摘要：研究基于鎘脅迫下棉花幼苗根系的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定獲得16個(gè)棉花SOD基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：16個(gè)棉花SOD基因編碼的蛋白長度為127～333 aa，相對(duì)分子質(zhì)量為13 048.69～35 974.31 Da，等電點(diǎn)為4.43～8.50，均為非分泌蛋白，且都無跨膜結(jié)構(gòu)特征，表現(xiàn)為親水性；其中75%屬于酸性蛋白，69%屬于穩(wěn)定蛋白；大部分亞細(xì)胞定位在葉綠體；16個(gè)棉花SOD可分為Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3個(gè)亞家族，3個(gè)亞家族均含有各自的保守基序，其中Fe-SOD和Mn-SOD亞家族親緣關(guān)系較近，推測(cè)兩者功能更相似。棉花SOD家族基因的鑒定、分析對(duì)棉花SOD基因功能及鎘響應(yīng)機(jī)制研究具有借鑒意義，可為篩選耐鎘棉花品種提供基因資源。

關(guān)鍵詞：棉花；鎘；轉(zhuǎn)錄組；SOD；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）08-0001-05

Bioinformatics of the SOD Gene Family in Cotton

KUANG Zheng-cheng，YANG Chun-an，LI Yu-jun，LI Fei，HUANG Hui，CHEN Hao-dong，

GONG Yang-cang，XIAO Cai-sheng，F(xiàn)U Lin

（Hunan Cotton Science Institute， Changde 415101， PRC）

Abstract： From the transcriptome sequencing data of cotton seedling roots under cadmium （Cd） stress， 16 genes encoding superoxide dismutase （SOD） in cotton were identified and subjected to bioinformatics analysis. The results showed that the proteins encoded by the 16 SOD genes were non-secretory and hydrophilic and had the lengths of 127-333 aa， relative molecular weights of 13 048.69-35 974.31 Da， isoelectronic points of 4.43-8.50， and no transmembrane domain. Among the proteins， 75% were acidic proteins and 69% were stable proteins. Most of the subcells were located in chloroplasts. The 16 SOD belonged to three subfamilies， namely， Fe-SOD， Mn-SOD， and Cu/Zn-SOD， each of which had its own conserved motifs. The Mn-SOD and Fe-SOD subfamilies had close genetic relationship， which indicated that they had similar biological functions. The identification and characterization of the SOD family members in cotton lay a foundation for probing into the molecular mechanism of SOD genes in response to Cd stress and provide genetic resources for breeding the cotton cultivars with Cd tolerance.

Key words： cotton; cadmium; transcriptome; superoxide dismutase （SOD）; bioinformatics

收稿日期：2024-03-02

基金項(xiàng)目：棉花生物育種與綜合利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（CB2023A10）

作者簡介：匡政成（1988—），男，湖南祁東縣人，副研究員，主要從事作物遺傳育種研究。

通信作者：傅淋

植物受到非生物脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），適當(dāng)?shù)腞OS能提高植物對(duì)脅迫的抗性，但過量的ROS會(huì)損傷細(xì)胞膜，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育[1]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是一種活性氧代謝酶，在生物體內(nèi)廣泛存在，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧氣和過氧化氫，以維持生物體內(nèi)活性氧平衡[1-2]。大量研究表明，SOD在植物響應(yīng)鎘脅迫中發(fā)揮著重要作用[3-4]。因此，研究基于鎘脅迫下棉花幼苗根系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定得到棉花SOD基因家族成員，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為后期深入分析棉花SOD基因響應(yīng)鎘脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為篩選耐鎘棉花品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 棉花SOD基因鑒定

C184幼苗由湖南省棉花科學(xué)研究所培育，基于鎘脅迫下C184幼苗根系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及注釋結(jié)果，獲得棉花SOD基因序列。其中，鎘濃度分別為0 mmol/L（對(duì)照）和5 mmol/L。使用在線工具ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）和CD"Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)序列進(jìn)行檢測(cè)確認(rèn)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析由深圳華大基因股份有限公司完成。

1.2 棉花SOD蛋白理化性質(zhì)分析

使用在線工具ExPaSy ProtParam（https：//web.expasy."org/protparam/）和TMHMM 2.0（https：//services. healthtech."dtu. dk/services/TMHMM-2.0/）對(duì)棉花SOD基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。使用在線工具SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）和CELLO v2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位。

