摘要：氨基酸脫羧酶（AAD）是生物胺合成的關(guān)鍵酶。微生物AAD一般為胞內(nèi)酶，但性質(zhì)穩(wěn)定，在脫離細(xì)胞體系中仍可保持催化活性。文章以具有產(chǎn)生物胺能力的3種微生物細(xì)胞超聲破碎后的粗酶液為對(duì)象，探究了前體氨基酸濃度、pH和鹽濃度對(duì)離體AAD催化活性的影響。結(jié)果顯示，多數(shù)情況下前體氨基酸未充分轉(zhuǎn)化為生物胺，但低濃度前體氨基酸顯著降低了離體AAD的催化活性；Lactobacillus plantarum 1-8和Escherichia coli BA-1的AAD在pH為6時(shí)催化活性最強(qiáng)，Debaryomyces hansenii MB-1Y的AAD在pH為5時(shí)催化活性最強(qiáng)；鹽濃度提升導(dǎo)致AAD的催化活性降低。該研究可為探討食品發(fā)酵中AAD的催化特性及其控制提供參考。

關(guān)鍵詞：生物胺；氨基酸脫羧酶；離體酶；催化活性；環(huán)境因素

中圖分類號(hào)：TS201.2""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）10-0065-05

Study on Catalytic Activity of in Vitro Amino Acid Decarboxylase

from Three Microorganisms

LI Shu-ting1，2， LIN Ze2， YIN Li-guo1， ZHANG Wen-xue2， WU Zheng-yun2*

（1.Key Laboratory of Solid-state Fermentation Resource Utilization in Sichuan Province， Yibin

University， Yibin 644005， China; 2.College of Biomass Science and Engineering，

Sichuan University， Chengdu 610065， China）

Abstract： Amino acid decarboxylase （AAD） is a key enzyme in biogenic amine synthesis. Microbial AAD is generally an intracellular enzyme， but its properties are stable and it can still maintain catalytic activity in extracellular systems. In this paper， with crude enzyme solution obtained from three microbial cells with the ability to produce biogenic amines after ultrasonic disruption as the object， the effects of precursor amino acid concentration， pH and salt concentration on the catalytic activity of in vitro AAD are investigated. The results show that in most cases， the precursor amino acids are not fully converted into biogenic amines， but low concentrations of precursor amino acids significantly reduce the catalytic activity of in vitro AAD. The catalytic activity of AAD of Lactobacillus plantarum 1-8 and Escherichia coli BA-1 is the strongest when pH is 6， while the catalytic activity of AAD of Debaryomyces hansenii MB-1Y is the strongest when pH is 5. The increase of salt concentration leads to the decrease of the catalytic activity of AAD. This study can provide references for exploring the catalytic characteristics and controlling of AAD in food fermentation.

Key words： biogenic amine; amino acid decarboxylase; in vitro enzyme; catalytic activity; environmental factors

生物胺是發(fā)酵食品中普遍存在的健康風(fēng)險(xiǎn)因子之一[1]。發(fā)酵食品中的生物胺主要由具有產(chǎn)生物胺能力的微生物生成[2]。食品發(fā)酵中具有產(chǎn)生物胺能力的微生物種類很多，包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）等[3-5]。氨基酸脫羧酶（amino acid decarboxylase，AAD）是轉(zhuǎn)化前體氨基酸生成生物胺的關(guān)鍵酶，微生物AAD一般為胞內(nèi)酶，但具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在脫離細(xì)胞體系后仍可保持其催化活性[6]，這意味著發(fā)酵食品生產(chǎn)中微生物細(xì)胞因衰亡或非熱殺菌等原因裂解后，AAD仍可在一定程度上將前體氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺。

