【摘 要】目的：探討趨化素因子超家族6（CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing 6，CMTM6）靶向人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響及作用機(jī)制。方法：采用RT-qPCR和Western blot檢測CMTM6在胃癌組織、癌旁正常組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平；在AGS和BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-NC和sh-CMTM6后，分別采用CCK8、Transwell和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，以及凋亡情況。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）檢測CMTM6和HER2結(jié)合情況，放線菌酮（cycloheximide，CHX）檢測低表達(dá)CMTM6對HER2蛋白穩(wěn)定性的影響。結(jié)果：CMTM6 mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。低表達(dá)CMTM6能夠明顯抑制AGS和BGC-823細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；過表達(dá)CMTM6能夠顯著促進(jìn)AGS和BGC-823細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Co-IP顯示CMTM6和HER2存在結(jié)合，低表達(dá)CMTM6能夠顯著抑制HER2蛋白的表達(dá)，同時降低HER2蛋白穩(wěn)定性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在AGS和BGC-823細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染LV-CMTM6 和sh-HER2 后，能夠逆轉(zhuǎn)過表達(dá)CMTM6 對AGS 和BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響。結(jié)論：CMTM6在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)，CMTM6能夠靶向結(jié)合HER2，促進(jìn)HER2蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，以及抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。

【關(guān)鍵詞】胃癌；趨化素因子超家族6；人表皮生長因子受體2；增殖；侵襲；遷移；凋亡

【中圖分類號】R735.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-08-25

胃癌是全球常見的癌癥之一，由于早期疾病癥狀不明顯，且定期篩查率較低，大多數(shù)患者在晚期才被診斷[1]。近年來，胃癌的系統(tǒng)治療，包括化療、靶向治療和免疫治療，已經(jīng)取得了明顯進(jìn)展。對于可切除的胃癌，圍術(shù)期化療已成為標(biāo)準(zhǔn)治療[2]。對于轉(zhuǎn)移性胃癌，近年來在免疫治療和生物靶向治療方面取得進(jìn)步。目前，基于程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的靶向治療為胃癌患者提供了更多的治療選擇[3]。鑒于胃癌患者的整體生存率仍然相對較低，理解并闡述胃癌發(fā)生和發(fā)展詳細(xì)機(jī)制顯得尤為重要。趨化素樣因子（chemokine-like factor，CKLF）樣MARVEL跨膜結(jié)構(gòu)域（CKLF-like MARVEL trans?membrane domain containing，CMTM） 基因家族包括CKLF 和CMTM1-8，其中CMTM6 的研究主要集中在其抗腫瘤免疫中的功能[4]。然而，關(guān)于CMTM6在腫瘤發(fā)生中的作用尚未完全明確。有報道稱CMTM6 促進(jìn)頸部鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carci?noma of neck，NSCC）細(xì)胞干性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和抑制T細(xì)胞功能[5]。此外，高表達(dá)的CMTM6與口腔鱗狀細(xì)胞癌[6]和膠質(zhì)瘤[7]的不良預(yù)后有關(guān)。CMTM6被發(fā)現(xiàn)與非小細(xì)胞肺癌[8]和肺腺癌[9]的良好生存率相關(guān)。然而，在胃癌中，CMTM6的表達(dá)和生物學(xué)特性仍不清楚。本研究擬探討CMTM6對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2022年1月至2022年5月行腹腔鏡下畢Ⅱ式胃癌根除術(shù)后的3例胃癌患者，男2例，女1例，分別為TNM Ⅱ期2例（T2N2M0和T2N1M0）、Ⅲ期1例（T3N2M0）?；颊咴谛g(shù)中切除胃癌及癌旁正常組織，標(biāo)本凍存液氮罐中，用于進(jìn)一步檢測。所有患者術(shù)前均未接受放化療和生物治療等，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，CCK8試劑盒、Trizol和RIPA 裂解液購自中國碧云天公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒和PVDF膜購自美國賽默飛公司，RNA反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，Tran?swell小室和Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，蛋白A/G磁珠、CHX、一抗和二抗購自美國Sigma公司，轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 胃正常細(xì)胞GES-1 和胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，采用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000將shRNA針對CMTM6（5'-CCCAAGACAGTGAAAGTAATT-3'）sh-CMTM6或陰性對照shRNA轉(zhuǎn)染到AGS和BGC-823細(xì)胞，其具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.3.2 qRT-PCR 使用Trizol試劑從細(xì)胞和組織樣本中提取總RNA，并按照生產(chǎn)廠家的指示使用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA。使用特定引物進(jìn)行qRT-PCR，以GAPDH mRNA 轉(zhuǎn)錄本為對照，定量目標(biāo)基因的相對水平。引物序列為：CMTM6：F：5'-TTTCCACACATGACAGGACTTC-3'，R：5'-GGCTTCAGCCCTAGTGGTAT-3'；GAPDH：F：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，R：5'-GAGATGGTGATGGGATTTC-3'。使用2-ΔΔCt分析CMTM6相對表達(dá)水平。