1.3 棉花SOD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從Phytozome數(shù)據(jù)庫下載擬南芥的SOD家族蛋白序列數(shù)據(jù)，將其作為參考，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建棉花SOD系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 棉花SOD蛋白基序及結(jié)構(gòu)分析

通過在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org/）分析棉花SOD蛋白的保守基序。使用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma_f.html）和SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行棉花SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花SOD基因家族序列信息

根據(jù)鎘脅迫下C184幼苗根系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得16個(gè)棉花SOD基因家族成員。由表1可知，16個(gè)棉花SOD基因分布于5個(gè)染色體上，其中染色體Chr.1、Chr.6、Chr.9、Chr.11和Chr.13上分別有2、2、2、2和4個(gè)。16個(gè)棉花SOD基因家族成員的基因長度為384～1 002 bp，平均長度為680.25 bp，其中最長的是CotAD25396，最短的是CotAD64359。對(duì)其特征結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CotAD10546、CotAD12067、CotAD38114、CotAD40102共4個(gè)基因?qū)儆贔e-SOD類，CotAD02550、CotAD16779、CotAD20136、CotAD64649共4個(gè)基因?qū)儆贛n-SOD類，其余8個(gè)基因?qū)儆贑u/Zn-SOD類。

2.2 棉花SOD家族蛋白理化性質(zhì)分析

由表2可知，棉花SOD家族蛋白長度為127～333 aa，其中最短的是CotAD64359蛋白，最長的是CotAD25396蛋白；相對(duì)分子質(zhì)量為13 048.69～35 974.31 Da，最小的是CotAD64359蛋白，最大的是CotAD40102蛋白；等電點(diǎn)為4.43～8.50，其中12個(gè)屬于酸性蛋白，4個(gè)屬于堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為9.20～45.30，其中CotAD02550、CotAD12067、CotAD16779、CotAD30229、CotAD38114、CotAD40102、CotAD51044、CotAD55839、CotAD55984、CotAD56310、CotAD64359這11個(gè)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白。利用CELLO v2.5進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)棉花SOD家族蛋白成員的亞細(xì)胞定位較為廣泛，其中CotAD10546定位于細(xì)胞核，CotAD02550、CotAD16779、CotAD20136、CotAD64649共4個(gè)蛋白定位于線粒體，CotAD51044、CotAD55839、CotAD55984、CotAD64359共4個(gè)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，其余7個(gè)蛋白定位于葉綠體。利用TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)16個(gè)棉花SOD蛋白均無跨膜結(jié)構(gòu)特征，均不具備跨膜功能；利用SignalP 5.0對(duì)16個(gè)棉花SOD蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)棉花SOD蛋白均不含信號(hào)肽，為非分泌蛋白。另外，棉花SOD蛋白的總平均親水性均為負(fù)值，表明它們均具有親水性。

2.3 棉花SOD家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖1可知，棉花SOD蛋白可以分為Fe-SOD亞家族蛋白、Mn-SOD亞家族蛋白和Cu/Zn-SOD亞家族蛋白3個(gè)分支。Fe-SOD亞家族蛋白可進(jìn)一步細(xì)分為A-I和A-II 2個(gè)類型，其中CotAD40102和CotAD10546屬于A-I分支，CotAD12067和CotAD38114屬于A-II分支。Mn-SOD亞家族蛋白則可以分B-I和B-II 2個(gè)類型，其中B-I分支中均為擬南芥Mn-SOD蛋白，B-II分支中均為棉花Mn-SOD蛋白；Cu/Zn-SOD亞家族蛋白可以分C-I、C-II和C-III 3個(gè)類型，C-I和C-II分支中均為棉花Cu/Zn-SOD蛋白，C-III分支包含CotAD55984、CotAD51044、CotAD56310、CotAD30229這4個(gè)棉花Cu/Zn-SOD蛋白和5個(gè)擬南芥Cu/Zn-SOD蛋白。

2.4 棉花SOD家族保守基序分析

對(duì)16個(gè)棉花SOD的氨基酸序列進(jìn)行Motif查找，設(shè)置查找Motif數(shù)目為10個(gè)，其余參數(shù)為默認(rèn)值，結(jié)果如圖2所示。16個(gè)棉花SOD蛋白含有2～7個(gè)保守基序，CotAD64359僅2個(gè)保守基序，CotAD02550、CotAD16779、CotAD20136和CotA64649保守基序相對(duì)較多，均有7個(gè)保守基序。10個(gè)基序在不同亞家族中的分布具有差異，其中Fe-SOD亞家族成員均具有Motif1、Motif2、Motif7和Motif9；Mn-SOD亞家族成員均具有Motif1、Motif2、Motif3、Motif5、Motif7、Motif9和Motif10；Cu/Zn-SOD亞家族成員均具有Motif2和Motif6。

