摘要： 植物染色體的倍性維持和變化受環(huán)境因素影響，組培再生過程由于培養(yǎng)條件等因素往往導(dǎo)致染色體的結(jié)構(gòu)和倍性變化。為探索組培條件下山茶種質(zhì)的倍性變化，該研究利用山茶種質(zhì)的愈傷組織誘導(dǎo)體系，通過流式細(xì)胞儀分析倍性變化情況，并結(jié)合秋水仙素處理對組培再生條件下倍性的穩(wěn)定性和變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明：（1）10個山茶種質(zhì)中6個為二倍體，2個為四倍體，1個為六倍體和1個為十倍體，在組培誘導(dǎo)愈傷及再生過程中不同倍性的種質(zhì)材料能夠保持穩(wěn)定的倍性。（2）獲得了秋水仙素處理的最適誘導(dǎo)條件，即培養(yǎng)基配方為秋水仙素濃度20 mg·L-1，愈傷增殖培養(yǎng)10 d。（3）對56個獨立組織樣品（含愈傷和芽）開展了倍性檢測發(fā)現(xiàn)，有38個組織樣品的倍性在1.5～2.5倍之間，11個組織樣品產(chǎn)生了低于1.5倍性的特異現(xiàn)象。該研究結(jié)果進(jìn)一步探索了不同山茶種質(zhì)之間的倍性關(guān)系，為山茶屬植物的倍性調(diào)控和多倍體誘導(dǎo)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 山茶屬， 染色體倍性， 組織培養(yǎng)， 秋水仙素， 流式細(xì)胞術(shù)

中圖分類號： Q943文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1299-08

Maintenance and variation of chromosome ploidy undertissue culture conditions of differentCamellia germplasms

LI Yaxuan1，2， LI Xinlei1， LI Jiyuan1， YIN Hengfu1*

（ 1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Research Institute of Subtropical Forestry， ChineseAcademy of Forestry， Hangzhou 311400; 2. Nanjing Forestry University， Nanjing 210037 ）

Abstract： The maintenance and variation of ploidy in plants are influenced by environmental factor， and the tissue culture regeneration can often cause changes of chromosome structures and ploidy levels. In order to explore the ploidy variation of Camellia germplasm under tissue culture conditions， the callus induction system of Camellia germplasm was used to analyze the ploidy changes by flow cytometry， and the stability and variation of the ploidy under tissue culture generation were analyzed in combination with colchicine treatment. The results were as follows： （1） Six of ten of Camellia germplasms were diploid， two of them were tetraploid， one hexaploid and one decaploid， and the germplasm materials largely maintained stable ploidy levels during the tissue regeneration processes. （2）The optimum conditions for colchicine treatment were obtained， that is， the callus was cultured in treatment medium containing colchicine at 20 mg·L-1 for 10 d， followed by regeneration in tissue-differentiation culture. （3）The ploidy analyses were carried out on the treated tissues in different differentiation states， and the results showed that most of the independent tissues （including 56 callus and shoots） were found to be aneuploids， 38 tissues had ploidy between 1.5 to 2.5 ， and 11 tissues produced less than 1.5. This study further explores the ploidy relationship between different Camellia germplasms， and provides a reference for an in-depth study of ploidy regulation and polyploid induction of Camellia.

Key words： Camellia， chromosome ploidy， tissue culture， colchicine， flow cytometry

山茶（Camellia japonica）隸屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是我國傳統(tǒng)木本觀賞花卉 （閔天祿， 1992；Gao et al.， 2005），俗稱耐冬。山茶原產(chǎn)于中國，17世紀(jì)中由日本傳入歐洲，由此在歐洲、美洲等地開始進(jìn)行了廣泛種植 （陳國方等， 2013）。根據(jù)國家山茶協(xié)會的統(tǒng)計，山茶花的品種已經(jīng)超過3萬個 （Wang et al.， 2021）。觀賞山茶種質(zhì)的地理起源復(fù)雜，并且存在種間雜交，這使得其染色體倍性存在較大差異（Tanaka et al.， 2006；Hembree et al.， 2019）。在山茶科里，山茶屬與核果茶屬的基本染色體數(shù)都是1n=1x=15，但是其他屬的基本染色體數(shù)量并不完全一致，如紫莖屬的基本染色體數(shù)為1n=1x=15或者1n=1x=17，福蘭茶屬、大頭茶屬、木荷屬的基本染色體數(shù)為1n=1x=15或1n=1x=18（Hembree et al.， 2019）。山茶屬植物的倍性存在多種多樣的變異，從三倍體到十倍體都有被報道，其中六倍體為較常見的多倍體（Kondo， 1977；Hembree et al.， 2019）。

