摘要 研究羅丹明B熒光示蹤劑在大豆、玉米、煙草幼苗上的傳導(dǎo)能力。結(jié)果表明經(jīng)水培處理的植株幼苗地上部均能檢測到羅丹明B，其中大豆幼苗真葉部含量較高，玉米幼苗葉鞘中含量高于葉，煙草幼苗莖中含量高于葉。經(jīng)羅丹明B處理后的植株鮮重與未處理之間無顯著差異。同時以煙草幼苗作為模式作物，借助活體成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)葉片和莖分別經(jīng)質(zhì)量濃度為15 mg/L和30 mg/L羅丹明B處理后的熒光強度最高。

關(guān)鍵詞 羅丹明B；植物傳導(dǎo)；活體熒光成像

中圖分類號 S 45 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）23-0140-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.029

Study on the Conductivity of Rhodamine B in Three Plants

WEI Hong， LI Meng， WANG Zhen et al

（College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agriculture University， Hohhot， Inner Mongolia 010019）

Abstract In this work， the Rhodamine B was selected as fluorescent tracer to investigate its conductivity on soybean， maize and tobacco seedlings. The results suggested that Rhodamine B could be detected in the aboveground parts of hydroponic treated plant seedlings， therein， soybean seedlings had the highest content in part of true leaves， the leaf sheath of maize seedlings had a higher content compared with leaves， and tobacco seedlings had a higher content in the stem than leaves. There was no significant difference in fresh weight between Rhodamine B treated plants and untreated plants. And choosing tobacco seedlings as the model crop， the fluorescence intensity was dedected by in vivo imaging system. The results showed that the fluorescence intensity was the highest in leaves and stems with treat concentrations of 15 mg/L and 30 mg/L， respectively.

Key words Rhodamine B;Plant transmission;In vivo fluorescence imaging

基金項目 內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2022MS03030）；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)青年教師科研能力提升專項（BR220130）；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院中青年教師科研能力提升專項（BR230101）。

作者簡介 魏宏（1998—），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：資源利用與植物保護。

*通信作者：王振，講師，博士，從事綠色農(nóng)藥制劑研發(fā)；趙明敏，教授，博士，從事植物病毒學(xué)研究。

收稿日期 2024-02-12；修回日期 2024-03-19

雜草通過與作物競爭陽光、水分、空氣、營養(yǎng)物質(zhì)等資源的方式，極大地影響了作物的生長，如何減輕雜草危害是當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的重要問題。精準的除草技術(shù)，可以減少化學(xué)藥劑使用［1］，符合綠色植保的發(fā)展需求，有利于我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

快速準確識別雜草，是農(nóng)田雜草精確管理的基礎(chǔ)。隨著計算機技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)以及視覺技術(shù)的發(fā)展，快速精準的機器視覺技術(shù)在雜草識別上的應(yīng)用越來越廣泛，該技術(shù)顯著提高了除草機械的作業(yè)能力，為精準除草提供了技術(shù)保證［2］?；跈C器視覺技術(shù)的雜草識別技術(shù)是通過深度學(xué)習(xí)以及構(gòu)建作物和雜草顏色、紋理、形態(tài)等特征數(shù)據(jù)庫的方式，實現(xiàn)雜草有效識別［3-4］。該技術(shù)在傳統(tǒng)圖像處理的基礎(chǔ)上，通過結(jié)合 MATLAB 圖像處理技術(shù)［5］、視覺注意模型［6］、圖像處理多算法融合［7］以及高度特征與單目圖像特征融合的 SVM 識別模型［8］等方式極大地提高了識別雜草的能力。

然而在實際應(yīng)用中，自然環(huán)境變化會影響圖像采集質(zhì)量；部分雜草與作物形態(tài)相似，加大了自動識別的難度；并且雜草的形態(tài)特征隨生長周期變化較大，增加了機器學(xué)習(xí)的工作量，不利于實踐操作；此外，一些識別模式對硬件資源要求較高［9］，難以推廣應(yīng)用。

