【摘 要】目的：研究?jī)?nèi)在過表達(dá)miR-31及其下游靶基因Sfn、SuFu在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：從文獻(xiàn)及PubMed收集與銀屑病相關(guān)基因，使用Target Scan Human數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-31靶基因。使用咪喹莫特乳膏對(duì)野生型FVB小鼠和miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行銀屑病造模，每日采集造模小鼠背部變化圖像，隨后使用PASI評(píng)分評(píng)價(jià)小鼠銀屑病樣情況。HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化。取0 d、3 d、7 d模型小鼠的背部皮膚，隨后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)miR-31及其下游靶基因mRNAs的表達(dá)，篩選出2個(gè)miR-31靶基因，并對(duì)篩選靶基因進(jìn)行免疫熒光及Western blot檢測(cè)分析。結(jié)果：Target Scan Human數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)出8個(gè)miR-31下游靶基因，經(jīng)熒光定量PCR篩選出2個(gè)與銀屑病相關(guān)靶基因Sfn、SuFu。咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生銀屑病樣癥狀，表現(xiàn)為背部出現(xiàn)紅斑、銀白鱗屑，表皮增厚等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-31實(shí)驗(yàn)組較野生型FVB實(shí)驗(yàn)組銀屑病樣癥狀輕，HE染色切片同樣證實(shí)此情況。RT-PCR檢測(cè)3 d、7 d時(shí)miR-31，Sfn和SuFu的表達(dá)，結(jié)果顯示野生型FVB小鼠miR-31的表達(dá)均升高，而miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31的表達(dá)卻降低，其靶基因Sfn、SuFu均出現(xiàn)相反情況，免疫熒光及western blot結(jié)果均與PCR結(jié)果一致。結(jié)論：在銀屑病動(dòng)物模型中，內(nèi)在過表達(dá)miR-31的皮膚，其銀屑病樣癥狀較弱，它可能聯(lián)合機(jī)體內(nèi)與銀屑病相關(guān)的器官通過內(nèi)在過表達(dá)miR-31的調(diào)控作用而減弱銀屑病嚴(yán)重程度。Sfn、SuFu作為miR-31下游靶基因，可能在銀屑病的發(fā)病過程中起抑制作用。

【關(guān)鍵詞】微小RNA-31；銀屑病；絲氨酸/蘇氨酸激酶Fused抑制物；分層蛋白

【中圖分類號(hào)】R758.63 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-12-01

銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)為皮膚紅斑、大量銀白色鱗屑覆蓋及表皮增厚，病理表現(xiàn)為表皮異常增生伴隨顆粒層的消失、角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等[1-2]。目前尚無有效治療銀屑病的藥物和方法。近年來隨著對(duì)microRNAs（miRNAs）研究的不斷發(fā)展，越來越多的miRNAs在銀屑病中被發(fā)現(xiàn)[3]。MiR?NAs 是一類非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶mRNA完全或不完全結(jié)合，使其降解或抑制其轉(zhuǎn)錄，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[4]。MiRNAs在調(diào)節(jié)個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡及包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究使用基因芯片技術(shù)篩選銀屑病皮損組織與健康人皮膚組織差異性表達(dá)的miRNAs，結(jié)果顯示miR-31 表達(dá)上調(diào)且最為明顯[5]。但究竟是過表達(dá)的miR-31引起銀屑病的發(fā)生，還是機(jī)體因銀屑病的發(fā)展而使miR-31過表達(dá)，這并不是很明確。

本課題組之前構(gòu)建了miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠，且miR-31在各組織器官中穩(wěn)定過表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究使用咪喹莫特乳膏對(duì)miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型FVB小鼠進(jìn)行銀屑病模型的制作，并形成對(duì)比。意在研究?jī)?nèi)在過表達(dá)的miR-31在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。為了進(jìn)一步研究miR-31在銀屑病進(jìn)程中所發(fā)揮的作用，本研究篩選出2個(gè)miR-31下游靶基因Sfn和SuFu。SuFu為Hedgehog信號(hào)通路重要的抑制因子，先前研究表明Hedgehog信號(hào)通路在銀屑病中是被激活的，而此通路的激活能夠誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增生[6-7]。Sfn是一種具有高同源性的14-3-3蛋白家族成員，在所有真核生物體中都表達(dá)的調(diào)控分子，其參與細(xì)胞周期調(diào)控，抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，阻止分裂，促進(jìn)終末分化，最終誘導(dǎo)其凋亡[8-10]。

