摘" " 要：為實(shí)現(xiàn)環(huán)境污染物的生物治理與資源化利用，以花生連作田土壤中的甲咪唑煙酸降解細(xì)菌為研究對(duì)象，采用水解圈法和降解能力測(cè)定進(jìn)行篩選，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明：本研究共篩選出8株甲咪唑煙酸降解細(xì)菌，分別為大山芽孢桿菌（Bacillus gaemokensis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、同溫層芽孢桿菌（Bacillus stratosphericus）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）、側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）和惡臭假單胞（Pseudomomas puida）。其中，芽孢桿菌屬占了7株，為所篩選的甲咪唑煙酸降解菌中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。大山芽孢桿菌的降解能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到88.23%。綜上，這些菌株為研究微生物降解甲咪唑煙酸提供了菌種資源，為未來(lái)開發(fā)甲咪唑煙酸微生物降解制劑和修復(fù)土壤提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甲咪唑煙酸；降解細(xì)菌；芽孢桿菌屬；篩選；鑒定

中圖分類號(hào)：TQ450.2" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " "DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.11.008

Screening and Identification of Imazapic Degrading Bacteria

TANG Lin1， WANG Ziyan1， CHEN Xuedong1， LIU Jiayi1

（1. Luoyang Normal University，College of Life Science， Luoyang， Henan 471934， China）

Abstract：To achieve the biological treatment and resource utilization of environmental pollutants， the imazapic degrading bacteria from peanut continuous cropping soil were selected by hydrolytic circle method and degradation ability measurement. The strains were identified in terms of morphology， physiological and biochemical characteristics and molecular biology. The results showed that 8 imazapic degrading strains were selected， which were identified as Bacillu gaemokensis， Bacillus thuringiensis， Bacillus cereus， Bacillus stratosphericus， Bacillus methylotrophic， Brevibacillus laterosporus and Pseudomonas putidis. The dominant strain of bacteria responsible for imazapic degradation was Bacillus sp.. The degradation ability of B. gaemokensis was the strongest， which the degradation rate reached 88.23%. In conclusion，the aforementioned strains have established a theoretical framework for the study of microbial degradation of imazapic， as well as for developing microbial degradation agents and soil remediation strategies.

Key words： imazapic; degrading bacteria; Bacillus sp.; screening; identification

甲咪唑煙酸是一種發(fā)芽前除草劑，通常用于控制威脅花生生長(zhǎng)的外來(lái)一年生害草[1]，具有高效、廣譜的特點(diǎn)，一次用藥可以控制農(nóng)作物整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的雜草[2]。此除草劑對(duì)常見的雜草均有較好的除草效果，因此得到廣泛應(yīng)用。甲咪唑煙酸的除草作用機(jī)制，主要通過(guò)抑制植物相關(guān)合成酶的生成，阻止部分相關(guān)氨基酸的生物合成，影響蛋白質(zhì)的正常合成，干擾相關(guān)DNA的合成以及細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)，最終影響植株的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株死亡[3]。隨著甲咪唑煙酸除草劑的廣泛應(yīng)用，田間雜草得到了有效控制，但也給后茬作物帶來(lái)了殘留風(fēng)險(xiǎn)。河南省花生地面積居全國(guó)第一，后茬作物以蔬菜和小麥居多。近年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甲咪唑煙酸對(duì)后茬蔬菜影響較大。據(jù)報(bào)道，甲咪唑煙酸會(huì)對(duì)土壤的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致土壤酸化。另外，甲咪唑煙酸在土壤中殘留時(shí)間可達(dá)3年以上，對(duì)后茬作物的生長(zhǎng)和土壤微生態(tài)環(huán)境破壞較大。我國(guó)一年兩季種植區(qū)大多采用輪作模式，因此在使用甲咪唑煙酸時(shí)需要注意使用劑量及濃度[4-5]。

