摘要：為探究在病原刺激情況下克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的轉(zhuǎn)錄組信息，采用PacBio平臺(tái)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT），對(duì)使用弧菌刺激下的克氏原螯蝦的血淋巴、肝胰腺、鰓、腸、淋巴器官和肌肉的混合組織樣進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得克氏原螯蝦的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本文庫(kù)。首先，使用TRIzol法提取總RNA合成雙鏈cDNA用于SMRTbell建庫(kù)和測(cè)序，利用SMRT分析套件進(jìn)行插入片段識(shí)別，Reads分類、聚類和校正，利用BUSCO單拷貝同源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行組裝的完整性評(píng)價(jià)，通過使用CD-HIT軟件，將序列進(jìn)行去冗余分析，最后利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)NR、NT、SwissProt、KOG、GO、Pfam及KEGG對(duì)克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組得到改良后一致序列149 213個(gè)，序列平均長(zhǎng)度為2 213 bp。BUSCO單拷貝同源數(shù)據(jù)庫(kù)完整性評(píng)價(jià)，約有95.8%完整基因元件，說明大多數(shù)保守基因組裝較完整，組裝結(jié)果較可靠。在NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋得到110 181條序列，分別比對(duì)到1 373個(gè)物種，其中與美洲海螯蝦（Homarus americanus）基因相似的序列最多，為48 433 條。與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，統(tǒng)計(jì)注釋到結(jié)合和催化活性功能最多，分別為14 327和13 344個(gè)。KOG功能注釋分為25個(gè)功能組分，其中，一般功能預(yù)測(cè)最多，為20 269個(gè)。KEGG注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的代謝通路注釋的基因數(shù)最多，為12 277個(gè)。本研究過程中組裝并獲得完整良好的序列，與功能數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得出序列的功能特性，可為探究克氏原螯蝦的功能基因、免疫響應(yīng)和相關(guān)代謝通路等提供可靠的基因組資源。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；轉(zhuǎn)錄組；三代測(cè)序；功能注釋

中圖分類號(hào)：S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）12-0187-08

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）別稱淡水小龍蝦，屬于甲殼綱、十足目、螯蝦科水生動(dòng)物［1］?？耸显r是一種富含人體所必需的多種礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸的低脂肪、高蛋白的優(yōu)質(zhì)淡水蝦［2-3］。隨著克氏原螯蝦的人工養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，其病害問題日益增多。因此，通過探究病原菌侵入克氏原螯蝦先天免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制，可為防治病原侵害提供科學(xué)依據(jù)。

目前，以illumina平臺(tái)等二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行序列功能研究的仍占據(jù)大多數(shù)，其測(cè)序結(jié)果比真核生物RNA長(zhǎng)度要短得多［4］。隨著轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)資源的不斷開發(fā)，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)不僅為功能基因注釋提供一種更為全面的方法，同時(shí)，注釋結(jié)果也更加準(zhǔn)確［5］。以PacBio為代表的第三代測(cè)序技術(shù)具有較高的讀長(zhǎng)性，能很好地解決二代測(cè)序中存在的讀長(zhǎng)度不足而造成的不完全拼接問題［6-8］。

目前，有關(guān)無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫分子機(jī)制研究的理論支持主要通過二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，其測(cè)序方式揭示無(wú)脊椎動(dòng)物的相關(guān)免疫功能基因非常有限。因此，利用三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)行基因組學(xué)分析，為進(jìn)一步探究克氏原螯蝦先天免疫分子機(jī)制提供更多的理論基礎(chǔ)。采用三代測(cè)序技術(shù)的PacBio平臺(tái)對(duì)克氏原螯蝦全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過生物信息學(xué)手段，進(jìn)行序列拼接、分類、功能注釋和代謝途徑分析，獲得豐富的功能序列信息，為后續(xù)研究克氏原螯蝦系列功能基因及深入探究基因組學(xué)等提供理論支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

克氏原螯蝦（15～20 g/尾），購(gòu)買自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市友誼瑞福海鮮市場(chǎng)，預(yù)養(yǎng)1周后進(jìn)行哈維氏弧菌免疫刺激，每尾蝦注射量為100 μL，細(xì)菌濃度為 2×107 CFU/mL，利用無(wú)菌注射器從蝦腹部第2～3體節(jié)肌肉處進(jìn)行緩慢注射。24 h后，隨機(jī)挑選活力較強(qiáng)的克氏原螯蝦3～6尾進(jìn)行解剖取樣，分別取血淋巴、肝胰腺、鰓、腸組織、淋巴器官和肌肉組織適量進(jìn)行充分混合，之后混合樣品放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取