1.3.3 CCK-8 方法檢測細(xì)胞增殖 AGS 和BGC-823 細(xì)胞（每孔5 000個細(xì)胞）接種到96孔板中培養(yǎng)，各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 和96 h 后，在最后1 h 培養(yǎng)期間，向每個孔中加入10 μL/well 的CCK-8 試劑，通過測量每個孔的吸光度（450 nm）來確定細(xì)胞增殖情況。

1.3.4 侵襲和遷移實驗 細(xì)胞侵襲實驗在24孔Transwell板（8 μm孔徑）中進(jìn)行，將AGS和BGC-823細(xì)胞在上層室中加入FBS無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上層室已涂有Matrigel基質(zhì)膠，下層室加入完整培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。用棉球清除上層室上表面的細(xì)胞，已侵入上層室下的細(xì)胞用0.5％戊二醛固定并用0.5％甲苯胺藍(lán)染色，然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照。在遷移實驗中上層室中不加入基質(zhì)膠，在每個膜上的3個視野中對細(xì)胞計數(shù)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù) AGS和BGC-823細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液（0.25 mg/mL），輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 Western blot法 收集轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量細(xì)胞裂解上清液中的蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE凝膠每孔加入40 μg的待測蛋白，110 V電泳，250 mA電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5％非脂肪奶粉的Tris緩沖鹽溶液和0.1％Tween-20（TBST）阻斷2 h，分別加入CMTM6、Cleaved-caspase-3和HER2一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3×10 min，二抗37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜3×30 min，ECL顯影。使用Image J軟件進(jìn)行密度掃描分析蛋白質(zhì)表達(dá)的相對水平。

1.3.7 免疫組化 胃癌組織和癌旁正常組織被固定并石蠟包埋。切片（4 μm）脫蠟和水化，然后在pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，在微波中加熱10 min。隨后，在3％的過氧化氫溶液中孵育，并使用5％牛血清白蛋白進(jìn)行阻斷。切片在4 ℃下用HER2的一抗抗體孵育過夜。在被洗滌后，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗抗體在室溫下檢測結(jié)合的抗體，并使用3，3'-二氨基聯(lián)苯進(jìn)行可視化，使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.8 蛋白穩(wěn)定性檢測 各組細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80％的密度，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后添加含有10 μmol/L CHX的培養(yǎng)基。在不同時間點（0、0.5、1和2 h）收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3 次，并制備細(xì)胞裂解液，然后就行Western blot 檢測HER2蛋白的表達(dá)水平。

1.3.9 免疫共沉淀 細(xì)胞在含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中裂解。離心后，將細(xì)胞裂解液樣品與抗CMTM6抗體、抗HER2抗體或?qū)φ彰庖咔虻鞍譏gG在4 ℃孵育4 h，然后與20 μL Dynabeads在4 ℃下輕輕搖晃過夜。經(jīng)過3次用冰冷PBS洗滌以去除未結(jié)合的抗體，然后通過SDSPAGE分離珠子上的結(jié)合免疫復(fù)合物，并分別使用抗HER2或抗CMTM6進(jìn)行Western blot。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 9軟件（GraphPad Software）進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗或配對t 檢驗，多組間比較采用方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 CMTM6在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)