目前，微生物降解已經(jīng)成為一項(xiàng)有效治理長(zhǎng)效殘留除草劑的手段[6]。一些能夠有效降解除草劑的微生物菌株逐漸被篩選出來(lái)并得以分離鑒定[7]。研究表明，除草劑可通過(guò)動(dòng)植物和微生物的生物作用降解，目前除草劑降解菌以細(xì)菌的研究較為深入[8]，主要包括假單胞菌屬[9]、芽孢桿菌屬[10]、產(chǎn)堿菌屬[11]和黃桿菌屬[12]等。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，咪唑煙酸在未滅菌土壤中的降解速率比在滅菌土壤中的降解速率快2.3～4.4倍，表明土壤微生物在除草劑降解過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。王學(xué)東等[14-15]從長(zhǎng)期使用咪唑煙酸的非耕地土壤中分離出2株該除草劑的高效降解菌，分別為熒光假單胞菌Ⅱ型（P. fluorescenes biotypeⅡ）和蠟狀芽孢桿菌（B. cereus），其在5 d 內(nèi)對(duì)咪唑煙酸的降解率分別達(dá)到89.4%和95.6%。張武[16]從長(zhǎng)期施用咪唑乙煙酸的土壤中篩選出2株對(duì)咪唑乙煙酸具有較好降解能力的芽孢桿菌，其降解率均在75%以上。金雷[17]從長(zhǎng)期受咪唑乙煙酸污染的農(nóng)田土壤中分離到 1 株咪唑乙煙酸降解菌芽孢桿菌屬Bacillus sp. QC-13。甲咪唑煙酸類除草劑降解菌目前報(bào)道的僅有蠟樣芽孢桿菌和假單胞桿菌，其他種類降解菌尚未見報(bào)道。按照國(guó)家對(duì)農(nóng)村土壤面源污染的“一控兩減三基本”政策，生物降解農(nóng)藥成為研究熱點(diǎn)，微生物降解菌在降解除草劑和土壤修復(fù)方面應(yīng)用前景廣闊。

本研究從使用過(guò)甲咪唑煙酸的花生田土壤中篩選出能夠降解甲咪唑煙酸的細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)的鑒定。本研究旨在篩選能夠降解甲咪唑煙酸的細(xì)菌，為研究微生物降解甲咪唑煙酸的機(jī)制、開發(fā)甲咪唑煙酸微生物降解制劑和修復(fù)土壤奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試土樣

土樣采集地為河南省駐馬店市和洛陽(yáng)市等使用過(guò)甲咪唑煙酸的花生連作田土壤，其中駐馬店地區(qū)土樣共計(jì)8份，洛陽(yáng)地區(qū)土樣共計(jì)14份。采用五點(diǎn)采樣法，土樣取樣深度為10～20 cm，將每一采集地的土壤樣品進(jìn)行混勻處理，風(fēng)干、碾碎，過(guò)40目篩，4 ℃條件下存儲(chǔ)備用。

1.2 供試藥品

甲咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）購(gòu)自MedChemExpress，HPLC級(jí)甲酸和乙腈購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，革蘭氏染色試劑盒、細(xì)菌生理生化發(fā)酵管、瓊脂糖、2×Taq mix、50×TAE緩沖液、D2000 plus DNA Ladder和Goldview購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，上下游引物（27F，1492R）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的分離純化

將10 g土壤加入至50 mL含藥富集培養(yǎng)基中，其甲咪唑煙酸終濃度為240 mg·L-1，在30 ℃、120 r·min-1條件下，恒溫振蕩培養(yǎng)1個(gè)月，每隔7 d補(bǔ)充含100 mg·L-1 甲咪唑煙酸的富集培養(yǎng)基5 mL。含藥富集培養(yǎng)基配方為KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，葡萄糖5 g，NH4Cl 0.5 g，加入蒸餾水定容至1 L，利用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值為7.0[18]。

采用土壤稀釋涂布法[19]，取100 μL待測(cè)液涂布在肉湯培養(yǎng)基上，于30 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h。采用十字交叉法測(cè)量透明圈直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)，挑取有較大透明圈的菌株，劃線純化后保存待用。