取低溫凍存的無(wú)菌條件下采集的哈維氏弧菌免疫刺激的克氏原螯蝦的血淋巴、肝胰腺、鰓、腸組織、淋巴器官和肌肉組織的混合組織樣品，使用TRIzol法提取總RNA。為保證RNA質(zhì)量，提取完成后利用NANO Drop 2000儀測(cè)量RNA濃度。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

先混合組織樣品的總RNA，再用UMI base PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA，通過PCR擴(kuò)增合成第二條鏈cDNA。雙鏈DNA在二次PCR擴(kuò)增后，要進(jìn)行連接SMRT啞鈴型接頭形式的全長(zhǎng)cDNA的末端修復(fù)，用于SMRT bell建庫(kù)和測(cè)序［9］。后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組序列測(cè)定工作由北京華大基因科技有限公司完成。

1.4 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列分析

測(cè)序獲得的原始下機(jī)數(shù)據(jù)，利用SMRT分析套件進(jìn)行插入片段識(shí)別［Reads of insert（ROI）］，Reads分類（Classify），Reads聚類和校正（Cluster、Quvier），最終得到高質(zhì)量的全長(zhǎng)一致性序列（circular consensus sequence，CCS）。通過對(duì)全長(zhǎng)序列的聚類，得到了聚類一致性序列，并對(duì)其進(jìn)行改良，從而得到較高質(zhì)量的一致性序列，供以后進(jìn)一步深入研究。

1.5 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列功能注釋及結(jié)構(gòu)分析

通過使用CD-HIT軟件，將改良后的一致序列進(jìn)行去冗余分析，并將其與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過對(duì)其序列的相似性分析，最終確定了最相似性的蛋白質(zhì)。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)NR、NT、SwissProt、KOG、GO、Pfam及KEGG對(duì)克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。

1.6 數(shù)據(jù)獲取

本研究報(bào)告的數(shù)據(jù)保存在中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所中國(guó)國(guó)家生物信息中心（CNCB），網(wǎng)址為：https：//www.cncb.ac.cn/，項(xiàng)目編號(hào)：PRJCA017033。在CNCB數(shù)據(jù)庫(kù)OMIX資源庫(kù)中，網(wǎng)址為：https：//ngdc.cncb.ac.cn/omix，編號(hào)：OMIX004094-07。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝分析結(jié)果

2.1.1 測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)組裝

由圖1可知，通過PacBio測(cè)序平臺(tái)對(duì)克氏原螯蝦血淋巴、肝胰腺、鰓、腸、淋巴器官和肌肉組織混合樣進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)處理后共獲得39 945 085個(gè)子序列，為 73.25 GB，平均子序列長(zhǎng)度為1 833.71 bp，N50為 1 977 bp。利用ZMW孔中的子序列得到CCS聚類之后的序列數(shù)為887 123個(gè)，平均序列長(zhǎng)度為 2 011 bp。將CCS拆分成2個(gè)部分，依據(jù)其是否含有完整的5′端primer、poly（A）尾巴、3′端primer，分別為全長(zhǎng)非嵌合序列（full-length non- chimeric read，F(xiàn)LNC）、非全長(zhǎng)序列（non-full-lenth）。ROI處理后最終僅有FLNC進(jìn)入后續(xù)分析。全長(zhǎng)非嵌合序列有885 164個(gè)，序列的平均長(zhǎng)度為1 974 bp。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組得到改良后一致序列149 213個(gè)，序列平均長(zhǎng)度為2 213 bp。

2.1.2 BUSCO組裝評(píng)價(jià)結(jié)果

利用BUSCO單拷貝同源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將其與保守基因進(jìn)行對(duì)比，可以了解其組裝的完整性［10］。一般來說，如果藍(lán)色部分complete的比例gt;70%，則認(rèn)為組裝效果較好。由圖2可知，約有95.8%的完整基因元件，說明大多數(shù)保守基因組裝得比較完整，組裝結(jié)果的也比較可靠。S值表示檢測(cè)到的完整單拷貝同源基因，約占91.42%，M值表示被過濾掉的序列，僅為3.96%，說明誤裝的比例非常低，本次的組裝非常完整。

2.2 Unigene功能注釋

2.2.1 注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

去冗余完畢后，由表1可知，對(duì)去冗余得到的Isoform進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、NT、GO、KOG、Pfam、KEGG和SwissProt）注釋。

由圖3可知，在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，將轉(zhuǎn)錄組獲得的單基因簇序列進(jìn)行比對(duì)，共獲得注釋Unigenes 110 181 個(gè)，比對(duì)到1 373個(gè)物種，其中，美洲螯龍蝦（Homarus americanus）的同源序列最多，為48 433個(gè)，占注釋序列總數(shù)約43.96%，推測(cè)克氏原螯蝦與美洲螯龍蝦同源性較高；其次比對(duì)較多的前幾個(gè)物種包括日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）4 413個(gè)，占總數(shù)4%、南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）3 551個(gè)，占總數(shù)3%、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）2 739個(gè)，占總數(shù)3%、嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）2 676個(gè)，占總數(shù)2%、灰眼雪蟹（Chionoecetes opilio）2 483個(gè)，占總數(shù)的2%。