目前關(guān)于發(fā)酵食品中生物胺控制的研究多集中在具有產(chǎn)生物胺能力的微生物上，對(duì)AAD本身以及脫離細(xì)胞體系的AAD的催化特性及其影響因素的研究相對(duì)較少。研究顯示，不同微生物來(lái)源的AAD在氨基酸序列、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和理化特性上有一定的差異[7]。乳酸菌和酵母菌是常用的發(fā)酵微生物，此外，食品發(fā)酵中也可能存在一些雜菌（如大腸菌群）。本文以本實(shí)驗(yàn)室前期從泡菜等發(fā)酵食品中分離的三類產(chǎn)生物胺菌株為基礎(chǔ)，探討了來(lái)自不同微生物的離體AAD的催化特性，為發(fā)酵食品中生物胺的控制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

腐胺、尸胺、組胺、酪胺、色胺、精胺、亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；色氨酸、酪氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽、賴氨酸、組氨酸、脯氨酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司；5′-磷酸吡哆醛：上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)Sigma公司；PBS緩沖液：安徽白鯊生物科技有限公司。

1.1.2 菌種

L.plantarum 1-8、E.coli BA-1、D.hansenii MB-1Y，其中，L.plantarum 1-8具有酪氨酸脫羧酶活性，E.coli BA-1具有鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性和賴氨酸脫羧酶活性，D.hansenii MB-1Y具有鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS-AAD培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉5.0 g/L，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，硫酸錳0.05 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，酪氨酸 2.0 g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05 g/L，于115 ℃滅菌30 min。

LB-AAD培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽2.0 g/L，精氨酸2.0 g/L，賴氨酸2.0 g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05 g/L，于115 ℃滅菌30 min。

YPD-AAD培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽2.0 g/L，精氨酸2.0 g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05 g/L，于115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-1650臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；JY96-ⅡN超聲波細(xì)胞破碎儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；SCI-VS渦旋振動(dòng)器 美國(guó)賽洛捷克公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HWS-26恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004電子天平 上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將L.plantarum 1-8、E.coli BA-1和D.hansenii MB-1Y分別以1%接種于MRS、LB、YPD液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h。將1 mL（約107 CFU/mL）L.plantarum 1-8、E.coli BA-1和D. hansenii MB-1Y的活化菌液分別接入100 mL MRS-AAD培養(yǎng)基、LB-AAD培養(yǎng)基和YPD-AAD培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 AAD粗酶液的制備

參照文獻(xiàn)[8]的方法制備AAD粗酶液。將前述培養(yǎng)所得菌液在4 ℃下以8 000 r/min離心10 min，收集菌體，菌體沉淀使用生理鹽水重復(fù)洗滌3次，去除上清液。向收集到的菌體沉淀中加入100 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液渦旋使菌體重懸于緩沖液中，使用超聲波細(xì)胞破碎儀在低溫條件下冰浴破碎菌體細(xì)胞。超聲波細(xì)胞破碎儀工作條件為工作時(shí)間3 s，間隔時(shí)間3 s，功率200 W，工作15 min。將超聲后的菌液在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液，并用孔徑為0.22 μm的水系濾膜過(guò)濾，獲得AAD粗酶液。

1.3.3 環(huán)境因素對(duì)AAD催化活性的影響

前體氨基酸濃度對(duì)AAD催化活性的影響：在L.plantarum 1-8的AAD粗酶液中分別加入0.1，0.5，1.0，2.0 g/L酪氨酸、0.05 g/L 5′-磷酸吡多醛；在E.coli BA-1的AAD粗酶液中分別加入 0.1，0.5，1.0，2.0 g/L 4個(gè)濃度梯度的鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽、精氨酸、賴氨酸以及0.05 g/L的5′-磷酸吡哆醛，在D.hansenii MB-1Y的AAD粗酶液中分別加入 0.1，0.5，1.0，2.0 g/L 4個(gè)濃度梯度的鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽、精氨酸以及0.05 g/L的5′-磷酸吡哆醛。在37 ℃下培養(yǎng)48 h，過(guò)程中取樣測(cè)定其生物胺含量。

pH對(duì)AAD催化活性的影響：各前體氨基酸濃度為2.0 g/L，通過(guò)加鹽酸分別調(diào)整pH至4.0，5.0，6.0，7.0；其他條件同上。