在3 對胃癌組織和癌旁正常組織中檢測CMTM6 蛋白和mRNA 的表達(dá)水平，與癌旁正常組織相比，CMTM6蛋白（1.00±0.08 vs. 2.21±0.15；t=12.328，Plt;0.001，圖1A）和mRNA（1.00±0.11 vs. 1.82±0.13；t=8.432，P=0.001）的表達(dá)水平在胃癌組織中明顯上調(diào)。同時，在GEPIA數(shù)據(jù)中CMTM6在胃癌組織中明顯高表達(dá)（Plt;0.05，圖1B），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與胃正常細(xì)胞GES-1相比，CMTM6蛋白（3組間比較：F=93.376，Plt;0.001；兩兩比較：GES-1 vs. AGS，Plt;0.001，GES-1vs. BGC-823，Plt;0.001，圖1C）和mRNA（3 組間比較：F=97.675，Plt;0.001；兩兩比較：GES-1 vs. AGS，Plt;0.001，GES-1vs. BGC-823，Plt;0.001）在胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。CMTM6蛋白在GES-1、AGS和BGC-823細(xì)胞中的表達(dá)量分別為1.00±0.13，2.42±0.15 和2.56±0.18；CMTM6 mRNA 在GES-1、AGS 和BGC-823 細(xì)胞中的表達(dá)量分別為1.00±0.05，1.54±0.09和2.06±0.12。與轉(zhuǎn)染sh-NC 組相比，AGS（1.00±0.06 vs. 0.36±0.03，t=16.073，Plt;0.001）和BGC-823（1.00±0.08 vs. 0.27±0.02，t=14.909，Plt;0.001）細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-CMTM6后，CMTM6的表達(dá)水平明顯下降。

2.2 低表達(dá)CMTM6抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移

為進(jìn)一步驗證CMTM6對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，CCK-8增殖實驗顯示，與sh-NC組比較，sh-CMTM6組可明顯降低AGS細(xì)胞（圖2A）（時間：F=131.477，Plt;0.001；組別：F=303.501，Plt;0.001；時間組別交互：F=20.949，Plt;0.001）和BGC-823細(xì)胞（圖2B）（時間：F=298.427，Plt;0.001；組別：F=497.095，Plt;0.001；時間組別交互：F=41.116，Plt;0.001）的增殖能力；Transwell實驗顯示，與sh-NC組相比，sh-CMTM6組可明顯降低AGS 和BGC-823 細(xì)胞的遷移（AGS：25.00±2.00vs.15.00±3.00，t=4.804，P=0.009；BGC-823：24.00±2.00 vs.14.00±1.00，t=7.746，P=0.002，圖2C）和侵襲能力（AGS：17.00±2.00 vs. 6.00±1.00，t=8.521，P=0.001；BGC-823：15.00±3.00 vs. 5.00±2.00，t=4.804，P=0.009，圖2D）。這提示低表達(dá)CMTM6能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

2.3 低表達(dá)CMTM6促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞凋亡實驗顯示，與sh-NC組相比，sh-CMTM6組可明顯促進(jìn)AGS 和BGC-823 細(xì)胞的凋亡（AGS：5.60±0.42 vs.12.30±1.37，t=8.126，P=0.001；BGC-823：6.31±0.61vs. 13.45±1.10，t=9.808，P=0.001，圖3A）；Western blot 實驗顯示，與sh-NC 組相比，sh-CMTM6 組可明顯上調(diào)AGS 和BGC-823 細(xì)胞中Cleaved-caspase-3 的表達(dá)水平（AGS：1.00±0.12 vs.1.95±0.14，t=8.924，P=0.001；BGC-823：1.00±0.08 vs. 2.63±0.18，t=7.746，Plt;0.001，圖3B）。這提示低表達(dá)CMTM6能夠明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

2.4 CMTM6靶向結(jié)合HER2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和抑制細(xì)胞凋亡

CMTM6能夠通過HER2調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[10]。在本研究中為驗證CMTM6能否通過HER2調(diào)控胃癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，在AGS和BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-CMTM6后，與轉(zhuǎn)染sh-NC組相比，AGS（1.00±0.13 vs. 0.25±0.03，t=9.737，Plt;0.001）和BGC-823（1.00±0.09 vs. 0.23±0.01，t=14.728，Plt;0.001）細(xì)胞中HER2蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖4A），Co-IP 證實CMTM6 和HER2 結(jié)合情況（圖4B），在低表達(dá)CMTM6后能夠明顯抑制HER2蛋白的穩(wěn)定性，加速HER2蛋白降解（時間：F=62.132，Plt;0.001；組別：F=121.034，Plt;0.001；時間組別交互：F=12.602，Plt;0.001，圖4C）。免疫組化顯示HER2在胃癌組織中陽性表達(dá)（圖4D）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示：與sh-NC組相比，LV-CMTM6組可明顯促進(jìn)AGS和BGC-823細(xì)胞的侵襲能力，而同時轉(zhuǎn)染LV-CMTM6和sh-HER2 后，對AGS（3 組間比較：F=22.071，P=0.002；兩兩比較：sh-NC，16.00±3.00 vs. LV-CMTM6，27.00±2.00，P=0.001，sh-NC，16.00±3.00 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，18.00±1.00，P=0.460）和BGC-823（3組間比較：F=55.500，Plt;0.001；兩兩比較：sh-NC，14.00±1.00 vs. LV-CMTM6，25.00±2.00，Plt;0.001，sh-NC，14.00±1.00 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，15.00±1.00，P=0.620）細(xì)胞的侵襲能力無影響。流式細(xì)胞凋亡實驗顯示，與sh-NC 組相比，LV-CMTM6 組可明顯抑制AGS 和BGC-823 細(xì)胞的凋亡，而同時轉(zhuǎn)染LV-CMTM6 和sh-HER2 后，對AGS（3 組間比較：F=70.496，Plt;0.001；兩兩比較：sh-NC，6.20±0.50 vs. LV-CMTM6，2.50±0.18，Plt;0.001，sh-NC，6.20±0.50 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，6.00±0.52，P=0.800）和BGC-823（3組間比較：F=65.408，Plt;0.001；兩兩比較：sh-NC，6.10±0.45 vs. LV-CMTM6，2.80±0.21，Plt;0.001，sh-NC，6.10±0.45 vs. LV-CMTM6+sh-HER2，5.80±0.46，P=0.570）細(xì)胞的凋亡率無影響。這提示CMTM6能夠靶向結(jié)合HER2促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，以及抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。