作物植株信號技術(shù)是一種本質(zhì)為熒光示蹤技術(shù)的新型機器-植物互作技術(shù)，該技術(shù)通過對標記熒光示蹤劑的作物進行靶向識別，從而區(qū)分作物與雜草［10-11］。與基于計算機學(xué)習(xí)算法的視覺技術(shù)相比，作物植株信號技術(shù)具有操作簡便、識別準確的優(yōu)點。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新型熒光標記物質(zhì)被不斷發(fā)現(xiàn)，各種先進熒光檢測技術(shù)和儀器被發(fā)明應(yīng)用，熒光標記技術(shù)作為一種非放射性的標記技術(shù)開始受到重視和發(fā)展并在生物學(xué)、工業(yè)［12］、醫(yī)藥研究［13］、環(huán)境勘探［14］等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

示蹤劑的熒光特性及其在作物體內(nèi)的傳導(dǎo)能力是影響熒光示蹤效果的關(guān)鍵因素［13］。羅丹明染料是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸染料，其中，羅丹明B（Rh-B）因其光穩(wěn)定性強、熒光產(chǎn)量高、波長范圍寬、pH敏感性低、細胞膜滲透性良好以及對細胞無毒副作用等優(yōu)點，常被用作植物活體細胞熒光示蹤劑［15-16］。

該試驗選取Rh-B作為示蹤劑，研究大豆、玉米和煙草根系對其吸收及其在作物內(nèi)向上傳導(dǎo)能力，以期開發(fā)一種新型精準識別雜草的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品和儀器。乙腈（色譜純）購于默克公司；甲酸（色譜純，≥98%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Rh-B標準品（HPLC 級，＞99%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；霍格蘭氏營養(yǎng)液購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

高效液相色譜儀（安捷倫1260 Infinity II）；立體式熒光顯微鏡（LEICA M205 FA）；植物活體成像系統(tǒng)（IVScope 7200）。

1.1.2 供試作物和基質(zhì)。

大豆（合豐55）由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院合江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供；玉米（先玉335）購于鐵嶺先鋒種子研究有限公司；本氏煙為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒實驗室自留；基質(zhì)購自內(nèi)蒙古蒙肥生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 作物幼苗培養(yǎng)。在直徑 15 cm的花盆中加入基質(zhì)播種大豆、玉米和煙草，并分別培養(yǎng)至大豆真葉完全舒展、玉米第1片葉與葉鞘垂直、煙草八葉期。

向霍格蘭氏營養(yǎng)液中加入Rh-B，配制成質(zhì)量濃度為60 mg/L的水培溶液，將上述作物根部洗凈后放入含200 mL水培溶液的塑料杯中，以等量不含Rh-B的霍格蘭氏營養(yǎng)液作為對照，將所有植株放置在25 ℃，光照/黑暗16 h/8 h 條件下培養(yǎng)4 d，每個處理重復(fù)4次。

1.2.2 Rh-B在作物上的熒光檢測。將“1.2.1”中培養(yǎng)4 d后的大豆幼苗分為三葉、真葉、上胚軸、子葉、下胚軸、根6個部位，玉米分為根、葉鞘和葉3個部位，煙草分為根、莖、葉3個部位，利用立體式熒光顯微鏡 RFP 模塊（激發(fā)波長541～551 nm，檢測波長590 nm）檢測上述部位。

1.2.3 Rh-B在作物不同部位的含量測定。

1.2.3.1 樣品處理。分別稱取按“1.2.1”方法處理的大豆幼苗三葉、真葉、上胚軸、子葉、下胚軸、根各0.5 g，玉米幼苗根、葉鞘和葉各0.5 g，煙草幼苗根、莖、葉各0.1 g，研磨后加入4 mL乙腈，超聲提取40 min，浸提1 d后濃縮至1 mL，利用高效液相色譜儀測定Rh-B在大豆、玉米和煙草不同部位的含量，按照文獻［16-17］的方法計算根濃度因子（RCF）和轉(zhuǎn)運因子（TF）。

色譜條件：色譜柱為 Shim-pack GIST C18-AQ（5 μm，250 mm×4.6 mm），柱溫35 ℃，流動相為乙腈∶0.1%甲酸水溶液=80∶20（V/V），流速T0ADHVzge/gaIokt1ovawQ==1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長560 nm。

1.2.3.2 標準溶液配制及標準曲線的繪制。準確稱取Rh-B 5.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度500 mg/L Rh-B標準品溶液，隨后用乙腈逐級稀釋成0.411 5～300.000 0 mg/L的系列標準溶液，在“1.2.3.1”中的色譜條件下測定各標準溶液的吸收峰面積，繪制標準曲線。