鹽濃度對(duì)AAD催化活性的影響：各前體氨基酸濃度為2.0 g/L，添加NaCl進(jìn)行調(diào)整使其鹽濃度分別為2%、4%、6%；其他條件同上。

1.3.4 生物胺的測(cè)定

生物胺的測(cè)定參照唐小曼等[9]的方法，取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL離心管中，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL飽和NaHCO3溶液緩沖，再加入2.0 mL 10 g/L丹酰氯衍生劑（溶劑為丙酮），振蕩混勻后于40 ℃避光水浴60 min，每15 min 振蕩一次。加入 200 μL 100 g/L脯氨酸溶液，渦旋1 min后于室溫下避光放置15 min終止衍生反應(yīng)，再加入0.4 g NaCl渦旋振蕩1 min 后加入1 mL乙醚，渦旋振蕩30 s，靜置分層后，吸出上層有機(jī)相，再次萃取，合并有機(jī)相，45 ℃水浴揮干。用1.0 mL乙腈溶解殘留物，用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾，于4 ℃避光保存，用于高效液相色譜測(cè)定。樣品溶液衍生的條件及方法與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同。

色譜柱為 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量 20 μL，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，流動(dòng)相 A 為乙腈，流動(dòng)相 B 為去離子水，梯度洗脫條件參考GB 5009.208—2016，洗脫程序共37 min，設(shè)置0 min時(shí)乙腈體積分?jǐn)?shù)為60%，去離子水體積分?jǐn)?shù)為40%；22 min時(shí)乙腈體積分?jǐn)?shù)為85%，去離子水體積分?jǐn)?shù)為15%；25 min時(shí)乙腈體積分?jǐn)?shù)為100%，去離子水體積分?jǐn)?shù)為0%；32.01 min時(shí)乙腈體積分?jǐn)?shù)為60%，去離子水體積分?jǐn)?shù)為40%。

2 結(jié)果與討論

2.1 前體氨基酸濃度對(duì)離體AAD催化活性的影響

不同濃度前體氨基酸下AAD催化形成生物胺的動(dòng)態(tài)過(guò)程見(jiàn)圖1。

隨著前體氨基酸濃度的升高，生物胺的生成速率和總量均呈上升趨勢(shì)，與王鵬[10]研究精氨酸脫羧酶催化反應(yīng)與底物濃度關(guān)系的結(jié)果相近。前體氨基酸添加量為1.0 g /L和2.0 g/L時(shí)，生物胺合成最終量較接近。相對(duì)而言，來(lái)自L.plantarum 1-8和E.coli BA-1的離體AAD的催化反應(yīng)進(jìn)程快于來(lái)自D.hansenii MB-1Y的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶；來(lái)自E.coli BA-1的賴氨酸脫羧酶的催化反應(yīng)速率受前體氨基酸濃度的影響更大。在前體氨基酸濃度為0.1，0.5，1.0，2.0 g/L時(shí)，L.plantarum 1-8酪氨酸脫羧酶催化前體氨基酸的轉(zhuǎn)化率分別約為18%、9%、5.7%、3.1%，D.hansenii MB-1Y鳥(niǎo)氨酸脫羧酶催化前體氨基酸的轉(zhuǎn)化率分別約為55%、15%、10.5%、6.5%，表明大部分前體氨基酸并未轉(zhuǎn)化為生物胺。總體上看，E.coli BA-1鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶的酶活性較高，在前體氨基酸濃度為0.1 g/L時(shí)，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化率分別約為150%和130%（轉(zhuǎn)化率大于100%的原因是來(lái)自LB培養(yǎng)基的胰蛋白胨和酵母浸粉中的部分氨基酸也被轉(zhuǎn)化）。由以上結(jié)果可知，一方面，多數(shù)情況下前體氨基酸并未充分轉(zhuǎn)化為生物胺（甚至只有一小部分被轉(zhuǎn)化），但前體氨基酸的濃度（尤其是低濃度）對(duì)于AAD酶催化活性的影響顯然存在。 另一方面，在本研究中還觀察到當(dāng)前體氨基酸濃度達(dá)到某一特定閾值后，進(jìn)一步提高其濃度并未顯著促進(jìn)其對(duì)應(yīng)生物胺的合成，由此推測(cè)生物胺濃度可能對(duì)AAD存在反饋抑制作用。韓忠安[11]研究顯示添加0.1～0.5 mmol/L（0.018～0.091 g/L）的酪氨酸使Bacillus subtilis BJ3-2酪氨酸脫羧酶活性呈上升趨勢(shì)，但添加量超過(guò)0.5 mmol/L后，相對(duì)酶活（將測(cè)定的最高酶活設(shè)為100，得到不同濃度酪氨酸下的相對(duì)酶活）出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相近。

