摘要：本研究旨在從不同來源的樣本中分離出對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）具有降解作用的芽孢桿菌，為降解AFB1的芽孢桿菌開發(fā)利用提供理論依據(jù)。采集雞的腸道、肛拭子和土壤樣本，富集后利用MYP固體培養(yǎng)基和初篩培養(yǎng)基篩選出疑似芽孢桿菌的菌落，通過分析細(xì)菌對(duì)AFB1的降解率復(fù)篩，選出對(duì)AFB1具有降解作用的菌株，通過16S rRNA測(cè)序鑒定細(xì)菌種屬，然后對(duì)篩選出的芽孢桿菌的溶血性、抗生素敏感性、生長(zhǎng)曲線、耐酸和耐膽鹽性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，共篩選出20株對(duì)AFB1具有降解作用的芽孢桿菌。結(jié)合細(xì)菌測(cè)序和溶血試驗(yàn)結(jié)果，選擇3株降解率高的地衣芽孢桿菌（S51、S48、S8-2）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，3株芽孢桿菌對(duì)多種抗生素較敏感，其中S51的生長(zhǎng)速度最快，菌液濃度最大，對(duì)酸和膽鹽的耐受性均強(qiáng)于另外兩株菌。本研究篩選出1株對(duì)AFB1有較好降解作用的地衣芽孢桿菌，具有良好的安全性和耐受性，有望作為微生態(tài)制劑應(yīng)用到AFB1降解過程中。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；降解；芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）12-0105-08

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是由多種黃曲霉和寄生曲霉通過聚酮途徑產(chǎn)生的二呋喃香豆素衍生物，目前已經(jīng)分離鑒定出的AF有20多種，其中以AFB1分布最廣、毒性最強(qiáng)。AFB1的代謝物具有急性毒性、致畸性、致突變性和致癌性。動(dòng)物食入AFB1后，毒素會(huì)在體內(nèi)蓄積造成急性或慢性中毒，影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，損傷生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。AF還存在于中毒動(dòng)物的肉蛋奶中，嚴(yán)重威脅食品安全。近幾年，隨著畜禽飼養(yǎng)數(shù)量的不斷增加，飼料消耗量也隨之增多，飼料在存儲(chǔ)運(yùn)輸過程中極易發(fā)生發(fā)霉變質(zhì)等情況。

目前AF的解毒方法有三種：物理降解、化學(xué)降解、微生物降解。其中微生物是通過將霉菌毒素結(jié)合到其表面降解或轉(zhuǎn)化為毒性較小的代謝物來起作用，相較于物理和化學(xué)方法，具有安全、高效、綠色且對(duì)動(dòng)物存在益生作用等優(yōu)點(diǎn)。芽孢桿菌因具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、良好的抗逆性以及具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力等益生作用，在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中被廣泛應(yīng)用。Liu等給1日齡肉雞連續(xù)灌服凝結(jié)芽孢桿菌42天，發(fā)現(xiàn)其可以通過改善腸道菌群、促進(jìn)肉雞腸上皮細(xì)胞再生和增強(qiáng)先天免疫力來保護(hù)腸黏膜屏障；Jia等研究發(fā)現(xiàn)，給食用黃曲霉毒素污染飼料的蛋雞連續(xù)飼喂枯草桿菌降解產(chǎn)物4周，可以明顯改善蛋雞的采食量、產(chǎn)蛋量等生產(chǎn)性能；Li等研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠灌喂解淀粉芽孢桿菌28天能夠緩解AFB1對(duì)小鼠肝臟的損傷?；谝陨涎芯?，本試驗(yàn)旨在從不同來源的樣品中分離具有良好安全性和耐受性的AFB1降解菌，以期為芽孢桿菌降解AFB1的研究和微生物解毒制劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品來源 從濟(jì)南市某市場(chǎng)采集不同日齡健康雞的盲腸內(nèi)容物和肛拭子樣本共20份：從濟(jì)南華山湖采集土壤樣品10份。

1.1.2主要試劑 初篩培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 5.0g，KH2PO4 2.5 g，MgSO4 1.0 g，Na2HPO4·12H2O0.5 g，CaCl2 0.1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1L，pH值7，121℃滅菌15 min，加入過濾除菌的香豆素溶液至1 g/L。LB培養(yǎng)基、MYP培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。血平板培養(yǎng)基，購自環(huán)凱微生物科技有限公司。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，購自FERMENTEK。AFB1ELISA試劑盒，購自南京博研生物科技有限公司。DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司。慶大霉素、青霉素及四環(huán)素等12種藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。香豆素，購自Macklin。豬膽鹽，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2降解菌株的篩選