1.4 甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的降解能力測(cè)定

將培養(yǎng)好的純化菌株，以2%接種量接種至含藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，甲咪唑煙酸濃度為100 mg·L-1，設(shè)置含藥對(duì)照和培養(yǎng)基對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。在30 ℃、150 r·min-1條件下，振蕩培養(yǎng)7 d[20]。含藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為NaCl 1.0 g，（NH4）2SO4 1.0 g，K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加入蒸餾水定容至1 L， pH值調(diào)為7.0。

將10 mL 10 μmol乙酸銨加入樣品中，搖勻30 s，以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，用0.2 μm Whatman膜過(guò)濾上清液，測(cè)定甲咪唑煙酸含量[21]。使用高效液相色譜（Agilent 1220）測(cè)定甲咪唑煙酸降解菌株的降解能力。降解率公式如下：

降解率=1-（最終含藥量/ 對(duì)照含藥量）×100%

改良的檢測(cè)條件參照GB T23818—2009《大豆中咪唑啉酮類除草劑殘留量的測(cè)定》[22]、Senseman等[23]和Tu等[24]的方法。色譜柱為C18，長(zhǎng)度250 mm × 4.6 mm，5 μm；柱溫（25±3） ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相A： 0.1%甲酸，流動(dòng)相B：乙腈；保留時(shí)間11.5 min。

1.5 形態(tài)學(xué)鑒定

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[25]和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[26]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.6 生理生化鑒定

使用革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)（M.R.）、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P）、H2S試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)等對(duì)各菌株分別進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[25]和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[26]進(jìn)行鑒定。

1.7 16S DNA鑒定

將待測(cè)細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)液中，在30 ℃、150 r·min-1條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24 h，使用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒（DP302）（天根生物科技有限公司）提取細(xì)菌DNA，提取方法見說(shuō)明書，并放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采用細(xì)菌鑒定通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-ACGGCTACCTTACGACTT-3’）[27]。PCR反應(yīng)體系為50 μL：27F 1 μL，1492R 1 μL，DNA 1 μL，2×Taq PCR mix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 40 s，退火52～56 ℃ 1～1.5 min，延伸72 ℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán)，延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建降解菌株的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的篩選

水解圈試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），從甲咪唑煙酸土壤中篩選出8株細(xì)菌對(duì)甲咪唑煙酸有降解作用，水解圈直徑大小為0.88～1.42 cm，其中3號(hào)菌株和6號(hào)菌株的水解圈直徑最大，分別為1.42、1.38 cm。8株細(xì)菌的降解率范圍為68.98%～88.23%，其中3號(hào)菌株和6號(hào)菌株的降解率顯著大于其他菌株，降解率分別為88.23%和85.41%，降解效果較好。方差分析結(jié)果表明，菌株之間的水解圈直徑差異較小，降解率差異顯著。由此可知，液相降解率分析法更能準(zhǔn)確地篩選甲咪唑煙酸降解菌。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的菌落形態(tài)學(xué)特征如表2和圖1所示，在菌落形狀、表面、邊緣、透明度、顏色幾個(gè)特征上存在差異。甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的微觀形態(tài)學(xué)特征如表3和圖2所示，甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的微觀菌體形態(tài)均為桿菌，但菌體大小和能否成鏈存在差異。

2.3 生理生化特性鑒定

甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的生理生化特性如表4所示，甲咪唑煙酸降解細(xì)菌在過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)中的生理生化特性一致，在革蘭氏染色、淀粉水解、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、葡萄糖試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)和H2S試驗(yàn)的生理生化特性存在差異，特別是革蘭氏染色和吲哚試驗(yàn)，菌株的反應(yīng)存在陰陽(yáng)性表現(xiàn)。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，利用MEGA7.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，甲咪唑煙酸降解細(xì)菌共被劃分為7個(gè)進(jìn)化簇，7株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），1株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定結(jié)果，這8株細(xì)菌的聚類結(jié)果如表5所示。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

