摘 要：【目的】研究適合不同李屬資源的FCM檢測(cè)體系，估測(cè)其基因組大小及倍性，為李屬資源的鑒定、分類及基因組和轉(zhuǎn)錄組等深入研究提供依據(jù)。

【方法】利用FCM對(duì)3種常用的細(xì)胞核裂解液進(jìn)行篩選與優(yōu)化，選取最適宜的裂解液鑒定3種李屬植物進(jìn)行基因組大小和檢測(cè)染色體倍性。

【結(jié)果】LB01、Marie’s和WPB 3種裂解液對(duì)櫻桃李檢測(cè)效果均較好，而WPB裂解液檢測(cè)效果最佳；Marie’s和LB01裂解液與歐洲李不匹配，改良的WPB裂解液最適合歐洲李；杏李與LB01裂解液不匹配，WPB裂解液對(duì)杏李的裂解效果好于Marie’s裂解液，而改良的WPB裂解液對(duì)杏李的裂解效果均最好。櫻桃李和杏李基因組大小范圍分別為491.22～566.40 Mb和514.46～573.83 Mb，歐洲李資源平均基因組大小為1 678.37 Mb。

【結(jié)論】櫻桃李和杏李資源均為二倍體，歐洲李資源全部為六倍體，李屬植物每個(gè)種內(nèi)不同品種之間的基因組大小存在一定差異。

關(guān)鍵詞：李；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）；染色體倍性；基因組大小

中圖分類號(hào)：S188"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號(hào)：1001-4330（2024）07-1673-09

0 引 言

【研究意義】李屬（Prunus）植物在世界上約有19～40個(gè)種，其中包括一些中間雜交種［1］，原產(chǎn)自中國(guó)和引種至中國(guó)栽培多年的主要有9個(gè)種和3個(gè)變種，其中歐洲李（P.domesitica L.）、櫻桃李（P.cerasifera Ehrh.）和杏李（P.simonii Carr.）是新疆主要栽培種。歐洲李系列優(yōu)良品種在新疆廣泛栽培，截至2021年栽培面積達(dá)4.25×104 hm2［2］。目前，新疆杏李主要分布在阿克蘇地區(qū)，櫻桃李主要分布在伊犁哈薩克自治州，其果實(shí)多用于加工果醬。新疆李資源種類較多，不同種類在形態(tài)特征和生物學(xué)特性等具有豐富的多樣性，同一種內(nèi)的不同品種在部分性狀上表現(xiàn)差異顯著。因此，鑒定李屬不同植物基因組大小和染色體倍性，對(duì)李屬植物進(jìn)化、分類及構(gòu)建高通量測(cè)序文庫等基因組相關(guān)的研究提供基礎(chǔ)資料有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】測(cè)定植物基因組大小的常用方法有孚爾根微顯影法［3］、流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry， FCM）［4］和高通量測(cè)序法［5］，植物染色體倍性鑒定多采用染色體觀察法和形態(tài)觀察法。FCM可以檢測(cè)植物染色體倍性和基因組大小，且檢測(cè)成本低而效率高，其主要通過檢測(cè)懸浮在液體流中單細(xì)胞標(biāo)記的熒光信號(hào)，可以快速而準(zhǔn)確的獲取植物基因組大小和染色體倍性，通常以變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）值來評(píng)判細(xì)胞核裂解效果。目前，該技術(shù)已在多種果樹中得到了廣泛應(yīng)用［6，7］。Ben等［8］檢測(cè)了45份野生型和栽培型中國(guó)李的基因組大小，并以建立的李的分類地位研究其遺傳變異。孫琪［9］通過染色體核型分析明確了供試的30株歐洲李均為六倍體。楊麗等［10］利用FCM對(duì)2份歐洲李和3份杏李資源進(jìn)行了檢測(cè)，確定了其DNA相對(duì)含量和染色體倍性。【本研究切入點(diǎn)】有文獻(xiàn)研究顯示，雖然對(duì)中國(guó)李和部分歐洲李、杏李品種進(jìn)行了鑒定，但關(guān)于利用FCM鑒定新疆櫻桃李、歐洲李和杏李資源的檢測(cè)體系仍不完整，其基因組大小和倍性相關(guān)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫也不完備。需建立李屬植物的FCM檢測(cè)體系。【擬解決的關(guān)鍵問題】建立李屬植物的FCM檢測(cè)體系，并鑒定42份櫻桃李、歐洲李和杏李資源的基因組大小和染色體倍性，為李屬資源的鑒定、分類及基因組和轉(zhuǎn)錄組等深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的42份李屬種質(zhì)資源采自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺(tái)果樹資源圃（84°22′E、41°78′Ｎ，海拔906 m），樹齡8～10年生，株行距2 m×4 m，水肥管理良好，園相整齊，植株生長(zhǎng)健壯。于2023年6月剪取新梢?guī)Щ貙?shí)驗(yàn)室水培，摘取幼嫩葉片用于流式細(xì)胞試驗(yàn)，外標(biāo)選用已完成基因組測(cè)序的二倍體碭山梨，其基因組大小為527 Mb［6］。表1