1.2.1初篩 將采集到的腸道和土壤樣本置于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24 h，將富集后的菌液用無菌水梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，劃線培養(yǎng)于MYP固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)24 h，重復(fù)操作2次。純化后的細(xì)菌染色后進(jìn)行形態(tài)特征觀察，選取疑似芽孢桿菌的菌株繼續(xù)劃線培養(yǎng)于含有香豆素的初篩培養(yǎng)基，選擇在初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的細(xì)菌菌液與60％的甘油1：1混合，-80℃凍存。

1.2.2復(fù)篩 挑取單個(gè)菌落接種在5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。將菌液按照5％的比例接種在50 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，37℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取980 uL發(fā)酵液與20 uL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（5 ug/mL）混合，使AFB1的最終濃度為100ng/mL，37℃、150 r/min避光孵育72 h。以不接種菌液的LB培養(yǎng)基加人20 uL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品作為空白對(duì)照。孵育結(jié)束，4 000 r/min低溫離心5min，吸取上清液，使用AFB1 ELISA試劑盒檢測(cè)菌液上清中AFB1的含量。每個(gè)菌株重復(fù)3次。AFB1降解率（％）=（對(duì)照組AFB，含量-細(xì)菌組AFB1含量）／對(duì)照組AFB1含量×100。

1.3菌株16S rRNA基因序列鑒定

利用DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物（27F/1492R）對(duì)分離菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 uL）；DNA模版1 uL，引物27F、1492R各0.4 uL，2x Taq PCR StarMix 10 uL，ddH2O 8.2 uL。PCR反應(yīng)條件；94℃預(yù)變性2min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送往深圳華大基因股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果輸入BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4菌株特性分析

1.4.1溶血試驗(yàn) 挑取單菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、170 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液劃線于血平板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)溶血環(huán)。

1.4.2藥敏試驗(yàn) 首先在LB平板上挑取芽孢桿菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用無菌水調(diào)整為麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液。用無菌棉棒蘸取菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂平板，室溫放置5 min。用無菌鑷子將藥敏紙片貼在涂布有菌液的MH瓊脂平板上并做好標(biāo)記，37℃培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抗生素敏感性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表1）判定結(jié)果。

1.4.3細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 將細(xì)菌按照5％接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，每12 h用酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液在波長(zhǎng)630 nm處的吸光度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.4.4細(xì)菌耐受性試驗(yàn) 耐酸試驗(yàn)：將0.5 mL分離菌懸液分別接種于pH值為1.0、2.0、3.0、4.0的4.5 mL無菌LB液體培養(yǎng)基中，37℃處理3h。以酸處理Oh的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照。取100 uL菌液10倍稀釋后，選3個(gè)稀釋度平板計(jì)數(shù)。37℃恒溫培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)活菌數(shù)量，按照公式計(jì)算存活率。存活率（％）=酸處理3 h的活菌數(shù)（cfu/mL）/酸處理Oh的活菌數(shù)（cfu/mL）x100。

耐膽鹽試驗(yàn)：挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基并置于搖床中37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。將0.5 mL菌懸液分別接種于4.5 mL含0.1％、0.2％、0.3％膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min培養(yǎng)3h。以膽鹽處理Oh的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。取菌液適度稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。存活率（％）=膽鹽處理3h的活菌數(shù)（cfu/mL）/膽鹽處理Oh的活菌數(shù)（cfu/mL）×100。

1.5S51菌株降解特性

取10 mL菌株S51發(fā)酵液，4℃、10 000r/min離心10 min，分離獲得上清液和菌體。菌體用無菌蒸餾水洗滌、離心，重復(fù)3次后加入10 mL無菌蒸餾水制備成S51菌懸液。按上述方法制備10 mL菌懸液，隨后低溫超聲破碎20 min，無菌過濾制備胞內(nèi)液。將S51上清液、菌懸液、胞內(nèi)液分別加入AFB1，37℃孵育72 h后，檢測(cè)各組AFB1降解率。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel匯總后進(jìn)行初步整理，利用GraphPad Prism 6.02進(jìn)行One-wayANOVA分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1降解菌株的篩選

2.1.1初篩 利用MYP培養(yǎng)基共分離出73株細(xì)菌，通過形態(tài)特征觀察，篩選出菌落呈乳白色、邊緣不規(guī)則、顯微鏡下菌體呈藍(lán)紫色桿狀的革蘭氏陽性菌（圖1），初步判斷有27株為芽孢桿菌。因香豆素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與AFB1相似，繼續(xù)篩選在含有香豆素的初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的細(xì)菌，選出20株可能對(duì)AFB1具有降解作用的細(xì)菌。

