【摘 要】目的：研究抑制含GluA2亞基的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa?zolepropionic acid receptors，AMPARs）的內(nèi)吞對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）大鼠模型運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知能力的作用及相關(guān)機(jī)制。方法：構(gòu)建中度TBI模型大鼠，分為Sham（僅開(kāi)放顱窗）組，saline（生理鹽水處理）組，scr-GluA23Y（對(duì)照肽scrambledTat-GluA23Y處理）組和GluA23Y（實(shí)驗(yàn)肽Tat-GluA23Y處理）組，通過(guò)改良神經(jīng)功能評(píng)分（Mahmood’s method neurological severityscore，mNSS）及抓力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)及神經(jīng)功能改善情況，之后用新物體實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的探索能力與空間學(xué)習(xí)記憶能力。后期通過(guò)Western blot分別檢測(cè)海馬體的突觸蛋白和總蛋白中AMPARs表達(dá)情況的變化。結(jié)果：mNSS及抓力實(shí)驗(yàn)顯示：隨時(shí)間推移，GluA23Y 組的神經(jīng)功能狀態(tài)（P=0.013）及抓力（Plt;0.001）相較于saline 組明顯改善。新物體實(shí)驗(yàn)顯示：GluA23Y 組的接觸次數(shù)（0.60±0.02，Plt;0.01）及接觸時(shí)間（0.57±0.03，P=0.011）與scr-GluA23Y 組相比明顯增加（Plt;0.01，P=0.010）。水迷宮結(jié)果顯示：與scr-GluA23Y 組相比，GluA23Y 組（21.43±1.76）的學(xué)習(xí)（Plt;0.001）與記憶（P=0.037）能力提高。Western blot顯示：與對(duì)照組相比，GluA23Y治療（0.98±0.03，P=0.981 vs. Sham組，P=0.025 vs. saline組，P=0.025 vs. scr-GluA23Y組）可特異性提高海馬中GluA2的含量。結(jié)論：AMPARs內(nèi)吞抑制劑，如Tat-GluA23Y可通過(guò)提高大鼠海馬體中GluA2的含量來(lái)修復(fù)TBI引起的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能受損。

【關(guān)鍵詞】創(chuàng)傷性腦損傷；α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體內(nèi)吞作用；學(xué)習(xí)和記憶；海馬體

【中圖分類號(hào)】R3 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-09-05

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指由于大腦在顱骨內(nèi)受到物理沖擊導(dǎo)致的疾病，其可被定義為由外力引起的腦功能或病理改變[1-2]。此外，它也是慢性神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ『团两鹕。┑墓J(rèn)危險(xiǎn)因素[3-5]。但目前某些臨床用藥可能導(dǎo)致TBI患者出現(xiàn)耐藥性及意識(shí)下降等副作用[6]，這嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，迫切需要在臨床上探索有效控制TBI患者創(chuàng)傷后癥狀的潛在替代方案。

有研究報(bào)道，兒童和成人在TBI后都經(jīng)歷了明顯的神經(jīng)損傷和認(rèn)知障礙，即使輕度TBI也可在損傷后3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)認(rèn)知缺陷[7]。不同的TBI大鼠模型同樣顯示出明顯的神經(jīng)功能損傷和認(rèn)知障礙[6，8]。然而，這些變化背后的細(xì)胞和分子水平機(jī)制仍不清楚。大量證據(jù)表明，海馬體CA1區(qū)谷氨酸能突觸的活動(dòng)依賴性突觸可塑性是某些類型的學(xué)習(xí)和記憶背后的一種細(xì)胞機(jī)制[9-11]，而含GluA2的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hy?droxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors，AMPARs）的內(nèi)吞作用在認(rèn)知功能中起著關(guān)鍵作用[12-15]。本研究之前的研究發(fā)現(xiàn)，母鼠睡眠剝奪引起的突觸后AMPAR內(nèi)吞作用增強(qiáng)與子代大鼠的突觸可塑性和認(rèn)知功能受損之間存在因果關(guān)系[16]。同樣，AD 模型小鼠的認(rèn)知功能障礙也是由AMPARs內(nèi)吞作用引起[17]。