1.2 方 法

1.2.1 裂解液及DNA熒光染料的配制

配置好的裂解液用0.22 μm濾膜的真空泵進(jìn)行抽濾，并置于4℃條件下保存。PI染液配制參照田新民等［11］的配制方法，在PI染液中加入500 μg/mL RNA酶，排除雙鏈RNA對(duì)檢測(cè)核DNA含量時(shí)的干擾，并選用非特異性標(biāo)記碘化丙啶（PI）作熒光探針。表2

1.2.2 細(xì)胞核懸浮液的制備及上機(jī)檢測(cè)

參照?，摤摰龋?］制備細(xì)胞懸浮液流程，稱取0.1 g幼嫩葉片，依次用蒸餾水、去離子水沖洗2～3遍，擦干水，去除葉片主脈后置于預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，加入2.0 mL預(yù)冷的裂解液，在冰浴條件下用刀片垂直向下快速切碎，4℃冷藏條件下放置2 min后，使用500目濾膜一次性過濾至1.5 mL的離心管中， 4℃冷藏條件下孵育5 min。在4℃條件下，1 000 r/min離心5 min。棄上清液至0.1 mL刻度處，分別加入200 μL預(yù)冷裂解液和預(yù)冷PI染液，輕輕混勻后置于4℃黑暗條件下染色10 min。最后將染色的細(xì)胞核懸浮液移至流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)，Accuri C6）上樣處，設(shè)置參數(shù)為低流速、FL2熒光通道、收集5 000個(gè)細(xì)胞核顆粒后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.3 細(xì)胞核裂解液的優(yōu)化

選取3種常用的細(xì)胞核裂解液分別對(duì)櫻桃李、歐洲李和杏李資源進(jìn)行裂解，比對(duì)裂解效果，對(duì)WPB裂解液進(jìn)行優(yōu)化。參考趙孟良等［15］方法，即在配WPB裂解液過程中，加入2%的PVP-10藥劑，其它步驟不變。

1.2.4 基因組大小及倍性計(jì)算

利用參照樣本和待測(cè)樣本G0/G1峰的熒光強(qiáng)度值，計(jì)算基因組大小和染色體倍性。絕對(duì)核DNA含量通常pg為單位，基因組大小多用bp為單位，二者轉(zhuǎn)換關(guān)系為1pgDNA=0.978×103Mp［16］。待測(cè)樣本基因組大小和染色體倍性的計(jì)算方法［17］。

待測(cè)樣基因組大小=參照樣本基因組大小×（待測(cè)樣本G0/G1峰平均熒光強(qiáng)度/參照樣本G0/G1峰平均熒光強(qiáng)度）。

待測(cè)樣本倍性值（DI）=待測(cè)樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度/二倍體參照材料熒光強(qiáng)度。

若DI接近1時(shí)，為二倍體；當(dāng)DI接近2時(shí)，為四倍體；當(dāng)DI接近3時(shí)，為六倍體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Cytometer software workspace軟件收集基因組大小和倍性的數(shù)據(jù)，并用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃李裂解液的篩選

研究表明，LB01、Marie’s和WPB三種裂解液對(duì)櫻桃李制備的樣本主峰窄，收集的粒子數(shù)量多而速度快，整體效果較好，但LB01和Marie’s裂解液所制備的樣本普遍存在主峰左側(cè)帶有較少背景碎片的現(xiàn)象，LB01制備樣品的背景碎片整體多于Marie’s，WPB裂解液相對(duì)而言制備櫻桃李樣品的效果最好。圖1