因此，本研究利用miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠，研究?jī)?nèi)在過表達(dá)miR-31在銀屑病動(dòng)物模型中所發(fā)揮的作用，探究miR-31及其靶基因Sfn、SuFu如何發(fā)揮調(diào)控作用而影響銀屑病的進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)FVB小鼠64只，3～4個(gè)月齡，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[編號(hào)：SCXK（晉）2019-0004]，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中[編號(hào)：SYXK（晉）2019-0007]，飼養(yǎng)期間給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料及潔凈飲用水（均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)過程和其他實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求以及中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半交替，濕度恒定，溫度20～25 ℃。本研究得到山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：KQDW-2022-007）。采用隨機(jī)分組方式分別將miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠（n=32）和野生型FVB小鼠（n=32）分為0 d（n=8），3 d（n=12），7 d（n=12），實(shí)驗(yàn)分組見表1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（ThermoFisher Scientific，美國(guó)），石蠟切片機(jī)（Leica RM 2245，德國(guó)），熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本），電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)），轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國(guó)），高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）。咪喹莫特乳膏46 mg（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司），miRNA Isolation Kit（Life technologies），Trizol（Life technolo?gies），熒光定量試劑盒（TaqMan MicroRNA Assay，ABI），一抗（Rabbit Anti-14-3-3 sigma，ab151504，abcam；Rabbit Anti-Suppressor of Fused，ab28083，abcam），二抗（FITC-Goat Anti-Rabbit IgG，BA1105，Boster；Goat Anti-Rabbit IgG，BA1054，Boster），HE 染色試劑盒（G1120，Solarbio），hoechst（C0020，Solarbio）。

1.2 方法

1.2.1 收集基因 預(yù)測(cè)miR-31 靶基因經(jīng)文獻(xiàn)閱讀和PubMed 收集相關(guān)基因40 余個(gè)。與細(xì)胞增殖相關(guān)：IRF-4、PAK1、CD47；與細(xì)胞分化相關(guān)：Sfn、SuFu、RUNX3；與調(diào)控轉(zhuǎn)錄相關(guān)：c/EBPα、KGF等。每個(gè)基因功能多樣，有的功能相互交叉，然后利用Target Scan Human數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-31靶基因。

1.2.2 銀屑病模型制作 將實(shí)驗(yàn)組小鼠用1%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，用動(dòng)物推毛器將小鼠背部毛發(fā)剔除，形成一個(gè)2 cm×3 cm 的暴露區(qū)域，連續(xù)7 d 在暴露區(qū)域涂抹5%咪喹莫特乳膏46 mg，采用數(shù)碼照相的方式每天采集小鼠背部變化照片。

1.2.3 PASI評(píng)分 小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度（psoriasis area and severity index，PASI）評(píng)分，依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)小鼠皮損處紅斑（erythema）、鱗屑（scales）及浸潤(rùn)增厚程度（thickness）進(jìn)行評(píng)分，然后匯總相加得到總分（cumu?lative scores）。對(duì)各組小鼠進(jìn)行評(píng)分繪制趨勢(shì)線，評(píng)估各組小鼠皮損的變化情況。PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按照疾病嚴(yán)重程度分為0級(jí)（無），1級(jí)（輕度），2級(jí)（中度），3級(jí)（重度），4級(jí)（極重度）。不同的嚴(yán)重程度對(duì)應(yīng)不同的癥狀，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.2.4 miR-31 和預(yù)測(cè)靶基因mRNA 的表達(dá)量檢測(cè) 取100 mg 左右背部皮膚剪碎研磨，分別用miRNA Isolation Kit和Trizol提取miRNAs和總RNA，隨后經(jīng)RT-PCR檢測(cè)miR-31和預(yù)測(cè)靶基因mRNA的表達(dá)，引物序列見表3。

