亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾及其化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

        2024-12-23 00:00:00郭雅娟張亞萍高巍
        現(xiàn)代鹽化工 2024年4期
        關(guān)鍵詞:硫化氫

        摘要:自硫化氫作為氣體信號(hào)分子被發(fā)現(xiàn)以來,其在生物體內(nèi)作用機(jī)制的研究取得快速進(jìn)展,并已被證實(shí)可通過介導(dǎo)S-巰基化修飾從而調(diào)控蛋白質(zhì)功能與活性。但因S-巰基化修飾具有高度動(dòng)態(tài)性及復(fù)雜性,如何高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)并量化這一修飾過程,已成為影響該領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵?;诖耍ㄟ^對(duì)現(xiàn)有化學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述,分析馬來酰亞胺法、改良生物素轉(zhuǎn)換法以及標(biāo)記轉(zhuǎn)換法等技術(shù),旨在為硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾的深入研究提供技術(shù)支持,以推動(dòng)該領(lǐng)域發(fā)展。

        關(guān)鍵詞:硫化氫;S-巰基化修飾;化學(xué)檢測(cè)

        硫化氫作為氣體信號(hào)分子,近年來在生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,參與調(diào)節(jié)多種生理及病理過程,通過介導(dǎo)S-巰基化修飾來影響蛋白質(zhì)功能及活性。S-巰基化修飾可對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響,并在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、氧化還原調(diào)控等方面充分發(fā)揮作用。隨著研究的深入,硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾已成為生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題,為此,需深入探討其化學(xué)檢測(cè)技術(shù),以期為研究提供支撐[1]。

        1S-巰基化修飾

        1.1S-巰基化修飾研究現(xiàn)狀

        在人類蛋白質(zhì)組中,已有數(shù)百種蛋白質(zhì)被鑒定出具有S-巰基化修飾位點(diǎn),蛋白質(zhì)涉及多種生物過程,如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控、氧化還原反應(yīng)等。且針對(duì)S-巰基化修飾的化學(xué)檢測(cè)技術(shù)也得到快速發(fā)展。例如,基于質(zhì)譜技術(shù)的S-巰基化修飾檢測(cè)方法已取得明顯成就,并廣泛應(yīng)用于各種生物樣本中S-巰基化修飾位點(diǎn)鑒定。新型熒光探針及生物素標(biāo)記技術(shù)也被開發(fā)出來,用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及定量分析S-巰基化修飾水平。此外,研究人員通過質(zhì)譜技術(shù)對(duì)S-巰基化修飾位點(diǎn)進(jìn)行鑒定,并測(cè)定位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)修飾水平[2]。

        1.2S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾之間的關(guān)系

        在蛋白質(zhì)修飾領(lǐng)域,S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾均顯示出對(duì)蛋白質(zhì)功能的重要影響,且此兩種修飾在某些蛋白質(zhì)上共存,可相互調(diào)節(jié)。例如,在一種關(guān)鍵代謝酶中,當(dāng)S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾同時(shí)發(fā)生時(shí),酶的活性會(huì)受到一定影響。在某種程度上,當(dāng)S-巰基化修飾水平升高時(shí),S-亞硝基化修飾水平會(huì)相應(yīng)降低,反之亦然。這種相互調(diào)節(jié)的機(jī)制與兩種修飾在生物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。當(dāng)心肌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí),S-巰基化修飾水平呈上升趨勢(shì),而S-亞硝基化修飾水平呈下降趨勢(shì)。這表明在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下,S-巰基化修飾可起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷作用,而S-亞硝基化修飾會(huì)受到抑制[3]。