2.2 "歐洲李裂解液的篩選及優(yōu)化

研究表明，LB01和Marie’s裂解液制備的歐洲李樣品懸浮液均呈現(xiàn)單側(cè)峰，即碎片峰，LB01產(chǎn)生的主峰不明顯，而Marie’s產(chǎn)生的主峰值較低，LB01的裂解效果較Marie’s差，上述裂解液與歐洲李材料不匹配。WPB裂解液制備的歐洲李樣品懸浮液雖然呈現(xiàn)單側(cè)峰，但其主峰窄而峰值較高，CV值多在5%以內(nèi)。改良的WPB對(duì)大多數(shù)歐洲李樣品的懸浮液并未產(chǎn)生單側(cè)峰，僅在主峰左側(cè)呈現(xiàn)較少背景碎片，裂解過程中收集的粒子速度快而數(shù)量多，裂解效果最好。圖2

2.3 杏李裂解液的篩選及優(yōu)化

研究表明，LB01裂解液制備的杏李樣品懸浮液產(chǎn)生的信號(hào)峰均為單側(cè)峰，主峰不明顯，裂解效果差，該裂解液不適合杏李材料。Marie’s和WPB制備的懸浮液產(chǎn)生的主峰效果較好，CV值均在5%范圍內(nèi)，但二者制備的懸浮液中摻雜有較少雜質(zhì)，并且Marie’s收集的粒子數(shù)量較少。改良的WPB裂解液制備的懸浮液出峰效果最好，收集的粒子數(shù)量多而速度快，可以檢測(cè)出絕大多數(shù)杏李品種的基因組大小和倍性關(guān)系。圖3

2.4 不同李屬植物的基因組大小和倍性的檢測(cè)

研究表明，42份李屬種質(zhì)資源平均峰值的CV值均低于5%，結(jié)果可信；19份櫻桃李資源的基因組大小為491.22～566.40 Mb，熒光通導(dǎo)值與參照樣本的比值為0.93～1.08，全部為二倍體；17份歐洲李資源的基因組大小為1 616.50～1 737.97 Mb，熒光通導(dǎo)值與參照樣本的比值為3.07～3.30，均為六倍體；6份杏李資源的基因組大小為514.46～573.83 Mb，熒光通導(dǎo)值與參照樣本的比值為0.97～1.09，全部為二倍體。櫻桃李、歐洲李和杏李每個(gè)種內(nèi)不同品種之間的基因組大小存在一定差異，其中吉?dú)W2紅櫻桃李和吉?dú)W58早熟紅櫻桃李在櫻桃李資源中差異最顯著，歐洲李資源中極早熟1號(hào)、MY-O2013-2分別與總統(tǒng)差異最顯著，杏李中風(fēng)味皇后和味厚差異最顯著。表3

3 討 論

3.1

植物幼嫩葉片相比于植物的根尖［18］、花粉［19］、成熟葉片［20］等材料，幼嫩葉片的檢測(cè)效果最好。研究選用3種李屬資源植物的幼嫩葉片進(jìn)行了檢測(cè)，其變異系數(shù)CV值均低于5%，符合木本植物CV值的合格范圍［21］，檢測(cè)效果較好。此外，過多的葉片用量由于自身天然熒光物（葉綠素）的影響也可造成試驗(yàn)結(jié)果誤差［22］。

3.2

王利虎等［22］對(duì)6種常用裂解液的主要配方及所適用于不同植物的范圍進(jìn)行了歸納整理，認(rèn)為WPB裂解液為歐洲李的最佳解離液［23］。研究發(fā)現(xiàn)，WPB、LB01和Marie’s 3種不同裂解液對(duì)櫻桃李大部分樣本的裂解效果均較好，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)同一種裂解液可能也適用于多種不同的植物，此類現(xiàn)象與王利虎等［22］歸納整理的結(jié)果相一致，而WPB裂解液對(duì)櫻桃李的裂解效果更好。Marie’s和LB01 2種裂解液與歐洲李不匹配，而WPB裂解液在解離歐洲李樣品時(shí)主峰效果較好，但單側(cè)峰較大；LB01裂解液與之不匹配，WPB裂解液對(duì)杏李的裂解效果好于Marie’s裂解液。改良的WPB裂解液對(duì)歐洲李和杏李的裂解效果均最好，因?yàn)闅W洲李、杏李幼嫩葉片中富含酚類和多糖等粘性物質(zhì)，而增加PVP的含量對(duì)消除酚類和多糖等物質(zhì)起到了較好的作用。趙孟良等［15］對(duì)比添加PVP含量對(duì)菊芋的檢測(cè)效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)增加PVP的用量后對(duì)3種不同電壓下的菊芋雜峰均減少。此外，李雯雯等［20］研究發(fā)現(xiàn)，單一的裂解液種類對(duì)新疆野杏的解離效果較差，改良的MgSO4-LB01混合裂解液最適合新疆野杏，是否混合裂解液在歐洲李和杏李等李屬植物中也同等適用，有待進(jìn)一步研究。