成熟miR-31 序列：AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCUG。miR-31反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟：100 nmol/L dNTP 0.15 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL、10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 1.5 μL、RNase抑制劑0.19 μL、無核酸酶水 4.16 μL、RNA 5 μL、反轉(zhuǎn)錄引物 3 μL，反應(yīng)體系：15 μL。反應(yīng)程序：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。熒光定量PCR 反應(yīng)步驟：Taqman Small RNA Assay 1 μL、cDNA 1.33 μL、Taqman Universal PCR預(yù)混液 10 μL、無核酸酶水 7.67 μL，反應(yīng)體系：20 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，后2 個(gè)循環(huán)重復(fù)40次。

靶基因RT 反應(yīng)步驟：RNA 1 μL、oligo（dt）引物 1 μL、Rnase free water 4 μL，70 ℃ 10 min后冰上急冷2 min以上。模板引物變性溶液6 μL、5×M-MLV緩沖液2 μL、dNTP預(yù)混液0.5 μL、Rnase抑制劑 0.25 μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL、無核酸酶水1 μL，反應(yīng)體系：10 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 1 h、70 ℃ 15 min。熒光定量PCR反應(yīng)步驟：SBRY Green 10 μL、引物0.6 μL、cDNA 1 μL、無核酸酶水8.4 μL，反應(yīng)體系：20 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，后2個(gè)循環(huán)重復(fù)40次。

1.2.5 HE染色及免疫熒光染色 皮膚取材后立即置于4%多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)步驟脫水包埋。將包埋好的蠟塊置于切片機(jī)上，5 μm厚度連續(xù)切片，經(jīng)展片、撈片、烘片后待用。HE染色：切片脫蠟，蘇木精3 min，蒸餾水沖洗，分化液30 s，蒸餾水浸泡15 min，伊紅染液2 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片后鏡下觀察。免疫熒光染色：切片脫蠟后進(jìn)行抗原熱修復(fù)，7％山羊血清室溫封閉30 min，一抗4 ℃過夜孵育，PBS清洗后二抗室溫避光孵育2 h，hoechst復(fù)染后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western blot 100 mg 皮膚組織加入增強(qiáng)型RIPA 裂解液和1％ PMSF 冰上充分研磨，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min后分裝收集蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定后-80 ℃保存待用。依蛋白分子量配置適宜的分離膠和5％的濃縮膠，依各組蛋白濃度20 μg 等質(zhì)量上樣，按marker 條帶切下目的條帶，轉(zhuǎn)膜1 h，5％脫脂奶粉室溫封閉1 h，適宜濃度一抗4 ℃孵育過夜，TBST 清洗后適宜濃度二抗室溫孵育2 h，TBST清洗后拍照保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 6軟件處理。在經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性驗(yàn)證之后，滿足正態(tài)分布和方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。2組組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較進(jìn)行重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠銀屑病動(dòng)物模型皮損形態(tài)學(xué)變化及PASI評(píng)分

咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生銀屑病樣癥狀。一般從第3 天開始出現(xiàn)少量紅斑、細(xì)微銀白鱗屑、輕微皮損褶皺，隨后癥狀逐漸加重，連續(xù)涂藥5～8 d（默認(rèn)第7天為最嚴(yán)重時(shí)期）出現(xiàn)明顯銀屑病樣癥狀，此后鱗屑開始脫落，癥狀減弱。依圖可見野生型FVB實(shí)驗(yàn)組小鼠第3天出現(xiàn)銀屑病樣癥狀，第4天出現(xiàn)片狀銀白鱗屑，第5天達(dá)到最嚴(yán)重期，可見層狀銀白色鱗屑覆蓋，隨著時(shí)間的推移，鱗屑脫落，癥狀減弱。MiR-31轉(zhuǎn)基因小鼠第3天同樣出現(xiàn)銀屑病樣癥狀，但較普通FVB小鼠較輕，隨著時(shí)間的推移，銀白鱗屑少量增加、輕微皮損褶皺，但不及普通FVB小鼠的銀屑病癥狀（圖1A）。PASI評(píng)分趨勢(shì)線同樣反映出2組實(shí)驗(yàn)小鼠皮損變化對(duì)比情況（圖1B）。HE染色切片顯示，第0天實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚表皮及細(xì)胞形態(tài)正常，2組并無差異。第7天時(shí)，野生型FVB實(shí)驗(yàn)組小鼠表皮層明顯增厚，基底層角化細(xì)胞異常增生，膜脊延長(zhǎng)，真皮層毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀則相對(duì)較輕（圖1C）。另外在第7天時(shí)，本研究解剖發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中兩組小鼠脾臟均明顯淤血腫大，而且癥狀越嚴(yán)重的野生型FVB小鼠，脾臟淤血腫大程度越重（圖1D）。說明銀屑病的進(jìn)展不僅會(huì)引起表皮癥狀，還會(huì)累及脾臟等其他器官。

