摘 要：為研究作為雙酚A替代物的雙酚S（BPS）對金鯽魚中腎抗氧化指標(biāo)的影響，將提前馴養(yǎng)適應(yīng)1周的金鯽魚隨機(jī)分為5組，每組10尾魚。在安全濃度的基礎(chǔ)上，設(shè)置1個(gè)對照組和以等對數(shù)濃度差設(shè)置1、10、100、1 000 μg/L 4個(gè)BPS質(zhì)量濃度組，進(jìn)行為期15 d的急性暴露。試驗(yàn)結(jié)束后分別從每組取3尾魚進(jìn)行采樣，測定金鯽魚中腎中總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）及過氧化氫酶（CAT）含量，分析不同BPS濃度對于金鯽魚中腎抗氧化指標(biāo)的影響。經(jīng)試驗(yàn)得出，在安全濃度的基礎(chǔ)上，隨著BPS濃度的升高，金鯽魚中腎中的CAT活力與總SOD活力顯著降低；MDA含量明顯增加。

關(guān)鍵詞：BPS；金鯽魚；中腎；抗氧化指標(biāo)

魚類是水生態(tài)環(huán)境中重要的組成部分，處于水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的頂端。近十幾年由于雙酚A在環(huán)氧樹脂與聚碳酸塑料工業(yè)生產(chǎn)中被大量使用，其通過多種途徑進(jìn)入環(huán)境并造成污染。雙酚A具有潛在毒性，尤其對機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)的干擾作用已經(jīng)被大量研究證實(shí)，而其對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的毒性也日益明朗。BPA進(jìn)入水環(huán)境中對人類的生存、繁衍造成了巨大威脅[1]。因此，在世界范圍內(nèi)的大部分國家包括中國，生產(chǎn)嬰兒奶瓶及部分嬰兒用品的原材料中已經(jīng)明確禁用BPA[2-3]。為了滿足日益增長的對塑料制品的需求，生產(chǎn)商開始需求更穩(wěn)定，更安全以及更具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的BPA替代品。

雙酚S（BPS）是一類典型的BPA替代物。雙酚S為白色針狀結(jié)晶，堆積密度0.5～0.6 g/cm3，熔點(diǎn)240～241 ℃，易溶于脂肪烴，溶于乙醇、異丙醇、2-乙基已醇、乙腈、丙酮，微溶于芳烴，稍溶于醋酸乙酯、甲異丁酮，不溶于甲苯、水[4-5]。由于BPS中含兩個(gè)羥基和一個(gè)吸電子很強(qiáng)的砜基，故酸性比其他酚類強(qiáng)，但其化學(xué)性質(zhì)卻比BPA更加穩(wěn)定。根據(jù)2015年Kinch等[6]的最新研究報(bào)道，相比于BPA，BPS具有更加明顯的神經(jīng)內(nèi)分泌干擾作用，在極低的濃度（0.000 68 ug/L）已經(jīng)能夠顯著影響斑馬魚的神經(jīng)元的發(fā)育。水體中BPS富集易引發(fā)各種疾病?？寡趸淖饔檬囚~體從根本上預(yù)防疾病，其特征之一是當(dāng)體內(nèi)活性氧自由基增加時(shí)，相應(yīng)的抗氧化酶的活性和抗氧化劑的合成量會受到影響，據(jù)此可以作為機(jī)體受到氧化脅迫的指示[7]。目前相關(guān)報(bào)道主要集中在水生植物或水生動(dòng)物的神經(jīng)元、肝臟中，對于魚類中腎的研究相對較少，因此研究BPS對魚類中腎抗氧化指標(biāo)的影響是很有意義的[8]。

本文以金鯽魚為材料，通過不同濃度的BPS急性暴露（15 d）來研究BPS對于金鯽魚中腎抗氧化系統(tǒng)的影響并探討其致毒機(jī)理，從而為評價(jià)該化合物提供更多的生物監(jiān)測指標(biāo)。研究結(jié)果可為魚類水環(huán)境健康養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