雖然先前的研究已確定AMPARs 在認(rèn)知功能中的潛在作用，但關(guān)于TBI中AMPARs內(nèi)吞的具體機(jī)制及其影響尚未充分探討。因此，本研究旨在探討抑制AMPARs 的內(nèi)吞作用能否改善TBI 誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷和認(rèn)知障礙。本研究采用了合成肽Tat-GluA23Y干預(yù)AMPARs的內(nèi)吞過(guò)程，并評(píng)估其對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能及認(rèn)知能力的影響。通過(guò)進(jìn)一步研究AMPARs內(nèi)吞在TBI發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究希望為開(kāi)發(fā)新的有效治療策略提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

為排除激素的影響[18]，本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為雄性SD大鼠。它們來(lái)自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物房溫度為（23±2） ℃，濕度為40%～60%，光照時(shí)間為7：00至19：00，自由取食飲水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物管理方法均符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照重慶科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行，并得到了重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)：NoCHCMU-IACUC20220323015）。

1.2 TBI模型建立

本實(shí)驗(yàn)的TBI 是通過(guò)控制皮層沖擊（Rodent controlledcortical impact injury，CCI）模型誘導(dǎo)的[19-20]。具體方法如下：8周齡雄性SD大鼠被隨機(jī)分為4個(gè)組：Sham（僅開(kāi)放顱窗）組，saline（生理鹽水處理）組，scr-GluA23Y（對(duì)照肽scrambledTat-GluA23Y 處理）組和GluA23Y（實(shí)驗(yàn)肽Tat-GluA23Y 處理）組。首先將大鼠稱重后按照30 mg/kg的劑量使用3%的戊巴比妥那進(jìn)行麻醉，麻醉后以俯臥位固定在手術(shù)墊上，用剃須刀片剃除大鼠頭頂部毛發(fā)，暴露頭皮，用手術(shù)刀作頭頂皮膚正中切口，暴露顱骨、表面筋膜和軟組織。使用40%雙氧水緩慢輕柔地溶解掉顱骨表面軟組織。使用直徑0.4 cm鉆頭在顱左側(cè)以中線旁2.5 mm，前囟后1.5 mm為中心磨開(kāi)一直徑為5 mm的骨窗，同時(shí)保留硬腦膜。隨后，將大鼠固定在TBI建模裝置上，設(shè)置如下參數(shù)：沖擊深度3.5 mm，速度5 m/s，接觸時(shí)間500 ms。撞擊后，將大鼠從裝置中取出，用棉簽短暫壓迫止血，清理手術(shù)野，間斷縫合切口。對(duì)于Sham組，僅開(kāi)放顱窗而不進(jìn)行TBI操作。整個(gè)操作過(guò)程中盡量避免出血和對(duì)周?chē)M織的刺激。所有大鼠處理完畢后放置于加熱墊上待其自然蘇醒。

1.3 主要試劑

本實(shí)驗(yàn)的大多數(shù)試劑采購(gòu)于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich，中國(guó)）。AMPAR內(nèi)吞作用抑制劑Tat-GluA23Y多肽（位于AMPA GluA2亞基的羧基端區(qū)域序列號(hào)：YGRKKRRQRRR-869YKEGYNVYG877）和scrambled Tat-GluA23Y干擾肽（位于AMPA GluA2 亞基的羧基端區(qū)域序列號(hào)：YGRKKRRQRRR-869VYKYGGYNE877）由吉爾生物化學(xué)有限公司合成。小鼠抗psd-95的單克隆抗體（#MAB1598）來(lái)源于密力浦公司（Millipore，美國(guó)）?？笹luA1 多克隆抗體（#AB31232）和抗GluA2單克隆抗體（#AB133477）來(lái)自艾博抗貿(mào)易有限公司（Abcam，美國(guó)）。此外，抗β-actin（#A5441）多克隆抗體購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich）。Anti-Mouse IgG 二抗（HRP）和Anti-Rabbit IgG 二抗（HRP）標(biāo)記來(lái)自珀金埃爾默股份有限公司（Perkin Elmer）。BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒來(lái)自賽默飛世爾科學(xué)公司（ThermoFisher Scientific）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

TBI模型建立后1 h開(kāi)始對(duì)各分組給予不同藥物。Sham組無(wú)處理，saline組注射生理鹽水4 mL/kg，scr-GluA23Y組按照8 mg/kg的濃度注射對(duì)照肽，GluA23Y 組按照8 mg/kg濃度注射實(shí)驗(yàn)肽。此后每天同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行稱重和注射，連續(xù)14 d。