        2S-巰基化修飾的化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

        2.1馬來酰亞胺法

        馬來酰亞胺法由約翰霍普金斯大學(xué)的Snyder教授及其團(tuán)隊(duì)于2012年提出,是一種高度靈敏技術(shù),專門用于檢測(cè)蛋白質(zhì)中的S-巰基化修飾。這種方法基于特定的化學(xué)原理來標(biāo)記和檢測(cè)靶蛋白中半胱氨酸(Cys)上的S-巰基(—SH),觀察其在硫化氫(H2S)作用下形成S-巰基化產(chǎn)物(—SSH)的過程。在實(shí)驗(yàn)中,使用Alexa Fluor 680標(biāo)記的C2N-乙酰馬來酰亞胺熒光探針來特異性地標(biāo)記靶蛋白中經(jīng)過H2S修飾的Cys上的—SH基團(tuán)。這種熒光探針可與—SH形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵,從而允許通過熒光信號(hào)來追蹤被修飾蛋白質(zhì)。通過添加二硫蘇糖醇(DTT)這一還原劑,可破壞由H2S形成的二硫鍵(—SSH),導(dǎo)致原本與熒光探針結(jié)合的—SH基團(tuán)從蛋白質(zhì)上脫落。

        由于—SH的脫落,熒光探針與蛋白質(zhì)的結(jié)合減弱,導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱。通過凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離,并使用轉(zhuǎn)印或點(diǎn)印跡法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用凝膠成像儀檢測(cè)PVDF膜上的紅色熒光條帶,觀察熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化。如果熒光信號(hào)減弱,可判斷H2S對(duì)靶蛋白進(jìn)行S-巰基化修飾。這種方法的靈敏性及特異性使其成為研究蛋白質(zhì)S-巰基化修飾的主要工具,為深入了解H2S在生物體中的生理功能及作用機(jī)制提供有效支撐。在針對(duì)S-巰基化修飾研究中,研究人員采用馬來酰亞胺法對(duì)蛋白質(zhì)中S-巰基化水平進(jìn)行檢測(cè),使用含有馬來酰亞胺基團(tuán)的熒光探針與細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)[4]。

        2.2改良生物素轉(zhuǎn)換法

        利用烷化劑S-甲基甲硫代磺酸鹽(MMTS)來封閉蛋白質(zhì)中未被S-巰基化修飾的半胱氨酸(Cys)上的巰基(—SH)。MMTS通過與相關(guān)未修飾巰基發(fā)生反應(yīng),以便保證其不會(huì)被標(biāo)記步驟所干擾,利用丙酮去除多余的MMTS,使用生物素HPDP來特異性地標(biāo)記經(jīng)過S-巰基化修飾的Cys殘基上的—SSH基團(tuán)。生物素HPDP可選擇性地與—SSH結(jié)合,為識(shí)別檢測(cè)提供基礎(chǔ)。通過利用生物素與鏈霉親和素之間的高親和力,將生物素標(biāo)記S-巰基化蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中富集出來,對(duì)檢測(cè)靈敏度及特異性產(chǎn)生影響。

        MMTS被發(fā)現(xiàn)可與未修飾的—SH反應(yīng),也可與—SSH發(fā)生反應(yīng),在一定程度上將會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。有研究表明,MMTS與—SSH的反應(yīng)速度較快,將MMTS與生成產(chǎn)物的游離—SH反應(yīng),從而間接地封閉未修飾巰基,而S-巰基化修飾蛋白質(zhì)可通過生物素HPDP進(jìn)行標(biāo)記。因蛋白質(zhì)中S-巰基化水平較高,將引發(fā)較高假陽性率。因此,在使用該方法時(shí),可結(jié)合質(zhì)譜法,以提高分析的可靠性及準(zhǔn)確性,此外,通過利用基因敲除或抑制特定酶,可對(duì)S-巰基化水平產(chǎn)生影響,從而進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的可靠性驗(yàn)證。

        2.3標(biāo)記轉(zhuǎn)換法

        由于S-巰基化形成二硫鍵(—SSH)相較于蛋白質(zhì)中其他二硫鍵具有更強(qiáng)親核性,使用巰基封閉劑——甲基磺?;讲⑧邕颍∕SBT)或其水溶性類似物MSBT-A來封閉蛋白質(zhì)中未修飾的巰基(—SH)以及部分S-巰基化修飾的巰基(—SSH)。利用MSBT或MSBT-A封閉所有自由巰基(—SH和—SSH),確保其不再參加其他化學(xué)反應(yīng)。隨即引入一個(gè)特殊設(shè)計(jì)標(biāo)記轉(zhuǎn)換試劑——生物素化氰基乙酸甲酯衍生物。這個(gè)試劑兼具親核性和生物素報(bào)告分子,可選擇性地與封閉劑S-巰基化修飾二硫鍵(—SSH)發(fā)生反應(yīng),與未修飾巰基(—SH)結(jié)合。經(jīng)過標(biāo)記蛋白質(zhì)通過鏈霉親及素磁珠與生物素發(fā)生特異性結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)S-巰基化修飾蛋白質(zhì)富集。利用Western印跡技術(shù)對(duì)富集蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,對(duì)S-巰基化水平進(jìn)行定量評(píng)估。

