系統(tǒng)調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，在治療LN方面有著巨大潛力。本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法預測了解毒祛瘀滋陰方治療LN的有效成分及作用靶點，通過GO富集分析與KEGG富集分析探討了可能的分子機制及信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀滋陰方含有136種與治療LN相關(guān)的有效成分，可作用于人體中85個靶點。進一步分析發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀滋陰方治療LN的核心作用靶點為AKT1、TNF、IL6等。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀滋陰方主要成分主要參與氧化應激反應。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀滋陰方所作用的靶點主要與心血管疾病通路相關(guān)?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化相關(guān)通路，延緩LN進展，提高患者生存率。此外，本研究通過分子對接驗證有效成分與靶點的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)各有效成分與靶點之間結(jié)合活性較好，其中青蒿素與MMP9的結(jié)合活性最好。

綜上所述，解毒祛瘀滋陰方含有多種成分，可作用于多個靶點，并參與多個生物過程和信號通路，治療狼瘡腎炎療效明顯。

參考文獻

[1]沈南，趙毅，段利華，等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡診療規(guī)范[J].中華內(nèi)科雜志，2023，62（7）：775-784.

[2]張輝，楊念生，魯靜，等.狼瘡腎炎診療規(guī)范[J].中華內(nèi)科雜志，2021，60（09）：784-790.

[3]周華，張婭妮，覃嘉寧，等.狼瘡腎炎診治新進展[J].實用藥物與臨床，2021，24（5）：385-389.

[4]胡宏圖，梁偉，丁國華.狼瘡腎炎病情活動相關(guān)生物標志物的研究進展[J].臨床腎臟病雜志，2022，22（5）：433-437.

[5]李偉，齊振強.狼瘡腎炎的中醫(yī)中藥治療[J].中華腎病研究電子雜志，2019，8（1）：10-12.

[6]李麗麗，王翔鵬，向陽.狼瘡性腎炎病因病機探析[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2017，6（11）：58-60，71.

[7]黃少華.解毒祛瘀滋陰方及方中主要藥物對狼瘡性腎炎的干預研究[D].杭州：浙江中醫(yī)藥大學，2013.