1.5 神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損的評(píng)估

在建立TBI 模型后的第1、3、5、7、14 天采用改良神經(jīng)功能評(píng)分（Mahmood’s method neurological severity score，mNSS）[21]及抓力實(shí)驗(yàn)評(píng)估創(chuàng)傷后大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)狀況同時(shí)為后續(xù)的新物體實(shí)驗(yàn)與水迷宮實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。mNSS是一種對(duì)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡的綜合測(cè)試，用于評(píng)估創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度，評(píng)分越高，損傷越嚴(yán)重[22]。進(jìn)行抓力實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放置在抓力板上，向后牽拉鼠尾，待動(dòng)物抓牢后，均勻用力向后拉，使動(dòng)物松爪。此時(shí)記錄儀會(huì)記錄下動(dòng)物的最大抓力。依次檢測(cè)左右抓力并記錄。每只大鼠測(cè)試5次以上，待抓力讀數(shù)穩(wěn)定在某一數(shù)值上下波動(dòng)時(shí)記錄5個(gè)讀數(shù)。

1.6 認(rèn)知能力評(píng)估

記憶是一種動(dòng)態(tài)的認(rèn)知過(guò)程，目前的研究將其分為工作記憶、情景記憶和語(yǔ)義記憶。工作記憶被定義為暫時(shí)性持有、處理和操縱信息的認(rèn)知能力[23]。關(guān)于情景記憶與語(yǔ)義記憶，這兩者實(shí)際上對(duì)時(shí)間的依賴性較低，更多的是與個(gè)體經(jīng)驗(yàn)相關(guān)的個(gè)人經(jīng)歷。情景記憶接收并存儲(chǔ)有關(guān)事件發(fā)生時(shí)間及日期的信息，以及這些事件之間的時(shí)空關(guān)系[24]。

1.6.1 新物體實(shí)驗(yàn) TBI模型建立后的第16天，采用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估大鼠的情景記憶能力。該實(shí)驗(yàn)根據(jù)動(dòng)物對(duì)熟悉物體和新物體的探索時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)評(píng)價(jià)被測(cè)試動(dòng)物的記憶能力。實(shí)驗(yàn)前24 h將大鼠放入40 cm×40 cm空箱使其適應(yīng)5 min。實(shí)驗(yàn)第1天往實(shí)驗(yàn)裝置底板的相鄰位置放入2個(gè)相同的物體A1和A2，物體距箱邊距離10 cm以上，放入大鼠觀察并記錄5 min內(nèi)大鼠對(duì)每個(gè)物體的探索時(shí)間（注意消毒去氣味）。間隔24 h后進(jìn)行測(cè)試，將物體A2換成另一個(gè)新奇物體（不同的物體B）。同樣觀察并記錄5 min后更換動(dòng)物，清潔箱體，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)人員采用雙盲法，記錄了大鼠頭部和物體接觸的情況。然后使用以下公式計(jì)算識(shí)別指數(shù)（recognition index，RI）：RI=（在新物體上花費(fèi)的次數(shù)或時(shí)間）（/ 在2 個(gè)物體上花費(fèi)的總次數(shù)或時(shí)間）。

1.6.2 水迷宮試驗(yàn) TBI模型建立后第17天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。該測(cè)試通常用于評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)和工作記憶能力[25]。水迷宮由水池、攝像頭及計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)（Stoelting，美國(guó)）組成。池壁周邊3處放置光源，用遮光簾隔開(kāi)外界，將水池分為SE、SW、NS、NW 4個(gè)象限，池壁上貼3個(gè)形狀不同的提示物。適應(yīng)時(shí)不放置平臺(tái)，將鼠頭朝壁輕輕放入水中，60 s后撈出并擦干放歸鼠籠。實(shí)驗(yàn)第1～5天為訓(xùn)練，每天在同一時(shí)間，第3象限固定平臺(tái)，將每只大鼠依次從不同的象限放入，讓其在60 s內(nèi)尋找平臺(tái)，如60 s后仍未找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)，后撈出擦干。每天進(jìn)行4次訓(xùn)練重復(fù)，每只大鼠訓(xùn)練間隔30 min以上。第6天進(jìn)行測(cè)試，移去平臺(tái)，將大鼠從第1 象限放入水中，記錄其在60 s 內(nèi)活動(dòng)情況。ANY maze系統(tǒng)（Stoelting，美國(guó)）自動(dòng)記錄并計(jì)算大鼠逃避潛伏期、學(xué)習(xí)期軌跡和實(shí)驗(yàn)期在第3象限呆的時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均以Sham組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。（注：池水用無(wú)毒墨水染黑，溫度21～22 ℃，水深為40 cm，平臺(tái)置于水下1 cm，水面不可見(jiàn)）。