2.2 篩選Sfn、SuFu

Taget Scan Human 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)出8 個(gè)miR-31 靶基因Bcl-XL、cebpα、Xiap、Irf4、Sfn、SuFu、Tnip1、Pak1（圖3A）。熒光定量PCR結(jié)果顯示，造模7 d時(shí)，野生型FVB小鼠miR-31的表達(dá)升高，而miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31的表達(dá)則降低（圖2B）。依據(jù)miRNA 與靶基因的表達(dá)關(guān)系，Bcl-XL、cebpα、Irf4、Pak1、Sfn、SuFu符合miR-31下游靶基因變化趨勢(shì)（圖2C）。經(jīng)文獻(xiàn)閱讀及基因功能分析，挑選出Sfn（F=17.108，P=0.014）、SuFu（F=12.395，P=0.024）2個(gè)下游靶基因做進(jìn)一步研究（圖2A）。

2.3 miR-31、Sfn、SuFu在銀屑病進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)變化

為了更好地研究miR-31、Sfn、SuFu在銀屑病中的動(dòng)態(tài)變化情況，本研究在銀屑病造模過程中取第3天（剛出現(xiàn)銀屑病癥狀）皮膚進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果顯示，第3天時(shí)，野生型FVB小鼠miR-31的表達(dá)最高（圖3A），Sfn、SuFu的表達(dá)均降低（圖3B）；miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31的表達(dá)最低（圖3A），Sfn、SuFu的表達(dá)均升高（圖3B）?？傮w來說在銀屑病樣癥狀開始出現(xiàn)到最嚴(yán)重時(shí)期這個(gè)時(shí)間段，普通FVB 小鼠miR-31的表達(dá)升高（F=19.594，P=0.011），而miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31的表達(dá)則降低（F=32.260，P=0.005），Sfn和SuFu的表達(dá)均符合靶基因變化趨勢(shì)。

2.4 2組之間miR-31、Sfn、SuFu對(duì)比

綜上結(jié)果表明，野生型FVB小鼠銀屑病癥狀重于miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠，miR-31的表達(dá)量影響著銀屑病的嚴(yán)重程度。為了更好地說明2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的疾病變化情況，在0 d、3 d、7 d時(shí)，本研究將miR-31、Sfn、SuFu的表達(dá)進(jìn)行組間對(duì)比。從結(jié)果可以看出，0 d時(shí)，miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31的表達(dá)明顯高于野生型FVB小鼠（F=54.431，P=0.002），3 d、7 d時(shí)，miR-31 轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31 的表達(dá)低于野生型FVB 小鼠，Sfn、SuFu的表達(dá)則與之相反（圖4A）。免疫熒光結(jié)果顯示，在銀屑病癥狀最嚴(yán)重時(shí)期，野生型FVB小鼠表皮層增厚明顯，角質(zhì)形成細(xì)胞增生異常，但基底層下Sfn、SuFu陽性細(xì)胞明顯少于miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠（圖4B），Western blot結(jié)果（圖4C）與熒光定量PCR結(jié)果一致。

3 討 論

銀屑病是臨床上常見的一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，對(duì)于銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究也一直是研究重點(diǎn)，但到目前為止，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。目前認(rèn)為銀屑病是由多種因素相互作用而形成的一種多基因遺傳病[2]，其中遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素起主要作用。在銀屑病發(fā)生發(fā)展的過程中，多種細(xì)胞（角質(zhì)形成細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等）、趨化因子、細(xì)胞因子、多條細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路共同參與[11]，因此形成了銀屑病的疾病復(fù)雜性。