泡菜發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的總濃度一般呈上升趨勢(shì)，范圍大致為0.4～2.0 g/L，其中，酪氨酸、精氨酸、賴氨酸的濃度隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增多，濃度范圍分別為0.01～0.05 g/L、0.02～0.05 g/L和0.02～0.15 g/L[12-13]；酒發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的總濃度一般也呈上升趨勢(shì)，范圍大致為1.0～3.5 g/L，其中，酪氨酸、精氨酸、賴氨酸的濃度隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增多，大致濃度范圍分別為0.04～0.20 g/L、0.04～0.40 g/L和0.05～0.15 g/L[14-15]，這與本研究中0.1 g/L的前體氨基酸濃度水平接近，在此條件下前體氨基酸對(duì)離體AAD活性存在一定的限制作用。

2.2 pH對(duì)離體AAD催化活性的影響

由圖2可知，除來(lái)自D.hansenii MB-1Y的AAD在pH為7時(shí)的催化活性較低外，在pH為5～7之間3株微生物的離體AAD均可催化形成生物胺且催化活性相近；pH為4時(shí)僅來(lái)自L.plantarum 1-8的離體AAD顯示催化活性，表明其有更強(qiáng)的耐酸特性。Zou等[16]研究表明Enterobacter aerogenes DL-1的組氨酸脫羧酶能夠在pH為4～8之間保持穩(wěn)定，在pH為4時(shí)放置5 d仍能保持約70%的相對(duì)酶活，與本文結(jié)果略有差別，可能與AAD的種類不同有關(guān)。本文中3株微生物離體AAD催化反應(yīng)的最適pH也有所不同，來(lái)自L.plantarum 1-8和E.coli BA-1的AAD在pH為6時(shí)活性最高；來(lái)自D.hansenii MB-1Y的AAD在pH為5時(shí)生物胺合成量最高。 Furutani等[17]報(bào)道的Staphylococcus epidermidis中組氨酸脫羧酶的最適pH為5.0；Arribas等[18]對(duì)Lactobacillus brevis中酪氨酸脫羧酶的研究顯示其在pH為5時(shí)活性最高，與本研究結(jié)果接近。AAD在不同pH下的構(gòu)象可能發(fā)生變化。Jessop等[19]研究表明E.coli中的賴氨酸脫羧酶在pH＜5時(shí)多為寡聚體，在pH＞6.5時(shí)二聚體比例大幅提高，且賴氨酸脫羧酶二聚體活性相對(duì)較低；寇鳳雨[20]的研究顯示賴氨酸脫羧酶在最適pH下十聚體比例最大，推測(cè)十聚體形式可能是賴氨酸脫羧酶活性最高的聚合形式。由此可見(jiàn)，pH可能通過(guò)調(diào)節(jié)AAD的多聚體狀態(tài)，進(jìn)而影響AAD的活性。