1.7 突觸蛋白的分離

行為測(cè)試后，取大鼠海馬體組織樣本進(jìn)行Western blot分析。將損傷側(cè)海馬體加入含有蛋白酶抑制劑的Tris-HCl緩沖液中用勻漿器勻漿，直到EP管中無(wú)肉眼可見(jiàn)的塊狀腦組織（整個(gè)過(guò)程應(yīng)于碎冰上進(jìn)行操作）；充分裂解30 min后，離心15 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清液。隨后，使用先前記錄的方法將組織勻漿分離為亞細(xì)胞成分[26]。簡(jiǎn)言之，將海馬體勻漿在4 ℃下進(jìn)行一系列的離心步驟：首先，將它們?cè)?00 g轉(zhuǎn)速下離心2次，持續(xù)7 min，以消除細(xì)胞核和碎片，得到復(fù)合上清液；該復(fù)合上清液在100 000 g轉(zhuǎn)速下進(jìn)一步離心60 min。然后用含有0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的緩沖液處理得到的含酶勻漿，在4 ℃下孵育20 min后，用1 mol蔗糖分層，再以100 000 g轉(zhuǎn)速離心60 min。隨后，收集蔗糖層下富含突觸后致密物的沉淀，在含有1%甘氨酸電泳緩沖液（sodium dodecyl sulfate，SDS）中重懸，并在-80 ℃下保存?？偟鞍缀坎捎肂CA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。

1.8 Western blot

為了確保樣本的數(shù)量一致，總蛋白使用30 μg分析，突觸蛋白使用10 μg分析。用5倍裝載緩沖液在95 ℃下加熱5 min，使蛋白質(zhì)變性。變性后，樣品在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）上分離，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜（ISEQ00010，Milli?pore，美國(guó)）上。為了防止非特異性結(jié)合，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h。然后用特異性針對(duì)蛋白（如GluA1、GluA2、PSD95和β-actin）的一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。取出后將PVDF膜在室溫下于辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)（Horse?radish Peroxidase，HRP）的二抗中孵育1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)（Amersham ECL）檢測(cè)蛋白條帶，并使用Bio-Rad成像儀可視化印跡。使用Bio-Rad Quantity One軟件對(duì)代表原始數(shù)據(jù)的印跡條帶強(qiáng)度進(jìn)行量化。為了確定目標(biāo)蛋白的相對(duì)水平，將每個(gè)蛋白條帶的強(qiáng)度與適當(dāng)?shù)臉?biāo)記蛋白進(jìn)行歸一化處理（表示為其強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)標(biāo)記蛋白強(qiáng)度的百分比差）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究的所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行分析和處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，然后采用最小顯著差（least-significant difference，LSD）檢驗(yàn)。采用雙因素方差分析比較各組大鼠在Morris水迷宮試驗(yàn)中神經(jīng)功能、活動(dòng)力和空間學(xué)習(xí)能力的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 GluA23Y治療可減輕TBI引起的神經(jīng)功能損傷