近年來，miRNAs成為研究熱點(diǎn)，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在皮膚的生理病理過程中都發(fā)揮著非常重要的作用。MiR-31在銀屑病皮損組織中表達(dá)異常已經(jīng)得到證實(shí)，這也意味著miR-31可能與銀屑病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。Xu N等[12]證實(shí)在銀屑病中，miR-31過表達(dá)并通過調(diào)控炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和白細(xì)胞浸潤(rùn)皮膚而加重銀屑病的炎癥。

在已有miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，本研究使用miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型FVB小鼠進(jìn)行銀屑病模型制作，通過對(duì)造模圖片和HE染色切片的觀察可以看出，野生型FVB 小鼠銀屑病癥狀重于miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，從銀屑病開始出現(xiàn)到最嚴(yán)重這個(gè)時(shí)間段，野生型FVB小鼠miR-31 的表達(dá)升高，而miR-31 轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31的表達(dá)降低。但為何miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠在銀屑病過程中出現(xiàn)miR-31表達(dá)顯著降低的現(xiàn)象，這是本研究在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的有趣的現(xiàn)象，表明內(nèi)在過表達(dá)的miR-31在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中可能會(huì)緩解銀屑病的嚴(yán)重程度。另外本研究在取材時(shí)發(fā)現(xiàn)，造模小鼠的脾臟、肝臟等出現(xiàn)明顯的淤血腫大現(xiàn)象，尤其脾臟腫大增厚，顏色加深，這說明銀屑病的癥狀不僅僅是表現(xiàn)在皮膚的單一情況。Balato N 等[13] 認(rèn)為IL-1β，IL-6，C-reactive protein，E-selectin，TNF-α等血清炎癥標(biāo)記物的升高使銀屑病從皮膚性疾病上升為系統(tǒng)性疾病。銀屑病并發(fā)銀屑病性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、心臟代謝紊亂、高血壓、糖尿病、脂肪肝等疾病也都有報(bào)道[14-17]。Balato N等[13]認(rèn)為銀屑病中脾臟體積的增大并不是一種并發(fā)癥，而是免疫系統(tǒng)對(duì)慢性炎癥狀態(tài)的一種應(yīng)答。而脾臟是人體最大的淋巴器官，在機(jī)體免疫功能中起非常重要作用。Dai RJ等[18]認(rèn)為miR-31在系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型的脾臟細(xì)胞中過表達(dá)。而銀屑病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病都與自身免疫功能紊亂、遺傳等諸多因素有關(guān)。所以，脾臟可能在銀屑病等自身免疫性炎癥性疾病中起到重要作用。結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究推測(cè)皮膚聯(lián)合脾臟內(nèi)在過表達(dá)miR-31 會(huì)對(duì)銀屑病的癥狀起到抑制作用。這說明銀屑病的發(fā)生發(fā)展會(huì)引起受累組織器官的miR-31 過表達(dá)，但若受累器官內(nèi)在過表達(dá)miR-31可能會(huì)因其調(diào)控而減弱疾病的嚴(yán)重程度。