1.2.3.3

添加回收率試驗。在大豆、玉米、煙草各部位空白樣品中分別添加質(zhì)量濃度為100.000 0、33.333 3、11.111 1 mg/L Rh-B標準溶液，每組重復(fù)3次，按“1.2.3.1”方法進行樣品前處理及分析，計算添加回收率及相對標準偏差。

1.2.4 Rh-B對大豆、玉米、煙草生長的影響。稱量“1.2.1”處理的大豆幼苗三葉、真葉、上胚軸、子葉、下胚軸、根，玉米幼苗根、葉鞘和葉，煙草根、莖、葉各部位的鮮重，研究該質(zhì)量濃度Rh-B對這3種作物生長的影響。

1.2.5

Rh-B在煙草地上部的活體熒光成像研究。取煙草八葉期幼苗，洗凈后分別放入含 3.75、7.50、15.00、30.00、60.00 mg/L Rh-B的霍格蘭氏營養(yǎng)液中，以等量不含Rh-B的霍格蘭氏營養(yǎng)液為對照。上述幼苗在25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)4 d后，清洗植株表面，利用活體成像系統(tǒng)檢測Rh-B在煙草幼苗地上部的熒光強度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理。利用SPSS 20.0（α=0.05）進行單因素方差分析，利用Origin 2022進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析方法驗證

根據(jù)“1.2.3.2”所繪標準曲線表明Rh-B質(zhì)量濃度在0.411 5～300.000 0 mg/L與對應(yīng)響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系（圖1），線性方程為y=1.062 5x-1.596 2，其線性方程決定系數(shù)（R2）為 0.999 6。平均回收率在 81%～109%，相對標準偏差為 0.28%，表明該方法符合分析要求。

2.2 Rh-B在植株不同部位的熒光檢測

2.2.1

Rh-B在大豆幼苗不同部位的分布。通過高效液相色譜法測定大豆幼苗中Rh-B含量，其分布比例如圖2A所示，Rh-B在根部含量最高，其次是真葉、下胚軸、上胚軸、子葉、三葉。通過立體式熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，霍格蘭氏營養(yǎng)液對照處理組中的大豆植株各部位未檢測出熒光，經(jīng)Rh-B處理的大豆幼苗各部位均呈現(xiàn)熒光且上胚軸和下胚軸熒光呈現(xiàn)清晰，同時，三葉和真葉葉脈中熒光強度較高，真葉較為明顯，子葉內(nèi)呈現(xiàn)熒光不明顯（圖3）。

2.2.2 Rh-B在玉米幼苗不同部位的分布。

玉米幼苗中的Rh-B含量分布如圖2B所示，Rh-B主要分布在根部，葉鞘、葉中含量較少，且玉米葉鞘含量略高于玉米葉。由圖4可知，經(jīng)霍格蘭氏營養(yǎng)液處理后的玉米幼苗葉、葉鞘，在立體式熒光顯微鏡RFP檢測條件下均未出現(xiàn)熒光，經(jīng)Rh-B處理的玉米幼苗葉鞘和葉均能檢測到熒光，但葉熒光較弱，該結(jié)果與其含量測定趨勢一致。

2.2.3 Rh-B在煙草幼苗不同部位的分布。

通過液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)Rh-B在煙草幼苗根部分布較多，剩余依次分布于莖、葉（圖2C）。與對照處理的煙草幼苗未呈現(xiàn)熒光不同，經(jīng)Rh-B處理的煙草葉、莖均呈現(xiàn)明顯熒光，且莖熒光強于葉，此外，其中葉熒光主要集中在葉脈處（圖5），這與液相色譜檢測結(jié)果一致。

2.3 Rh-B在3種作物中的傳導(dǎo)

2.3.1 作物根系對Rh-B的吸收能力。

RCF為根濃度因子，RCF>1表示此化合物易被根部吸收。計算得到大豆、玉米、煙草的RCF值分別為6.664 0、4.328 4、1.165 0，說明Rh-B易被這3種作物根系吸收，其中大豆根系吸收Rh-B能力最強，煙草最弱。