        3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作注意事項(xiàng)

        3.1細(xì)胞和組織樣品的制備

        實(shí)驗(yàn)采用HeLa細(xì)胞系,細(xì)胞在含有胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),繼續(xù)進(jìn)行操作。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞,離心收集細(xì)胞沉淀,重復(fù)洗滌細(xì)胞3次,以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和胰蛋白酶殘留。還應(yīng)使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)收集細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),使每次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量保持一致。在本次實(shí)驗(yàn)中,共收集到約1×106個(gè)細(xì)胞。選取小鼠肝臟組織作為實(shí)驗(yàn)材料。在無菌條件下迅速剝離肝臟,并放入預(yù)冷的PBS中清洗。在此基礎(chǔ)上,使用無菌剪刀將肝臟組織剪成約1 mm3的小塊,以便于處理與消化。將剪碎組織放入含有蛋白酶K的消化液中,在37 ℃水浴中消化2 h。消化過程中,每30 min振蕩一次,以確保組織充分消化,還應(yīng)使用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾消化后的組織懸液,去除未消化的組織碎片。

        3.2檢測(cè)過程中的質(zhì)量控制

        在進(jìn)行蛋白質(zhì)S-巰基化修飾的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,采取嚴(yán)格質(zhì)量控制措施,選擇經(jīng)過驗(yàn)證、具有高靈敏度和特異性的檢測(cè)方法,以便對(duì)蛋白質(zhì)中S-巰基化修飾水平進(jìn)行識(shí)別。在樣品制備階段,對(duì)每一步操作進(jìn)行精確控制,保證樣品的完整性及代表性。例如在細(xì)胞樣品制備中,確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致,細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行收集,收集到的細(xì)胞數(shù)量精確至1×106個(gè)。對(duì)于組織樣品,選取同一部位、大小相近的組織塊進(jìn)行消化處理,最終收集到細(xì)胞數(shù)量約為5×105個(gè)。在檢測(cè)過程中,采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)監(jiān)控的方法,定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為監(jiān)控樣品,與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

        3.3數(shù)據(jù)解讀與分析

        硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾通過改變蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象和活性,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。S-巰基化修飾水平可通過檢測(cè)蛋白質(zhì)中特定半胱氨酸殘基的硫巰基化修飾程度來評(píng)估。S-巰基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響,可通過比較修飾前后蛋白質(zhì)的生化活性來判斷。還需要關(guān)注S-巰基化修飾與其他蛋白質(zhì)翻譯后修飾相互作用,以及硫化氫水平對(duì)S-巰基化修飾的影響。在化學(xué)檢測(cè)技術(shù)方面,馬來酰亞胺法原理是利用馬來酰亞胺與硫巰基之間的特異性反應(yīng)來檢測(cè)S-巰基化修飾。

        改良生物素轉(zhuǎn)換法通過引入生物素標(biāo)記來提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。標(biāo)記轉(zhuǎn)換法是一種新興檢測(cè)方法,通過引入標(biāo)記分子來追蹤硫巰基化修飾的過程,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗整理,去除異常值及重復(fù)值。運(yùn)用描述性統(tǒng)計(jì)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析,了解數(shù)據(jù)分布及特征,比較不同組別之間的差異、分析硫化氫水平對(duì)S-巰基化修飾的影響等,使用可視化工具將數(shù)據(jù)以圖表或圖形的形式展示出來,便于直觀理解數(shù)據(jù)之間的關(guān)系及變化趨勢(shì)。