2.1.2復(fù)篩 將篩選的菌株與AFB1共培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)菌對(duì)AFB，的降解率。結(jié)果（圖2）顯示，降解率在50％以上的有4株，分別為菌株S51、S48、S8-2、S45，對(duì)AFB，的降解率分別為61.03％、58.80％、53.18％、52.58％。

2.2菌株16S rRNA基因序列鑒定

經(jīng)BLAST比對(duì)，這20株菌均為芽孢桿菌，其中地衣芽胞桿菌有10株，枯草芽孢桿菌有2株，蠟樣芽孢桿菌有3株，貝萊斯芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、假真菌樣芽孢桿菌各1株（表2）。

2.3菌株特性

2.3.1菌株溶血性 如圖3所示，20株芽孢桿菌中，T1-1、D23-2、N2-6-2、D23-2和Z5-1的菌落周圍存在溶血環(huán)，有溶血現(xiàn)象。結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)特征、對(duì)AFB1的降解率、16S rRNA基因序列分析以及溶血試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇S51、S48和S8-2這3株地衣芽孢桿菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2菌株藥敏試驗(yàn) 由表3可知，3株地衣芽孢桿菌均對(duì)慶大霉素、多西環(huán)素、萬古霉素和環(huán)丙沙星敏感，對(duì)青霉素G、阿奇霉素和克林霉素耐藥，對(duì)利福平中度敏感。其中菌株S48對(duì)8種藥物敏感，對(duì)1種藥物中度敏感：菌株S51對(duì)5種藥物敏感，對(duì)4種藥物中度敏感：菌株S8-2對(duì)4種藥物敏感，對(duì)5種藥物中度敏感。

2.3.3菌株生長(zhǎng)曲線 由圖4可知，S51、S48、S8-2這3株地衣芽孢桿菌均在培養(yǎng)24 h達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，其中菌株S51生長(zhǎng)速度最快：在前12 h菌株S48的生長(zhǎng)速度高于S8-2；在24 h之后菌株S8-2的生長(zhǎng)速度高于S48。持續(xù)監(jiān)測(cè)72 h，3株地衣芽孢桿菌的濃度均能維持在穩(wěn)定水平。

2.3.4細(xì)菌耐受性 3株芽孢桿菌對(duì)不同酸度的耐受性見圖5。3株芽孢桿菌的存活率隨著pH值的升高而提升，其中S51菌株對(duì)不同酸性溶液的耐受性明顯高于另外兩株芽孢桿菌，其在pH值1.0條件下的存活率為26.06％，在pH值4.0條件下的存活率為64.12％。

3株芽孢桿菌對(duì)不同濃度膽鹽溶液的耐受性見圖6。膽鹽對(duì)3株芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用，并隨著膽鹽終濃度的升高細(xì)菌的存活率降低。S48對(duì)膽鹽的耐受性最低，在0.1％和0.3％的膽鹽濃度下存活率分別為32.05％和22.26％。在0.1％的膽鹽濃度下S51的耐受性最高，為51.54％；在0.2％的膽鹽濃度下S8-2的耐受性較高，為46.22％。

2.4S51菌株降解特性

比較菌株S51上清液、菌懸液、胞內(nèi)液對(duì)AFB1的降解特性，發(fā)現(xiàn)上清液的降解能力最強(qiáng)，達(dá)61.03％，菌懸液和胞內(nèi)液的降解效果相對(duì)較弱，降解率分別為10.17％和7.15％（圖7）。表明菌株S51對(duì)AFB1的脫毒能力主要來源于上清液中的某種活性物質(zhì)，而非吸附作用。

3討論與結(jié)論

動(dòng)物飼料大量堆積容易出現(xiàn)發(fā)霉變質(zhì)現(xiàn)象，如何對(duì)飼料中的黃曲霉毒素進(jìn)行解毒成為問題關(guān)鍵。利用微生物降解黃曲霉毒素是近些年研究較多的一種解毒方法，目前已發(fā)現(xiàn)的降解菌有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、假單胞菌和黑曲霉等。芽孢桿菌可以分泌多種酶類和蛋白，通過降解和吸附的方式將AFB1轉(zhuǎn)化為低毒的或無毒的化合物達(dá)到解毒效果。本研究采集土壤以及雞的腸道和肛拭子樣本，經(jīng)過富集、MYP培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢以及含香豆素的培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)分離菌進(jìn)行初篩，選出20株可能對(duì)AFB1具有降解作用的細(xì)菌，經(jīng)與AFB1共培養(yǎng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)4株芽孢桿菌（S51、S48、S8-2、S45）對(duì)AFB1的降解率在50％以上，通過16S rRNA測(cè)序鑒定均為地衣芽孢桿菌。王康從發(fā)霉的谷物中分離出2株枯草芽孢桿菌，對(duì)AFB1的降解率分別為70.65％和61.42％。細(xì)菌對(duì)AFB1的降解率與AFB1濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等條件有關(guān)。Wang等從土壤中分離出1株地衣芽孢桿菌，120 h內(nèi)對(duì)AFB1的降解率為89.1％。程思忠等分離出一株能夠降解AFB1的貝萊斯芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其主要通過上清液中的胞外酶發(fā)揮解毒作用。王明清等篩選出一株AFB1降解菌，其各組分中上清液的降解率最高可達(dá)91.7％。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究表明菌株S51降解AFB1的活性組分主要存在于胞外上清液中，該結(jié)果可為后續(xù)分析S51菌株降解AFB，的活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