微生物的數(shù)量、活性、對(duì)環(huán)的適應(yīng)能力等均可影響微生物對(duì)除草劑的降解能力[29-30]。本研究中，8株甲咪唑煙酸降解細(xì)菌的降解率均達(dá)68%以上，但降解菌的降解能力存在種內(nèi)和種間差異，這與前人[13-17]研究結(jié)果一致。本研究中， 8株甲咪唑煙酸降解細(xì)菌中7株屬于芽孢桿菌、1株假單胞菌，甲咪唑煙酸降解菌種類篩選結(jié)果也與前人[13-17]研究結(jié)果一致。由此可見，芽孢桿菌是降解甲咪唑煙酸的優(yōu)勢(shì)菌。雒曉芳等[31]和劉艷等[32]研究表明，蘇云金芽孢桿菌和惡臭假單胞菌對(duì)多種農(nóng)藥均有降解作用。原晨虹[33]，楊亞男[34]和陳琳等[35]報(bào)道，側(cè)孢短芽孢桿菌（B. laterosporus）、同溫層芽孢桿菌（B. stratosphericus）和甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（B. methylotrophicus）對(duì)植物病害有防治效果。周敏[36]研究表明，大山芽孢桿菌（B. gaemokensis）對(duì)亞硝酸鹽有降解作用。但未見上述報(bào)道的幾種細(xì)菌對(duì)甲咪唑煙酸有降解作用。本研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)孢短芽孢桿菌、同溫層芽孢桿菌和甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌對(duì)甲咪唑煙酸均具有降解能力，與前人[13-17]報(bào)道的降解菌株種類有所不同，這可能與樣品采集地域和生境有關(guān)。上述菌株的發(fā)現(xiàn)，豐富了甲咪唑煙酸生物降解的種類，為甲咪唑煙酸生物降解提供了參考，也為今后甲咪唑煙酸生物降解的研究拓寬了思路。另外，關(guān)于甲咪唑煙酸降解微生物的研究較少，目前的報(bào)道主要集中于對(duì)細(xì)菌降解菌的研究，而真菌和放線菌降解菌的研究鮮見報(bào)道。本研究缺乏真菌和放線菌降解菌的篩選，今后還需進(jìn)一步拓寬降解菌的篩選范圍。甲咪唑煙酸降解菌的研究目前還處于起步階段，距離應(yīng)用還有較大的距離，在今后的研究中還需在菌株篩選、降解機(jī)制、發(fā)酵工藝優(yōu)化、制劑開發(fā)等方面進(jìn)行深入研究。另外，未來(lái)研究還可以利用基因工程技術(shù)來(lái)構(gòu)建多種高效的降解菌株應(yīng)用于降解土壤農(nóng)藥殘留，達(dá)到降低土壤農(nóng)藥污染的作用[37]，從而加快甲咪唑煙酸微生物降解制劑的研發(fā)，利用微生物來(lái)修復(fù)土壤環(huán)境，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中藥物殘留對(duì)農(nóng)作物及環(huán)境的危害。

3.2 結(jié)論

本研究從施用甲咪唑煙酸的花生連作田土壤中共篩選出8株對(duì)甲咪唑煙酸具有降解能力的細(xì)菌，降解率范圍為68.98%～88.23%。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性測(cè)定、分子生物學(xué)方法鑒定，8株細(xì)菌被鑒定為蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）、大山芽孢桿菌（B. gaemokensis）、側(cè)孢短芽孢桿菌（B. laterosporus）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）、同溫層芽孢桿菌（B. stratosphericus）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）和惡臭假單胞菌（P. puida），并以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)種群，其中大山芽孢桿菌（B. gaemokensis）對(duì)甲咪唑煙酸的降解能力最強(qiáng)。本研究關(guān)于大山芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、同溫層芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和惡臭假單胞菌對(duì)甲咪唑煙酸降解的能力為首次報(bào)道，為后續(xù)研究甲咪唑煙酸降解菌資源多樣性和應(yīng)用功能性奠定了理論基礎(chǔ)。另外，微生物降解甲咪唑煙酸的機(jī)制、微生物降解制劑的開發(fā)、甲咪唑煙酸降解菌株在土壤修復(fù)中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

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