植物染色體倍性的變化會影響到許多性狀（Serrano-Mislata et al.， 2015）。比如，來自不同倍性的雜交種子發(fā)育后，可能會引起胚乳發(fā)育失敗，最終產(chǎn)生生活力低或者沒有活力的種子；另外，奇數(shù)倍性的植物在生育力上不及偶數(shù)倍性的作物（Kondorosi et al.， 2000）。產(chǎn)生多倍體變異的原因包括自然變異和誘變變異等，其中誘變變異又可以分為物理誘導(dǎo)和化學(xué)誘導(dǎo)。目前，大多數(shù)人工誘導(dǎo)多倍體的方法是用化學(xué)試劑（包括秋水仙素、氟樂靈、氨磺靈等）對正在產(chǎn)生細(xì)胞分裂的植物器官、組織、細(xì)胞等進(jìn)行處理，誘導(dǎo)其產(chǎn)生多倍體（彭盡暉等， 2004；程紅英， 2010）。秋水仙素在植物多倍體誘變上被應(yīng)用得最為廣泛。秋水仙素主要提取于百合科秋水仙（Colchicum autumale）的種子和鱗莖，具有較強(qiáng)毒性（彭盡暉等， 2004）。秋水仙素的主要作用機(jī)制如下：通過與有絲分裂細(xì)胞接觸，秋水仙素可以與微管蛋白異二聚體結(jié)合，導(dǎo)致有絲分裂中期的染色體不能在赤道板上進(jìn)行排列，影響染色體的分布（彭盡暉等， 2004）。

組培再生過程中，培養(yǎng)條件和介質(zhì)因素導(dǎo)致體細(xì)胞變異、染色體結(jié)構(gòu)重排、倍性變化等情況，這非常普遍（Leite et al.， 2019）。Phillips等（1994）研究發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基的組培再生條件下，染色體畸變、非整倍體和多倍體經(jīng)常發(fā)生在體外再生體中。在馬鈴薯、小麥、水稻等農(nóng)作物中，體細(xì)胞無性系等植株可以出現(xiàn)染色體畸變、DNA甲基化、基因突變等多種方式（韋彥余等，2004）。在山茶屬植物中開展組培擴(kuò)繁體系具有應(yīng)用意義，然而組培條件下不同倍性種質(zhì)的染色體完整性研究還比較缺乏。

山茶屬種質(zhì)有較復(fù)雜和高頻率的染色體倍性變化，二倍體、四倍體、六倍體常有出現(xiàn)，那么不同倍性的材料在組培條件下能否維持完整倍性，是否會發(fā)生倍性的變化還值得研究。

因此，為明確山茶屬觀賞材料的倍性情況，本試驗參考了前人在山茶屬植物中建立的再生體系（劉海英，2011；吳斌等，2013），研究不同倍性材料之間形態(tài)學(xué)上與不同組織培養(yǎng)階段下的染色體的倍性變化情況，擬探討以下問題：（1）收集到的10個山茶種質(zhì)的倍性情況；（2）秋水仙素處理后山茶染色體加倍的濃度和時間條件。本研究結(jié)果通過對山茶染色體倍性的檢測分析了不同山茶種質(zhì)的倍性情況，并探索了山茶染色體變異誘導(dǎo)的最適條件，為多倍體育種的理論奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗材料和采樣

所使用的山茶種質(zhì)采自中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所山茶種質(zhì)資源圃以及金華山茶物種園，采樣時間為2021年7—8月，樣品類型為嫩葉、花芽等組織（表1）。具體的種質(zhì)信息如下：單體紅山茶（Camellia uraku）、浙江紅山茶（C. Chekiangoleosa）、滇山茶（C. reticulata）、大花紅山茶（C. magniflora）、峨眉紅山茶（C. omeiensis）、全緣紅山茶（C. subintegra）、山手（C. japonica ‘Shanshou’）、南山茶（C. semiserrata）、尖萼紅山茶（C. edithae）、金蝶飛葉（C. japonica ‘Jindiefeiye’）。

1.2 山茶種質(zhì)愈傷組織的培養(yǎng)

前期采集獲得了10種山茶種質(zhì)的樣品，經(jīng)過自來水沖洗和外植體消毒后，使用MS-D2培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織。MS-D2培養(yǎng)基配方如下：瓊脂6.5 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、MS培養(yǎng)基粉末4.43 g·L-1、NAA 0.5 mg·L-1、2，4-D 0.5 mg·L-1、6BA 1 mg·L-1、椰汁50 mL·L-1。外植體消毒流程如下：使用75%酒精浸泡并搖動外植體，使充分接觸2 min；用滅菌后的純水沖洗2次后，使用5%次氯酸鈉消毒10 min；剝離外部已褐化的外層苞片后、切開并接種進(jìn)培養(yǎng)基。經(jīng)暗培養(yǎng)約1個月后，待脫分化的愈傷組織長到約0.5 cm × 0.5 cm大小后，將已褐化的原外植體切除后，移入組織培養(yǎng)瓶中進(jìn)行光照培養(yǎng)，條件為12 h光/12 h暗、光照強(qiáng)度4 000 lx、溫度（25±2）℃。