2.3.2 Rh-B在作物中的傳導(dǎo)能力。

TF為轉(zhuǎn)運因子，TF>1表示該化合物易從根部向上傳導(dǎo)。計算得出大豆、玉米、煙草的TF值分別為0.032 0、0.008 3、0.171 9，說明Rh-B在這3種植物中的向上傳導(dǎo)能力較弱。相對而言，Rh-B在煙草幼苗中向上傳導(dǎo)能力強于大豆和玉米，在雙子葉植物煙草、大豆中的向上傳導(dǎo)能力優(yōu)于單子葉植物玉米。

2.4 Rh-B對作物幼苗生長的影響

由圖6可知，經(jīng)質(zhì)量濃

度為60.00 mg/L Rh-B處理4 d后，大豆、玉米、煙草幼苗各部位

的鮮重與對照均無顯著差異，表明該濃度下Rh-B對大豆、

玉米、煙草植株的生長無明顯影響。

2.5 Rh-B在煙草中的活體成像

2.5.1 活體熒光成像系統(tǒng)檢測。

在植物活體熒光成像系統(tǒng)中觀察煙草植株，經(jīng)霍格蘭氏營養(yǎng)液為對照處理的煙草未呈現(xiàn)熒光，經(jīng) Rh-B 處理的煙草呈現(xiàn)熒光。煙草整株的熒光成像結(jié)果表明，Rh-B 主要分布在莖部和根部（圖7A），尤其是根莖結(jié)合部。將處理植株分割后進行檢測，根部上端熒光響應(yīng)強度較高，莖部下端熒光響應(yīng)強度較高，表明根系吸收 Rh-B 后，有向上轉(zhuǎn)移的趨勢，另外葉片的熒光主要呈現(xiàn)在葉柄處，且葉片背面熒光響應(yīng)值高于葉片正面（圖7B）。

以莖部熒光強度值為1，其余部位與莖部熒光強度值比值為縱坐標作圖（圖8），數(shù)據(jù)顯示經(jīng) Rh-B 處理的煙草植株在地上部的熒光強度值高于地下部。

2.5.2 不同濃度Rh-B 在煙草幼苗中的活體成像研究。

如圖9所示，經(jīng)質(zhì)量濃度為3.75 mg/L的 Rh-B 處理后的煙草葉片背面（圖9A）和正面（圖9B）在該熒光閾值下均無熒光響應(yīng)，而當 Rh-B 質(zhì)量濃度在 7.50～60.00 mg/L 時，葉片正面和背面的熒光強度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中，當 Rh-B 質(zhì)量濃度為 15.00 mg/L 時熒光強度值達到最高（圖9D）。煙草莖在質(zhì)量濃度為3.75～60.00 mg/L時存在熒光響應(yīng)（圖9C），在質(zhì)量濃度為3.75～30.00 mg/L時，熒光強度值隨濃度升高而升高，當質(zhì)量濃度達30.00 mg/L時達到最大，之后有所下降（圖9D）。

3 結(jié)論與討論

該試驗結(jié)果表明Rh-B在水培條件下可以被大豆、玉米和煙草根部吸收，并通過木質(zhì)部向上傳導(dǎo)，同時，Rh-B在雙子葉的大豆、煙草中向上傳導(dǎo)能力優(yōu)于單子葉的玉米。通過借助植物活體熒光成像系統(tǒng)檢測在經(jīng)不同質(zhì)量濃度Rh-B處理后的煙草幼苗地上部熒光強度值發(fā)現(xiàn)，煙草幼苗地上部經(jīng)質(zhì)量濃度為15～30 mg/L的 Rh-B 處理后熒光強度值較高。

目前已有研究表明豆類可以吸收Rh-B并傳導(dǎo)到地上部［18］，因此可以通過進一步研究Rh-B對處理作物種子的方式或其在作物地上部之間的傳導(dǎo)機理，實現(xiàn)精準區(qū)分作物與雜草的目標，為農(nóng)田智慧除草提供新思路。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光標記技術(shù)被應(yīng)用于越來越多的領(lǐng)域［18，13］。熒光標記技術(shù)與作物信號傳導(dǎo)技術(shù)［19］、自動除草機器［20］結(jié)合，有望開發(fā)出一種新型自動化除草技術(shù)對作物和雜草進行精確識別，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雜草精確管理方面具有潛在應(yīng)用價值。

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