本實(shí)驗(yàn)采用8周齡SD大鼠建立TBI模型，建立TBI模型后2周進(jìn)行行為測(cè)試，建立TBI模型23 d后提取海馬體和大腦皮層進(jìn)行進(jìn)一步研究（圖1A）。為了證實(shí)GluA23Y的治療效果，本研究首先分析了GluA23Y在神經(jīng)功能損傷中的作用。結(jié)果表明，在mNSS試驗(yàn)中（圖1B），saline組大鼠評(píng)分明顯高于Sham組（Sham組：n=16，Plt;0.001 vs. saline組）。在TBI后24 h，3個(gè)TBI組間無(wú)顯著性差異（scr-GluA23Y 組：n=14，P=0.377 vs. GluA23Y組；GluA23Y組：n=15，P=0.272 vs. saline組；saline組：n=14，P=0.997 vs. scr-GluA23Y組）。由于大鼠的自然恢復(fù)，所有組的mNSS評(píng)分都隨著時(shí)間的推移而下降。而在TBI3 d、5 d、7 d 和14 d，GluA23Y 組顯著低于saline 組（P=0.006、P=0.003、P=0.027、P=0.013 vs. saline 組）。在所有時(shí)間點(diǎn)scr-GluA23Y組與saline組無(wú)明顯差異。同時(shí)，在抓力實(shí)驗(yàn)中（圖1C），與其他組相比，sham組（n=16）的右前肢抓力表現(xiàn)最好（Plt;0.001）。與mNSS檢測(cè)結(jié)果相似，3個(gè)TBI組間術(shù)后24 h 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（scr-GluA23Y 組：n=14，P=0.882vs. GluA23Y 組；GluA23Y 組：n=15，P=0.347 vs. saline組；saline組：n=14，P=0.808 vs. scr-GluA23Y組）。然而，在TBI 3 d、5 d、7 d和14 d，GluA23Y 組（n=15）的右前肢抓力顯著高于saline組（P=0.012、Plt;0.001、Plt;0.0001、Plt;0.001 vs. saline 組）。在所有時(shí)間點(diǎn)，scr-GluA23Y組（n=14）與saline組（n=15）間沒(méi)有顯著差異。本研究結(jié)果表明，靶向AMPARs 的抑制劑GluA23Y可改善TBI大鼠的神經(jīng)功能。

2.2 GluA23Y減輕TBI引起的學(xué)習(xí)記憶功能損傷

接下來(lái)，本研究對(duì)各組大鼠進(jìn)行了行為學(xué)測(cè)試。首先，本研究利用新物體試驗(yàn)中的RI來(lái)評(píng)估TBI大鼠的記憶能力（圖2A）。本研究發(fā)現(xiàn)Sham 組的RI 次數(shù)（Sham 組：0.61±0.05，n=11；saline組：0.37±0.03，n=14；Plt;0.001；圖2B）及RI時(shí)間（Sham：0.60±0.03，n=11；saline組：0.39±0.03，n=14，Plt;0.001；圖2C）與saline組相比明顯降低。而GluA23Y 組中RI次數(shù)（scr-GluA23Y 組：0.37±0.06，n=14，Plt;0.01 vs. Sham 組；GluA23Y 組：0.60±0.02，n=12，P=0.988 vs. Sham 組，P=0.003vs. saline 組，P=0.003 vs. scr-GluA23Y 組；圖2B）及RI 時(shí)間（scr-GluA23Y 組：0.42±0.03，n=14，Plt;0.01 vs. Sham 組；GluA23Y 組：0.57±0.03，n=12，P=0.942 vs Sham 組，P=0.002vs. saline 組，P=0.011 vs. scr-GluA23Y 組；圖2C）與scr-GluA23Y 組相比顯著增加。這些結(jié)果表明，GluA23Y 可減輕TBI引起的大鼠認(rèn)知功能障礙。

在TBI后第16～22 天進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)。在訓(xùn)練期間，與Sham組相比，saline組出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)能力損傷（找到隱藏平臺(tái)時(shí)間：Sham 組：n=11，saline：n=8，Plt;0.001；圖2D）。然而，GluA23Y治療明顯改善了TBI引起的大鼠空間學(xué)習(xí)能力損傷（找到隱藏平臺(tái)時(shí)間：GluA23Y組：n=12，Plt;0.001vs. saline組；圖2D）。在空間探索實(shí)驗(yàn)中（圖6G），與Sham組相比，saline組在目標(biāo)象限的時(shí)間（Sham組：24.64±2.21，n=11，Plt;0.001，saline 組：11.98±2.12，n=8，Plt;0.001；圖2E）和穿越平臺(tái)次數(shù)（sham 組：2.55±0.62，n=11，saline 組：0.25±0.16，n=8，Plt;0.001；圖2F）均顯著減少；而GluA23Y 治療顯著增加了TBI大鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間（ scr-GluA23Y組：17.75±1.86，n=11，Plt;0.01 vs. Sham 組；GluA23Y 組：21.43±1.76，n=12，P=0.241 vs Sham組，Plt;0.01 vs. saline組，P=0.041 vs scr-GluA23Y 組；圖2E）與穿越平臺(tái)次數(shù)（scr-GluA23Y 組：0.27±0.19，n=11，Plt;0.001 vs. Sham組；GluA23Y組：1.50±0.38，n=12，P=0.068 vs. Sham 組，P=0.047 vs. saline 組，P=0.033 vs. scr-GluA23Y組；圖2F），這說(shuō)明了GluA23Y可改善TBI引起的空間學(xué)習(xí)能力和記憶提取能力損傷。