3 討 論

HER2是一種跨膜酪氨酸激酶受體，屬于HER受體家族。研究顯示HER2在胃癌中顯著高表達(dá)，尤其是在腸型和胃食管連接處[11]。HER2過表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良、侵襲性行為和耐藥性有關(guān)[12]。曲妥珠單抗是一種針對HER2的單克隆抗體，已經(jīng)獲批用于與化療聯(lián)合治療HER2陽性晚期胃癌，顯示出顯著的生存益處[7]。然而，曲妥珠單抗耐藥是限制其臨床療效的主要挑戰(zhàn)。CMTM6已被證明參與多種生物學(xué)過程，如免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生[13]。CMTM6已被確定為PD-L1的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，PD-L1 是PD-1 的配體，介導(dǎo)癌細(xì)胞的免疫逃避[14]。CMTM6通過防止PD-L1的泛素化和降解來穩(wěn)定PD-L1蛋白，從而增強(qiáng)其在細(xì)胞表面的表達(dá)[7]。CMTM6在多種人類癌癥中高度表達(dá)，并與患者不良預(yù)后和免疫抑制相關(guān)。此外，CMTM6已被證明與HER2相互作用，并調(diào)節(jié)其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和信號傳遞，導(dǎo)致曲妥珠單抗耐藥[10]。

在本研究中納入3 對胃癌組織和癌旁正常組織，CMTM6 蛋白和mRNA 在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中CMTM6在胃癌組織中顯著高表達(dá)，同時在胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在細(xì)胞功能驗證中，低表達(dá)CMTM6能夠顯著抑制AGS和BGC-823細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；過表達(dá)CMTM6能夠顯著促進(jìn)AGS和BGC-823細(xì)胞的增強(qiáng)、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞凋亡。研究顯示CMTM6在多種惡性腫瘤中過度表達(dá)，與腦膠質(zhì)瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、非小細(xì)胞肺癌和肝癌的惡性程度相關(guān)，并與患者預(yù)后不良有關(guān)[7，15-16]。在本研究中CMTM6能夠抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展。

HER2是屬于人表皮生長因子受體家族的跨膜酪氨酸激酶受體[17]，能夠通過Ras-絲裂原活化蛋白激酶途徑或磷脂酰肌醇3′-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能[18]。1項涉及多個中心的大規(guī)模研究[19]評估了1 148例接受胃切除手術(shù)的胃癌患者中HER-2表達(dá)的預(yù)后影響，結(jié)果提示HER2過表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的危險因素。1項匯總5 290例胃癌患者的薈萃分析表明，HER-2過表達(dá)與患者的OS 明顯相關(guān)，同時HER-2 表達(dá)水平與Bormann 分型、Lauren分類、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)狀態(tài)、靜脈侵犯和淋巴管侵犯密切相關(guān)[20]。在本研究中發(fā)現(xiàn)低表達(dá)CMTM6能夠明顯抑制HER-2表達(dá)水平，在低表達(dá)CMTM6后能夠明顯抑制HER2蛋白的穩(wěn)定性，加速HER2蛋白降解。進(jìn)一步實驗證實CMTM6 能夠靶向結(jié)合HER2促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，以及抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，CMTM6在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)，CMTM6能夠靶向結(jié)合HER2，促進(jìn)HER2蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，以及抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。CMTM6可能成為胃癌的治療靶點。

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（責(zé)任編輯：周一青）