金鯽魚（體長4.5～5.2 cm，體質(zhì)量10.5～12.2 g/尾）、BPS試劑、電子天平、酸度計(jì)、200 W加熱棒、溫度計(jì)、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒、總蛋白定量測試盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、37 ℃恒溫水浴鍋、離心機(jī)、微量移液槍、冰醋酸、無水乙醇、酶標(biāo)儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備 將試驗(yàn)所用到的材料（抄網(wǎng)、溫度計(jì)、加熱棒等）放入配好的含氯消毒水中浸泡消毒，將消毒后的材料進(jìn)行組裝。養(yǎng)殖用水為充分曝氣24 h的自來水，用恒溫加熱棒控制水溫保持在（25.0±1.0）℃，增氧機(jī)控制溶氧在8.5 mg/L以上，pH值7.5±0.5。采購金鯽魚若干，在實(shí)驗(yàn)室水質(zhì)控制條件下，于水溫25 ℃下馴養(yǎng)適應(yīng)1周待用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對照組和4個(gè)BPS質(zhì)量濃度組，分別為1、10 、100、1 000 μg/L，進(jìn)行為期15 d的BPS暴露試驗(yàn)。每缸10尾魚，每天換水1次，早晚定時(shí)投食2次，虹吸法清除殘餌及糞便。暴露試驗(yàn)結(jié)束后分別從各缸取3尾魚，用紗布擦干魚體表面，稱量其體重，記錄數(shù)據(jù)。然后采集中腎器官于凍存管中并置于液氮中冷藏，取樣結(jié)束后放置于-80 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.3 組織勻漿的制備 取事先保存于凍存管中的中腎器官，置于研缽中磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱取器官重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下制備成10%的中腎器官組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.2.4 最佳取樣濃度的確定 先做三只不同取樣量的測試管。分別以說明書舉例的取樣濃度為中間值再往上濃縮一倍和往下稀釋一倍做三只樣本管及一只對照管。按操作表進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以確定最佳取樣濃度。百分抑制率的計(jì)算：（對照管吸光度－測定管吸光度）÷對照管吸光度。最佳取樣濃度范圍：百分抑制率在15%～55%之間（此段曲線基本呈正比曲線關(guān)系）。最佳取樣濃度的選擇：取百分抑制率在45%～50%的這一管的濃度作為最佳取樣濃度[9]。測得試驗(yàn)所需金鯽魚中腎的最佳取樣濃度為1%。

1.2.5 抗氧化指標(biāo)的測定 取最佳取樣濃度下的組織勻漿，采用南京建成生物工程研究所總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒和總蛋白定量測試盒，按操作說明分別測定相應(yīng)指標(biāo)并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5.1 T-SOD活力的測定

總SOD活力=（對照OD值-測定OD值）/對照OD值÷50％×（V總/V樣）÷Cpr，

式中：V總：反應(yīng)液總體積，mL；V樣：取樣量，mL；Cpr：勻漿液蛋白濃度，mg prot/mL（prot指蛋白）。

1.2.5.2 CAT活力的測定

組織中CAT活力=ΔA×271÷V樣÷T÷Cpr，

式中：271為斜率的倒數(shù)，常數(shù)，直接使用；V樣：取樣量，mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 s；Cpr：勻漿液蛋白濃度，mg prot/mL（prot指蛋白）。

1.2.5.3 MDA含量的測定

組織中MDA含量=（測定OD值-對照OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷Cpr，

式中：標(biāo)準(zhǔn)品濃度：10 nmol/mL；Cpr：勻漿液蛋白濃度，mg prot/mL（prot指蛋白）。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。P＜0.05表示組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 BPS對金鯽魚中腎中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的影響

由圖1可知，金鯽魚中腎在受到BPS急性暴露之前，其中腎中T-SOD活力相對較高。在BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d后，中腎中T-SOD活力與對照組相比顯著低于對照組（Plt;0.05）；在BPS濃度為10 μg/L急性暴露15 d后，中腎中T-SOD活力較BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d時(shí)有所下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為1 000 μg/L急性暴露15 d后，中腎中T-SOD活力達(dá)到最小值。總之在整個(gè)急性攻毒階段，金鯽魚中腎中T-SOD的活力較對照組呈下降趨勢，并且在BPS濃度為0 μg/L與1 μg/L、10 μg/L與100 μg/L之間，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 BPS對金鯽魚中腎中過氧化氫酶（CAT）活力的影響