        4結(jié)論

        硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾在生物學(xué)領(lǐng)域中,通過精細(xì)調(diào)控蛋白質(zhì)功能與活性,對(duì)眾多生命過程產(chǎn)生影響?;瘜W(xué)檢測(cè)技術(shù)作為研究S-巰基化修飾主要方法,如馬來酰亞胺法、改良生物素轉(zhuǎn)換法以及標(biāo)記轉(zhuǎn)換法等,為研究提供修飾機(jī)制窗口。隨著技術(shù)不斷進(jìn)步,未來會(huì)有更多高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法投入應(yīng)用,以推動(dòng)S-巰基化修飾的深入研究。

        參考文獻(xiàn):

        [1]張珍,全心雨,唐志書.硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾及其化學(xué)檢測(cè)技術(shù)[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2024,40(1):4453.

        [2]唐福臨.H2S介導(dǎo)的S-巰基化修飾對(duì)擬南芥剪接相關(guān)蛋白的功能調(diào)節(jié)[D].太原:山西大學(xué),2023.

        [3]劉翠霞.H2S介導(dǎo)CKX2蛋白S-硫巰基化修飾調(diào)控?cái)M南芥根系發(fā)育[D].咸陽:西北農(nóng)林科技大學(xué),2022.

        [4]丁雪婷.H2S介導(dǎo)的S-硫巰基化修飾調(diào)節(jié)擬南芥MPK10活性的機(jī)制研究[D].咸陽:西北農(nóng)林科技大學(xué),2022.

        猜你喜歡
        硫化氫
        渤海某油田外輸天然氣硫化氫成因及治理研究
        綜掘工作面硫化氫抽取-凈化一體化治理技術(shù)
        瀝青中硫化氫脫除工藝研究
        石油瀝青(2021年5期)2021-12-02 03:21:12
        硫化氫下鈰錳改性TiO2的煤氣脫汞和再生研究
        能源工程(2021年1期)2021-04-13 02:05:54
        川東南二——三疊系氣藏硫化氫成因探討
        干法測(cè)定電石中硫化氫含量的探討
        關(guān)于氯氣與硫化氫水溶液反應(yīng)的初步探究
        新課程研究(2016年4期)2016-12-01 05:55:05
        高硫化氫原油在石油產(chǎn)業(yè)鏈中的安全風(fēng)險(xiǎn)探討
        硫化氫脫除鎳鉆溶液中鋅雜質(zhì)研究
        過氧化物與硫黃共硫化氫化丁腈橡膠的性能研究
        人妻无码aⅴ中文系列久久免费| 人妻少妇看A偷人无码电影| 中文岛国精品亚洲一区| 国产乱人伦AⅤ在线麻豆A| 少妇久久高潮不断免费视频| 国产三级不卡一区不卡二区在线| 免费a级毛片高清在钱| 精品国产麻豆免费人成网站| 狠狠色噜噜狠狠狠狠7777米奇| 高清无码一区二区在线观看吞精| 一区二区三区放荡人妻| 亚洲一区二区三区毛片| 真实夫妻露脸自拍视频在线播放 | 风流熟女一区二区三区| 国产午夜手机精彩视频| 亚洲av区无码字幕中文色| 一区二区无码精油按摩| 中文字幕一区二区在线看| 浓毛老太交欧美老妇热爱乱| 一本久道综合在线无码人妻| 亚洲乱码中文字幕综合| 亚洲VA不卡一区| 精品中文字幕手机在线| 成人麻豆视频免费观看| 日本黄网站三级三级三级| 国产色诱视频在线观看| 国产一区二区丁香婷婷| 美女视频一区二区三区在线 | 成人免费在线亚洲视频| 久久久久成人片免费观看蜜芽| 国产中老年妇女精品| 91日本在线精品高清观看| 人妻经典中文字幕av| 精品香蕉一区二区三区| 综合无码一区二区三区| 精精国产xxxx视频在线播放器| 久久亚洲一区二区三区四区五| 极品人妻被黑人中出种子| 欧美最猛黑人xxxx黑人表情| 乱人伦人妻中文字幕不卡| 四虎影永久在线观看精品|