安全性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)細(xì)菌能否應(yīng)用到動(dòng)物體內(nèi)的關(guān)鍵。細(xì)菌的溶血性是篩選菌株的先決條件，溶血陽性細(xì)菌通常被認(rèn)為存在安全風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)對(duì)宿主的健康產(chǎn)生威脅。通過溶血試驗(yàn)對(duì)篩選出的20株芽孢桿菌進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，其中T1-1、D23-2、N2-6-2、D23-2和25-1這5株細(xì)菌菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，表明存在溶血現(xiàn)象。結(jié)合細(xì)菌的復(fù)篩結(jié)果和菌種測(cè)序結(jié)果，最終選取3株菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，分別是S51、S48、S8-2。益生菌對(duì)抗生素的敏感性也是評(píng)價(jià)細(xì)菌安全性的重要指標(biāo)之一。細(xì)菌對(duì)抗生索的耐藥性既可以是特定物種所固有的，也可以通過基因突變或水平基因轉(zhuǎn)移獲得。攜帶耐藥基因較少的菌株進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，其耐藥基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)隨之減少。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示3株菌均對(duì)慶大霉素、多西環(huán)素、萬古霉素和環(huán)丙沙星敏感，對(duì)青霉索G、阿奇霉素和克林霉素耐藥，對(duì)利福平中度敏感。這與地衣芽孢桿菌對(duì)克林霉素的耐藥性是固有特性且與其耐藥基因有關(guān)的報(bào)道相一致。

對(duì)S51、S48、S8-2這3株地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)性能的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，在24 h內(nèi)均能達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，其中S51菌株生長(zhǎng)最快，細(xì)菌濃度最大；連續(xù)培養(yǎng)72 h，S51的細(xì)菌數(shù)量略有下降，菌株S48和S8-2的細(xì)菌數(shù)量略有升高，但3株細(xì)菌的數(shù)量均能夠維持在穩(wěn)定水平，暗示芽孢桿菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后可以持續(xù)發(fā)揮降解作用。

能夠在胃和小腸的惡劣環(huán)境中生存是益生菌所需的特性之一。益生菌進(jìn)入機(jī)體后，首先會(huì)在胃內(nèi)停留3h，動(dòng)物胃腸道的pH值為1.5-4.0，經(jīng)過胃酸的消化后益生菌進(jìn)入小腸，由膽鹽形成的高滲透環(huán)境會(huì)改變細(xì)胞外膜的通透性從而起到殺菌作用，膽鹽濃度為0.03％-0.30％。對(duì)酸和膽鹽的耐受能力直接影響益生菌能否在動(dòng)物體內(nèi)存活。通過對(duì)3株地衣芽孢桿菌進(jìn)行耐受性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使pH值為1.0的強(qiáng)酸情況下，3株菌仍能保持一定的活性，其中菌株S51的存活率能達(dá)到20％以上，在pH值4.0的情況下S51的存活率可以達(dá)到60％以上，表明其對(duì)酸的耐受性較強(qiáng)，能夠通過胃酸消化。這與張昊等的研究結(jié)果一致。耐膽鹽的試驗(yàn)結(jié)果顯示，芽孢桿菌S51對(duì)膽鹽的耐受性最強(qiáng)，在0.1％的膽鹽濃度下存活率可達(dá)50％以上。這些結(jié)果表明地衣芽孢桿菌S51對(duì)酸和膽鹽的耐受性強(qiáng)于另外2株菌，有作為益生菌添加劑的潛力。

本研究從土壤及雞的腸道和肛拭子樣本中分離出20株對(duì)AFB1具有降解作用的芽孢桿菌，其中有4株地衣芽孢桿菌對(duì)AFB1的降解率在50％以上。從中篩選出一株對(duì)AFB1降解率較高的地衣芽孢桿菌S51，其具有良好的生長(zhǎng)性能，無溶血現(xiàn)象，耐酸、耐膽鹽，耐藥性較差，有望作為微生物添加劑用于降低飼料中AFB1的含量。后續(xù)仍需開展動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)S51在動(dòng)物體內(nèi)的安全性和解毒效果。