2.2.2 GO功能注釋結(jié)果

GO是用來描述基因在分子、細(xì)胞和組織水平的功能體現(xiàn)，分為基因的生物過程（biological process，BP）和參與的生物過程、基因所在位置的的細(xì)胞組成（cellular component，CC）、基因進(jìn)行表達(dá)的分子功能（molecular function，MF）三大類。對(duì)獲得的序列進(jìn)行GO注釋，結(jié)果顯示，有25 272條unigenes獲得GO注釋，占總數(shù)的16.95%，注釋到生物過程（BP）有32 453個(gè)、細(xì)胞組分（CC）有49 922個(gè)、分子功能（MF）有33 192個(gè)，分別注釋了26、19、14個(gè)亞類。

由圖4可知，在生物過程中，有9 693個(gè)序列片段參與細(xì)胞過程（cellular process），占生物過程的29.87%、新陳代謝過程（metabolic process）有7 356個(gè)，占22.67%、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）有 2 988 個(gè)，占9.21%。在細(xì)胞組分中，主要跟膜結(jié)構(gòu)（membrane）有8 933個(gè)、膜部分（membrane part）有8 272個(gè)和細(xì)胞（cell）有8 249個(gè)有關(guān)，分別占總unigenes的17.89%、16.57%和16.52%。在分子功能中，主要跟結(jié)合（binding）、催化活性（catalytic activity）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）有關(guān)，分別有14 327、13 344、2 215個(gè)，占總數(shù)的43.16%、40.2%和6.67%。

2.2.3 KOG 分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由圖5可知，將克氏原螯蝦單基因簇利用KOG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，共得到 136 690 個(gè)注釋信息，可分成四大類，分別是細(xì)胞過程和信號(hào)、信息存儲(chǔ)和處理、代謝及特征不佳。四大類包含25個(gè)功能組分，一般功能預(yù)測(cè)是25個(gè)功能組分中獲得注釋較多的功能組分，有20 269個(gè)，占總數(shù)的14.83%，其次是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，有18 195個(gè)，占總數(shù)的13.31%，注釋信息中還包括翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白，共有11 035個(gè)，占總數(shù)的8.07%。

2.2.4 KEGG功能注釋結(jié)果

由圖6可知，通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)克氏原螯蝦單基因簇對(duì)比，注釋到六大類45小類，六大類包括：細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝和有機(jī)體系統(tǒng)。其中，細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理中的基因數(shù)量分別有21 121、16 167、14 823個(gè)，人類疾病中的基因數(shù)量有48 669個(gè)，代謝中的基因數(shù)量有29 262個(gè)，有機(jī)體系統(tǒng)中的基因數(shù)量有36 990個(gè)。最終發(fā)現(xiàn)，在人類疾病中的基因數(shù)被注釋最多。其中，基因數(shù)量較多的代謝通路有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 12 277 個(gè)，全局和概覽圖有11 231個(gè)，耐藥性抗腫瘤藥最少，僅有1個(gè)。

2.3 CDS預(yù)測(cè)結(jié)果

采用TransDecoder軟件，對(duì)Isoform中的候選編碼區(qū)進(jìn)行識(shí)別，首先提取最長(zhǎng)的開放閱讀框，再使用Blast比對(duì)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)和Hmmscan進(jìn)行Pfam蛋白同源序列的檢索，并對(duì)其進(jìn)行編碼預(yù)測(cè)。

由圖7可知，被認(rèn)為是蛋白編碼區(qū)的基因片段一共有91 080個(gè)，這些片段的大小主要在300～3 000 bp。

2.4 SSR檢測(cè)結(jié)果

使用MISA對(duì)Isoform進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在 75 892 個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在46 092個(gè)Unigene中。由圖8可知，從單核苷酸到三核苷酸重復(fù)數(shù)最多，是總SSR位點(diǎn)數(shù)量的96.42%。其中，以AC/GT堿基數(shù)最多，為18 322個(gè)；AG/CT和AT/AT次之，分別為 6 130 和4 899個(gè)；CG/CG堿基數(shù)最少，為78個(gè)。

2.5 lncRNA分析結(jié)果

使用3款預(yù)測(cè)軟件及1個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)轉(zhuǎn)錄本的編碼能力進(jìn)行預(yù)測(cè)，區(qū)分mRNA和lncRNA。3個(gè)軟件分別為CPC、txCdsPredict及CNCI；數(shù)據(jù)庫(kù)為pfam。利用CD-HIT軟件去冗余得到的基因進(jìn)行編碼能力預(yù)測(cè)。由圖9可知，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后預(yù)測(cè)其編碼能力，綜合不同算法最終共預(yù)測(cè)獲得61 417條lncRNA。