既然內(nèi)在過表達(dá)的miR-31會(huì)減弱銀屑病的嚴(yán)重程度，那么miR-31是怎樣發(fā)揮其調(diào)控作用？經(jīng)過對(duì)其靶基因Sfn、SuFu的檢測(cè)分析。Sfn作為一種細(xì)胞周期的調(diào)控分子，能夠抑制細(xì)胞增殖，Sfn蛋白的表達(dá)受多方面調(diào)控，p53是Sfn基因的主要調(diào)控因子，去磷酸化的p53可激活Sfn的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞有絲分裂。此外，Sfn的激活可發(fā)揮其正反饋?zhàn)饔?，增加p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性[19]。P53作為一種磷蛋白，表明其具有轉(zhuǎn)錄因子樣性質(zhì)[20-21]。P53的免疫反應(yīng)性已經(jīng)在多種免疫性皮膚病中被發(fā)現(xiàn)，比如：銀屑病、慢性皮炎、紅斑狼瘡等[22]。Moorchung N等[23]認(rèn)為p53在銀屑病中扮演者重要角色。結(jié)合熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在兩組銀屑病模型中，Sfn在野生型FVB小鼠中低表達(dá)，在miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)，結(jié)合銀屑病造模圖片可知，Sfn過表達(dá)可減輕銀屑病癥狀。SuFu為Hedgehog信號(hào)通路重要的抑制因子，它通過降解Hh通路配體而發(fā)揮抑制作用。Shh是皮膚中主要的Hh配體[24]，Shh能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、遷移，抑制其凋亡，Hh信號(hào)通路通過其配體Shh 的激活在銀屑病中發(fā)揮作用[25-26]。結(jié)合熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SuFu同樣在野生型FVB小鼠中低表達(dá)，在miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)，過表達(dá)的SuFu通過降解Shh而抑制Hh信號(hào)通路的激活，從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖，減輕銀屑病癥狀，這與造模圖片結(jié)果相符。因此，通過對(duì)miR-31及其下游靶基因Sfn、SuFu的檢測(cè)分析。本研究認(rèn)為miR-31可能通過調(diào)控Sfn或SuFu這兩條通路，在減輕銀屑病癥狀方面發(fā)揮作用。

綜上所述，過表達(dá)的miR-31會(huì)減弱銀屑病癥狀，而通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)在過表達(dá)miR-31的轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病癥狀反而較野生型FVB小鼠弱，經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠miR-31的表達(dá)是明顯降低的，在實(shí)驗(yàn)過程中，本研究還發(fā)現(xiàn)脾臟淤血腫大明顯，這說明銀屑病是一種系統(tǒng)性疾病。所以本研究推測(cè)，皮膚聯(lián)合脾臟內(nèi)在過表達(dá)miR-31可能會(huì)減弱銀屑病嚴(yán)重程度，miR-31的調(diào)控作用不僅僅作用在皮膚，聯(lián)合的調(diào)控作用也是系統(tǒng)性疾病應(yīng)該考慮的方向。作為miR-31 下游靶基因，Sfn、SuFu同樣在miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中過表達(dá)并可減弱銀屑病的嚴(yán)重程度，但miR-31、Sfn和SuFu究竟如何調(diào)控銀屑病的發(fā)生發(fā)展，還需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)內(nèi)在過表達(dá)的miR-31在銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中的研究，發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性疾病中，全面考慮與疾病相關(guān)的組織器官，可能會(huì)為疾病的發(fā)病機(jī)制研究和治療提供新的方向。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Sch?n MP，Boehncke WH. Psoriasis[J]. N Engl J Med，2005，352

（18）：1899-1912．

[2] Lowes MA，Bowcock AM，Krueger JG. Pathogenesis and therapy of

psoriasis[J]. Nature，2007，445（7130）：866-873．

[3] Xia J，Joyce CE，Bowcock AM，et al. Noncanonical microRNAs

and endogenous siRNAs in normal and psoriatic human skin[J]. Hum

Mol Genet，2013，22（4）：737-748．

[4] Fabian MR，Sonenberg N，F(xiàn)ilipowicz W. Regulation of mRNA

translation and stability by microRNAs[J]. Annu Rev Biochem，2010，

79：351-379．

[5] 唐雪勇. 銀屑病皮損組織中miRNA的差異表達(dá)分析及竹黃顆

粒劑對(duì)其的干預(yù)作用[D]. 長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012．

Tang XY. Study on the Differential Exppession of MiRNA in Psoriatic

Skin and the Intervention Effects of ZhuHuang Granule[D]. Changsha：

Hunan University of Chinese Medicine，2012．

[6] Endo H，Momota Y，Oikawa A，et al. Psoriatic skin expresses the

transcription factor Gli1：possible contribution of decreased neurofibro?

min expression[J]. Br J Dermatol，2006，154（4）：619-623．

[7] Fan H，Khavari PA. Sonic hedgehog opposes epithelial cell cycle

arrest[J]. J Cell Biol，1999，147（1）：71-76．

[8] Hermeking H，Benzinger A. 14-3-3 proteins in cell cycle regula?

tion[J]. Semin Cancer Biol，2006，16（3）：183-192．

[9] Conklin DS，Galaktionov K，Beach D. 14-3-3 proteins associate

with cdc25 phosphatases[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（17）：