2.5 棉花SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由表3可知，棉花SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。其中，F(xiàn)e-SOD亞家族蛋白中，α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占比44.59%、36.25%、14.71%和4.45%；Mn-SOD亞家族蛋白中，α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占比52.50%、29.60%、13.45%和4.45%；Cu/Zn-SOD亞家族蛋白中，無規(guī)則卷曲占比較大，平均為52.58%，β-轉(zhuǎn)角占比較小，平均為6.56%。

從圖3可以清楚地觀察到16個(gè)棉花SOD蛋白的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等空間結(jié)構(gòu)。3個(gè)亞家族間以及同一亞族不同蛋白之間的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和隨機(jī)卷曲比例均不相同，從而導(dǎo)致16個(gè)棉花SOD蛋白出現(xiàn)空間結(jié)構(gòu)差異和功能分化。同時(shí)，16個(gè)棉花SOD蛋白全球性模型質(zhì)量估測(cè)（GMQE）值為0.75～0.96，都比較接近1，由此可以推測(cè)16個(gè)棉花SOD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果可靠性較高。

3 討論與結(jié)論

棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織工業(yè)原材料，具有生物量大、吸收累積鎘能力較強(qiáng)、主產(chǎn)品棉纖維不進(jìn)入食物鏈等優(yōu)勢(shì)，是鎘污染耕地安全利用最理想的農(nóng)作物之一[5-6]?！丁笆奈濉比珖N植業(yè)發(fā)展規(guī)劃》提出“引導(dǎo)灘涂地、鹽堿地、重金屬污染區(qū)適當(dāng)擴(kuò)種棉花”[7]。因此研究棉花耐鎘脅迫的分子機(jī)制與培育耐鎘棉花品種具有重要意義。

棉花響應(yīng)鎘脅迫與SOD活性密切相關(guān)。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)相較未處理的棉花幼苗根系SOD而言，鎘處理的棉花幼苗根系SOD的表達(dá)水平上調(diào)，SOD活性也顯著提高；肖才升等[5]發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L 鎘脅迫下棉花幼苗根部干物質(zhì)質(zhì)量和SOD活性顯著降低；陳悅等[9]發(fā)現(xiàn)低濃度鎘脅迫初期，棉花SOD活性較高，但隨著鎘濃度提高，SOD活性明顯下降，得到SOD的抗氧化能力是臨時(shí)而有限的結(jié)論；陳浩東等[10]發(fā)現(xiàn)低濃度鎘脅迫會(huì)使棉花SOD活性出現(xiàn)小幅度的上升，認(rèn)為低濃度鎘脅迫有助于激活棉花細(xì)胞體中抗氧化酶的活性。該研究從鎘脅迫下棉花幼苗根系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定得到16個(gè)SOD基因，說明SOD基因參與了棉花鎘脅迫響應(yīng)，這與前人研究結(jié)論基本一致。

根據(jù)結(jié)構(gòu)域?qū)?6個(gè)棉花SOD基因劃分為Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3個(gè)亞家族，進(jìn)一步進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，75%的棉花Fe-SOD成員分布在葉綠體，100%的Mn-SOD成員分布在線粒體，50%的Cu/Zn-SOD成員分布在葉綠體，50%的Cu/Zn-SOD成員分布在細(xì)胞質(zhì)。這說明葉綠體是Fe-SOD發(fā)揮功能的主要場(chǎng)所，而Mn-SOD主要在線粒體中發(fā)揮作用，Cu/Zn-SOD主要在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，這與前人研究結(jié)論基本相符[11-12]。對(duì)16個(gè)棉花SOD的氨基酸序列進(jìn)行Motif查找發(fā)現(xiàn)，3個(gè)亞家族均含有各自的保守基序，推測(cè)同一亞家族的SOD基因具有相似的生物學(xué)功能。同時(shí)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，同一亞家族的SOD蛋白具有相似空間結(jié)構(gòu)。其中，F(xiàn)e-SOD和Mn-SOD亞家族蛋白中α-螺旋占比較大；Cu/Zn-SOD亞家族蛋白中無規(guī)則卷曲占比較大，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析可知，F(xiàn)e-SOD和Mn-SOD亞家族親緣關(guān)系較近，功能更為相似。

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（責(zé)任編輯：王婷）