2.3 GluA23Y逆轉(zhuǎn)了TBI引起的大鼠海馬體中AMPAR的異常分布

本研究之前的研究表明，阻斷AMPARs的內(nèi)吞作用可以防止睡眠剝奪母鼠后代的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷[27]。此外，本研究之前也報(bào)道過(guò)GluA2依賴的AMPARs內(nèi)吞作用在學(xué)習(xí)和記憶中起著關(guān)鍵作用[13，28]。因此，本研究接下來(lái)研究了TBI是否確實(shí)能促進(jìn)含有GluA2的AMPARs的內(nèi)吞作用。本研究檢測(cè)了AMPARs的GluA1、GluA2亞基在總蛋白（n=6）和突觸蛋白（n=6）中的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)各組中GluA1和GluA2的總水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3A、B）。重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)TBI明顯選擇性地減少了GluA2，但對(duì)GluA1含量未產(chǎn)生明顯影響（圖3C），而使用GluA23Y 治療后（GluA23Y組：0.98±0.03，P=0.981 vs. Sham組，P=0.025 vs. saline組，P=0.025 vs scr-GluA23Y組；圖3D）能夠阻止這種改變。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)AMPARs內(nèi)吞在TBI后神經(jīng)功能障礙中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，抑制AMPARs的內(nèi)吞可以明顯改善因TBI而導(dǎo)致的大鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知障礙。

盡管近年來(lái)在創(chuàng)傷治療方法上取得了重大進(jìn)展，但TBI的治療仍然面臨嚴(yán)峻的臨床挑戰(zhàn)[29]。之前的研究顯示，多種AMPARs 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（NBQX、Perampanel 等）在局部和全腦缺血模型中都顯示出強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用[30]。然而，抑制AMPARs對(duì)TBI后神經(jīng)功能的影響尚不明確。事實(shí)上，本研究發(fā)現(xiàn)全身使用Tat-GluA23Y能改善急性期TBI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能（圖1），可能的機(jī)制包括減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增加抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性、減少氧化應(yīng)激以及改善神經(jīng)元的存活和功能[31-33]。這些機(jī)制共同作用，減輕TBI后的炎癥和氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，從而改善運(yùn)動(dòng)功能。并且既往研究顯示控制AMPARs內(nèi)吞在學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中具有重要意義[12-15，34]，使用Tat-GluA23Y 抑制AMPARs內(nèi)吞能增強(qiáng)大鼠的認(rèn)知功能[13，28]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抑制AMPARs內(nèi)吞，可以維持突觸上AMPARs 的數(shù)量，從而減輕由于含GluA2的AMPARs的內(nèi)吞作用增強(qiáng)所致的認(rèn)知障礙（圖2、3）。然而，由于在本研究所使用的中度TBI模型破壞了大腦結(jié)構(gòu)，所以本研究未檢測(cè)到其對(duì)突觸傳遞及其可塑性的影響。因此，本研究計(jì)劃未來(lái)采用體外模型來(lái)探討TBI對(duì)突觸傳遞的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證AMPARs 內(nèi)吞在此病理過(guò)程中的作用。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突觸GluA2亞基減少并未伴隨著其他AMPARs亞基的明顯變化。這可能是因?yàn)樵贏MPARs內(nèi)化后，部分GluA1同源AMPARs被插入突觸，以維持GluA1水平。因此，需在今后的研究中深入探討AMPARs亞基的動(dòng)態(tài)表達(dá)與轉(zhuǎn)運(yùn)，以闡明它們?cè)赥BI病理過(guò)程中的作用。

雖然本研究揭示了抑制AMPARs 內(nèi)吞對(duì)改善TBI導(dǎo)致的神經(jīng)損傷和認(rèn)知障礙的潛力，但迄今為止本研究主要關(guān)注Tat-GluA23Y對(duì)大鼠急性期損傷的作用。然而，由TBI所造成的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知障礙是一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，目前尚不清楚Tat-GluA23Y是否能顯著促進(jìn)TBI后期的神經(jīng)功能改善。因此，需要建立不同類型的TBI模型以檢驗(yàn)Tat-GluA23Y在TBI后期的療效。

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（責(zé)任編輯：周一青）