泡菜發(fā)酵過(guò)程的pH值通常從6.5逐漸下降至3.5左右[12，18]，酒類發(fā)酵過(guò)程中的pH值通常從4.5逐漸下降至3.5左右[21-22]，而生物胺總量呈增加趨勢(shì)，大部分生物胺在發(fā)酵前期和中期形成[23-24]。結(jié)合本研究結(jié)果來(lái)看，在發(fā)酵后期較低的pH值下，除乳酸菌外，其他微生物的離體AAD活性較微弱。

2.3 鹽濃度對(duì)離體AAD催化活性的影響

氯化鈉的存在會(huì)影響酶所在的環(huán)境及其基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)各部分間的排斥力增加，無(wú)規(guī)則卷曲比例升高，蛋白質(zhì)變性程度增強(qiáng)[25]。由圖3可知，隨著鹽濃度的升高，3種微生物離體AAD催化形成的生物胺總量均明顯降低。與2%鹽濃度相比，6%鹽濃度下各離體AAD生物胺合成量分別下降了51.19%（L.plantarum 1-8-酪胺）、39.92%（E.coli BA-1-腐胺）、6.02%（E.coli BA-1-尸胺）。D.hansenii 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶在6%鹽濃度下不能合成生物胺。鹽濃度對(duì)L.plantarum 1-8中酪氨酸脫羧酶催化速率的影響相對(duì)較小；而E.coli BA-1的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶的催化速率隨著鹽濃度的升高而大幅降低。韓忠安[11]在對(duì)豆豉中細(xì)菌酪氨酸脫羧酶活性的研究中也觀察到，鹽濃度從5%升高到6%時(shí)酪氨酸脫羧酶活性下降了48.16%。徐文娟[26]的研究顯示，當(dāng)氯化鈉濃度從0%升高至4.5%時(shí)，Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium中酪氨酸脫羧酶體外生物胺合成量分別從179，469 mg/L下降至39，46 mg/L。而Tabanelli等[6]的研究卻發(fā)現(xiàn)氯化鈉添加量在0%～5%之間對(duì)Streptococcus thermophilus的組氨酸脫羧酶活性并沒(méi)有顯著影響，當(dāng)氯化鈉濃度升高至10%以上時(shí)才出現(xiàn)明顯的抑制作用。出現(xiàn)這些情況的原因主要是生物胺的合成高度依賴于菌株而不是種屬，不同實(shí)驗(yàn)菌種的AAD可能存在一定的差異。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)際泡菜的鹽濃度范圍在2%～8%[27-29]。陳露等[23]在實(shí)際泡菜發(fā)酵體系中探究了鹽濃度對(duì)生物胺含量的影響，結(jié)果顯示，2%、4%、6%、8%鹽濃度的產(chǎn)生物胺水平分別為181.13，118.24，18.17，0 mg/kg，與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

本文探究了3種不同微生物的離體ADD催化活性及其影響因素。結(jié)果表明，多數(shù)情況下前體氨基酸并未充分轉(zhuǎn)化為生物胺，但低濃度前體氨基酸顯著降低了離體AAD酶的催化活性；偏酸性環(huán)境促進(jìn)氨基酸脫羧酶合成生物胺，L.plantarum 1-8和E.coli BA-1的離體ADD在pH為6時(shí)活性最高；D.hansenii MB-1Y的離體ADD在pH為5時(shí)活性最高；在pH為4時(shí)，E.coli BA-1和D.hansenii MB-1Y的離體ADD失活；高鹽濃度抑制了ADD活性。本研究可為食品發(fā)酵中氨基酸脫羧酶的催化特性及其控制的探討提供參考。

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收稿日期：2024-04-02

基金項(xiàng)目：固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（2022GTYY09）

作者簡(jiǎn)介：李書(shū)婷（1999—），女，碩士，研究方向：發(fā)酵工程。

*通信作者：吳正云（1970—），男，副教授，博士，研究方向：食品工程。