由圖2可知，金鯽魚中腎在受到BPS急性暴露之前，其中腎中CAT活力相對較高。在BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力與對照組相比顯著低于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為10 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力較BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d時(shí)有所下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為100 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力較BPS濃度為10 μg/L急性暴露15d時(shí)有所下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）;在BPS濃度為1 000 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力達(dá)到最小值。總之在整個(gè)急性攻毒階段，金鯽魚中腎中CAT的活力較對照組呈下降趨勢，并且在BPS濃度為0 μg/L與1 μg/L、100 μg/L與1 000 μg/L之間，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 BPS對金鯽魚中腎中丙二醛（MDA）含量的影響

由圖3可知，金鯽魚中腎在受到BPS急性暴露之前，其中腎中MDA含量較低。在BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d后，中腎中MDA含量與對照組相比顯著高于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為10 μg/L急性暴露15 d后，中腎中MDA含量較BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d時(shí)有所上升，且顯著高于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為1 000 μg/L急性暴露15 d后，中腎中MDA含量達(dá)到最大值?？傊谡麄€(gè)急性攻毒階段，金鯽魚中腎中MDA含量較對照組呈上升趨勢，并且在BPS濃度為1 μg/L與10 μg/L、10 μg/L與100 μg/L之間，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

BPS作為BPA的代替物廣泛存在于我們生活的環(huán)境中，而BPA因其會對環(huán)境造成污染，且有明確的毒性，危害動(dòng)物體健康，已被逐步淘汰甚至禁用[10]。魚類中腎由緊接在前腎后面的一系列生腎節(jié)發(fā)育而成，整個(gè)中腎呈塊狀，位于體腔背壁，是魚類成體階段執(zhí)行排泄機(jī)能的器官[11]。T-SOD是一類廣泛存在于魚體內(nèi)的金屬酶，具有催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧的能力。超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)正常代謝的產(chǎn)物， 但自由基的積累將使細(xì)胞膜的脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用而引起膜裂變， 導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞死亡[12]。 SOD是生物體內(nèi)一種重要的而且也是最佳的自由基清除劑[13]。本研究中，不同濃度的BPS急性暴露后金鯽魚中腎中T-SOD活性顯著降低，中腎器官抗氧化應(yīng)激能力減弱。

過氧化氫酶（CAT）是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。本研究中，不同濃度的BPS急性暴露后金鯽魚中腎中CAT活性顯著降低。影響其抗氧化防御系統(tǒng)。

丙二醛（MDA）是衡量氧化脅迫程度的常用指標(biāo)之一，能反映生物膜脂過氧化的程度。生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛在體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷[14]。本研究中，不同濃度的BPS急性暴露后金鯽魚中腎中MDA含量顯著升高。任文娟[15]報(bào)導(dǎo)，BPS對紅鯉魚巨噬細(xì)胞的短期暴露對巨噬細(xì)胞胞內(nèi)丙二醛含量產(chǎn)生了影響。丙二醛含量在1 000 μg/L濃度BPS暴露下出現(xiàn)了顯著性誘導(dǎo)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過研究金鯽魚中腎中的總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力及丙二醛的含量隨BPS急性暴露處理的變化，來探討B(tài)PS對金鯽魚中腎抗氧化指標(biāo)的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)金鯽魚受到BPS為期15 d的急性暴露后，隨著BPS濃度的升高，金鯽魚中腎中總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活力逐漸減少，但丙二醛的含量卻有著明顯的增加，表明BPS急性暴露使機(jī)體清除氧自由基能力減弱，機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊程度增強(qiáng)。所以在漁業(yè)生產(chǎn)中，我們應(yīng)盡量減少使用含有BPS的物品，從而減輕雙酚類物質(zhì)向水體富集程度，保證水產(chǎn)品健康生產(chǎn)。

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