2.6 轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果

通過使用動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)animal TFDB 2.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行鑒定， 由圖10可知， 得到的轉(zhuǎn)錄因子有19 115個(gè)， 從屬于66個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中。 其中，zf-C2H2家族、bHLH家族、Homeobox家族、HMG家族分別有6 055、2 555、1 524、923個(gè)，是存在比較多的轉(zhuǎn)錄因子家族。而Family家族、NCU-G1家族、PAX家族最少，均僅有1個(gè)。

3 討論

克氏原螯蝦是一種重要的甲殼動(dòng)物，其轉(zhuǎn)錄組特征和基因組信息研究還不夠深入。第三代高通量序列采用PacBio平臺(tái)，具有顯著的讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［8］。李喜蓮等以紅螯螯蝦為研究對(duì)象，進(jìn)行Illumina Hi Seq測(cè)序，所有reads組裝后獲得了67 369個(gè)Unigene［11］。周錢森等以錦繡龍蝦為研究對(duì)象，進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了13 297條序列［12］。趙剛等以巖原鯉為研究對(duì)象，進(jìn)行全組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了83 252條序列［13］。Zhang等以肝胰腺、心胃、心臟、肌肉和幽門胃為材料，通過PacBio亞型測(cè)序（Iso-Seq）和Illumina配對(duì)末端短讀測(cè)序方法對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得72 648條高質(zhì)量序列，平均長(zhǎng)度為2 545 bp［14］。Wang等通過對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦雌雄性的肌肉和性腺進(jìn)行基于Illumina平臺(tái)的測(cè)序分析，獲得10 795條序列［15］。本研究中通過PacBio平臺(tái)的SMRT測(cè)序技術(shù)對(duì)克氏原螯蝦全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，最終獲得了149 079條高質(zhì)量序列，相較于上述結(jié)果中的紅螯螯蝦、錦繡龍蝦、巖原鯉、凡納濱對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦而言，獲得的序列數(shù)更多。

梁妃爽等利用第三代測(cè)序技術(shù)對(duì)波紋龍蝦進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，為進(jìn)一步研究波紋龍蝦的基因功能和相關(guān)代謝途徑、信號(hào)通路等提供了數(shù)據(jù)支撐［16］。Zhang等利用二代與三代相結(jié)合的測(cè)序技術(shù)，篩選出施氏鱘性腺中早期配子發(fā)生的相關(guān)基因，為研究施氏鱘生殖調(diào)控的機(jī)制提供了理論依據(jù)［17］。Li等通過三代測(cè)序技術(shù)對(duì)中華絨螯蟹篩選可能參與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的候選基因［18］。Shi等通過研究中國(guó)對(duì)蝦被WSSV感染后的測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)吞噬體、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、抗原處理和遞呈途徑等與免疫應(yīng)答有關(guān)的通路以及免疫基因被激活［19］。由于無(wú)脊椎動(dòng)物沒有像脊椎動(dòng)物一樣的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，因此它們不具有高度專一的適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)［20］。然而，當(dāng)遇到病原微生物感染時(shí)，無(wú)脊椎動(dòng)物機(jī)體卻能準(zhǔn)確迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這一過程中先天性免疫便起到了重要的作用。本研究通過對(duì)克氏原螯蝦在哈維氏弧菌免疫刺激下進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與生長(zhǎng)發(fā)育、免疫相關(guān)的多種代謝通路和信號(hào)途徑，包括了糖酵解、TCA循環(huán)、戊糖磷酸途徑、JAK-STAT信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等。

4 結(jié)論

本研究通過SMRT技術(shù)對(duì)克氏原螯蝦的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，去冗余后，共產(chǎn)生149 079條高質(zhì)量序列。將對(duì)去冗余得到的Isoform進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本，快速篩選出多個(gè)候選基因的全長(zhǎng)序列，為基因功能研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，通過序列組裝、功能注釋和代謝通路的分析，可以為以后的基因組序列提供依據(jù)，為今后的基因組研究奠定基礎(chǔ)。通過對(duì)克氏原螯蝦全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的分析，極大地豐富了克氏原螯蝦的基因數(shù)據(jù)庫(kù)資源，為進(jìn)一步研究克氏原螯蝦的功能基因和免疫應(yīng)答機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-06-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32060834）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金-杰出青年培育基金（編號(hào)：2020JQ03）。

作者簡(jiǎn)介：張明達(dá)（1999—），男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要研究方向無(wú)脊椎動(dòng)物的先天免疫。E-mail：1501643202@qq.com。

通信作者：杜志強(qiáng)，博士研究生，教授，主要研究方向無(wú)脊椎動(dòng)物的先天免疫。E-mail：nmdzq1981@163.com。[HJ]