3.3

FCM的鑒定效率高于染色體計(jì)數(shù)法［24-26］。試驗(yàn)研究利用FCM檢測(cè)結(jié)果表明，19份櫻桃李資源均為二倍體，與前人研究結(jié)果一致［27］，17份歐洲李資源均為六倍體，6份杏李資源均為二倍體，與吳麗萍等［28］研究結(jié)果一致，但研究的歐洲李資源的基因組大小與吳麗萍等［28］研究結(jié)果存在一定差異，原因是與歐洲李不同品種間的差異有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，同一品種的基因組大小存在一定差異，此類現(xiàn)象張俊環(huán)等［29］也有過報(bào)道，其原因主要與所選擇的儀器設(shè)備、外標(biāo)植物和測(cè)定方法等不同有關(guān)［28］。

4 結(jié) 論

歐洲李和杏李最適宜的解離液為改良的WPB裂解液；利用FCM鑒定的櫻桃李和杏李資源均為二倍體，其基因組大小范圍分別為491.22～566.40 Mb和514.46～573.83 Mb，而歐洲李資源全部為六倍體，平均基因組大小為1 678.37 Mb。鑒定3種李屬資源基因組大小和染色體倍性。

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Identification of genome size and chromosomal ploidy of

three prunus species by flow cytometry

WANG Yatong1， GUO Jingjing1， YANG Fenfen1， NIU Yingying1， ZHANG Shikui2，

FAN Guoquan2， WANG Shangdong2， GENG Wenjuan1

（1. College of Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China; 2. Luntai Fruit Tree Germplasm Resource Nursery， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Luntai Xinjiang 841600， China）

Abstract：【Objective】 To explore FCM detection system suitable for different Prunus resources， estimate their genome size and ploidy， and provide basis for the identification， classification， genome and transcriptome of Prunus resources.

【Methods】" Three commonly used nuclear lysates were screened and optimized by FCM， and the most suitable lysates were selected to detect the genome size and chromosome ploidy of three plum plants.

【Results】 LB01， Marie's and WPB lysates were all effective in the detection of P.simonii Carr.， and WPB lysates was the best. The two lysates Marie's and LB01 did not match with P.domestica L.， and the improved WPB lysate was the most suitable for P.simonii Carr. and LB01 lysate did not match， WPB lysate had better cracking effect on P.simonii Carr. than Marie's lysate， and the improved WPB lysate had the best cracking effect on P.simonii Carr. The two lysates Marie's and LB01 did not match with P.domestica L.， and the improved WPB lysate was the most suitable for P.domestica L.. The P.simonii Carr. and LB01 lysate did not match， WPB lysate had better cracking effect on P.simonii Carr. .than Marie's lysate， and the improved WPB lysate had the best cracking effect on P.simonii Carr. With genome sizes ranging from 491.22 to 566.40 Mb and 514.46 to 573.83" Mb， respectively， with an average genome size of 1，678.37 Mb.

【Conclusion】" The identified germplasm resources of P.cerasifera Ehrh. and P.simonii Carr. were all diploid， while the P.domestica L. germplasm resources were all hexaploid， the genome size of different varieties in each species of Prunus genus is different.

Key words：plum; flow cytometry（FCM）; chromosomal ploidy; genome size

Fund project：Basic Scientific Research Project for Colleges and Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region （XJEDU2022Z005）

Correspondence author：GENG Wenjuan （1983-）， female， from Altay， Xinjiang，Ph. D.， professor， research direction： fruit germplasm resources and cultivation physiology， （E-mail） gwj0526@163.com

收稿日期（Received）：

2024-01-13

基金項(xiàng)目：

新疆維吾爾自治區(qū)高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（XJEDU2022Z005）

作者簡(jiǎn)介：

王亞銅（1993-），男，寧夏隆德人，博士研究生，研究方向?yàn)楣麡浞N質(zhì)資源與分子育種，（E-mail）wyt012129@163.com

通訊作者：

耿文娟（1983-），女，新疆阿勒泰人，教授，博士，碩士生/博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣麡浞N質(zhì)資源與栽培生理，（E-mail）gwj0526@163.com