7892-7896．

[10] Laronga C，Yang HY，Neal C，et al. Association of the cyclindependent

kinases and 14-3-3 sigma negatively regulates cell cycle

progression[J]. J Biol Chem，2000，275（30）：23106-23112．

[11] Sabat R，Sterry W，Philipp S，et al. Three decades of psoriasis re?

search：where has it led us？[J]. Clin Dermatol，2007，25（6）：504-509．

[12] Xu N，Meisgen F，Butler LM，et al. MicroRNA-31 is overex?

pressed in psoriasis and modulates inflammatory cytokine and chemo?

kine production in keratinocytes via targeting serine/threonine kinase 40

[J]. J Immunol，2013，190（2）：678-688．

[13] Balato N，Napolitano M，Ayala F，et al. Nonalcoholic fatty liver

disease，spleen and psoriasis：new aspects of low-grade chronic inflam?

mation[J]. World J Gastroenterol，2015，21（22）：6892-6897．

[14] Dowlatshahi EA，van der Voort EA，Arends LR，et al. Markers of

systemic inflammation in psoriasis：a systematic review and metaanalysis[

J]. Br J Dermatol，2013，169（2）：266-282．

[15] Balato A，di Caprio R，Canta L，et al. IL-33 is regulated by TNF-

α in normal and psoriatic skin[J]. Arch Dermatol Res，2014，306（3）：

299-304．

[16] Ghazizadeh R，Shimizu H，Tosa M，et al. Pathogenic mechanisms

shared between psoriasis and cardiovascular disease[J]. Int J Med Sci，

2010，7（5）：284-289．

[17] Davidovici BB，Sattar N，Prinz J，et al. Psoriasis and systemic in?

flammatory diseases：potential mechanistic links between skin disease

and co-morbid conditions[J]. J Invest Dermatol，2010，130（7）：1785-

1796．

[18] Dai RJ，Zhang Y，Khan D，et al. Identification of a common lupus

disease-associated microRNA expression pattern in three different mu?

rine models of lupus[J]. PLoS One，2010，5（12）：e14302．

[19] Li ZM，Liu JY，Zhang JT. 14-3-3sigma，the double-edged sword

of human cancers[J]. Am J Transl Res，2009，1（4）：326-340．

[20] Wrone-Smith T，Johnson T，Nelson B，et al. Discordant expres?

sion of Bcl-x and Bcl-2 by keratinocytes in vitro and psoriatic keratino?

cytes in vivo[J]. Am J Pathol，1995，146（5）：1079-1088．

[21] Bianchi L，F(xiàn)arrace MG，Nini G，et al. Abnormal Bcl-2 and“ tis?

sue” transglutaminase expression in psoriatic skin[J]. J Invest Dermatol，

1994，103（6）：829-833．

[22] Soini Y，Kamel D，P??kk? P，et al. Aberrant accumulation of p53

associates with Ki67 and mitotic count in benign skin lesions[J]. Br J

Dermatol，1994，131（4）：514-520．

[23] Moorchung N，Vasudevan B，Dinesh Kumar S，et al. Expression of

apoptosis regulating proteins p53 and bcl-2 in psoriasis[J]. Indian J

Pathol Microbiol，2015，58（4）：423-426．

[24] Dahmane N，Lee J，Robins P，et al. Activation of the transcription

factor Gli1 and the Sonic hedgehog signalling pathway in skin tumours

[J]. Nature，1997，389（6653）：876-881．

[25] 曹華莉. Hedgehog信號(hào)通路在銀屑病發(fā)病中的機(jī)制研究[D].

杭州：浙江大學(xué)，2015．

Cao HL. Role of Hedgehog Signaling Pathway in Psoriasis[D]. Hang?

zhou：Zhejiang University，2015．

[26] Liu HY，Jian Q，Xue K，et al. The MEK/ERK signalling cascade

is required for sonic hedgehog signalling pathway-mediated enhance?

ment of proliferation and inhibition of apoptosis in normal keratinocytes

[J]. Exp Dermatol，2014，23（12）：896-901．

（責(zé)任編輯：李青穎）