1.3 山茶種質(zhì)愈傷組織的流式細(xì)胞儀分析

（1）取適量愈傷組織（0.1～0.2 g）放入3.5 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中放入2 mL的細(xì)胞裂解液（Tris 200 mmol·L-1、MgCl2 4 mmol·L-1、Triton 0.5%， pH 7.5），用鋒利的刀片切成小塊后冰上放置約15 min。（2）使用移液槍吸取塑料培養(yǎng)皿中的上清液，將上清液經(jīng)過孔徑40 μm的尼龍濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至2 mL的圓底塑料管中，并做好標(biāo)記。根據(jù)濾液體積，加入1/100體積的PI染料（100 mg·L-1），輕輕混勻后用錫箔紙封閉，置于冰上保存至上機(jī)檢測。（3）使用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀對山茶愈傷組織以及誘導(dǎo)后的組織進(jìn)行倍性測量，使用FL2-A作為x軸，SSC-H作為y軸對測定值進(jìn)行分析。

1.4 山茶組織秋水仙素處理和培養(yǎng)

依據(jù)秋水仙素設(shè)定的處理濃度，配置CS4培養(yǎng)基（瓊脂6.5 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、MS培養(yǎng)基粉末4.43 g·L-1、TDZ 1 mg·L-1、PAA 15 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1、椰汁50 mL·L-1），并對耐冬愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)。秋水仙素濃度分別為10、20、30 mg·L-1，處理時間為10、15、20 d，處理完成后轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的CS4培養(yǎng)基中，利用流式細(xì)胞儀測定DNA含量并估算染色體倍性。為了快速檢測處理效果，倍性檢測首先采用混測法，即將5～6個愈傷組織混合檢測，根據(jù)倍性變化結(jié)果對每個愈傷組織樣本進(jìn)行單個測定，每個樣品重復(fù)3次，用于數(shù)據(jù)處理和分析。

2結(jié)果與分析

2.1 建立10個山茶種質(zhì)愈傷組織和組培再生過程

山茶種質(zhì)的外植體經(jīng)過約30 d的誘導(dǎo)和繼代后出現(xiàn)愈傷組織，獲得愈傷組織的山茶種質(zhì)包括單體紅山茶、浙江紅山茶、大花紅山茶、滇山茶、峨眉紅山茶、尖萼紅山茶、金蝶飛葉、南山茶、全緣紅山茶、山手（表1）。其中，全緣紅山茶的愈傷組織較為松散，其他山茶種質(zhì)培育的愈傷組織較為緊密且獲得的愈傷組織未出現(xiàn)明顯的死亡與褐化等情況，說明現(xiàn)有體系能夠高效獲得愈傷組織（圖1），其中FCM-1代表誘導(dǎo)的初代愈傷組織，F(xiàn)CM-2為愈傷繼代培養(yǎng)后階段，F(xiàn)CM-3為愈傷組織轉(zhuǎn)入組織分化培養(yǎng)（CS4培養(yǎng)基）階段，之后通過2～3次繼代（30～50 d）獲得部分分化的愈傷組織或者芽狀組織。

2.2 山茶屬植物種質(zhì)不同培養(yǎng)階段的染色體倍性檢測

根據(jù)實驗室前期結(jié)果，以遺傳穩(wěn)定的二倍體耐冬為對照，通過流式細(xì)胞儀分析檢測10個山茶屬種質(zhì)材料，根據(jù)估算其核內(nèi)DNA的含量推斷染色體倍性（表2）。結(jié)合圖1所示的組培再生過程，分別選取不同培養(yǎng)階段的組織（FCM-1、FCM-2、FCM-3）開展流式細(xì)胞儀分析。由表2可知，不同培養(yǎng)條件下的染色體DNA含量在同一個材料當(dāng)中變化細(xì)微，其倍性沒有發(fā)生明顯變化；檢測的山茶屬種質(zhì)組織材料包含6個二倍體、2個四倍體、1個六倍體、1個十倍體。這說明所選用種質(zhì)存在較大的倍性變化，但是在當(dāng)前組培再生條件下其倍性保持穩(wěn)定。

2.3 耐冬多倍體誘導(dǎo)

隨著處理濃度和處理時間的增加，秋水仙素會使植物愈傷組織失去生命活力（張煥玲等， 2008）。為了探究秋水仙素處理對山茶組織染色體的影響，我們利用組培再生體系，設(shè)置了耐冬秋水仙素處理條件（表3）。由表3可知，在濃度10 mg·L-1條件下致死的個體數(shù)量未達(dá)到半數(shù)，達(dá)到半致死的天數(shù)約為48 d；在濃度20 mg·L-1條件下處理10 d后約有預(yù)期效果。因此，秋水仙素在濃度20 mg·L-1培養(yǎng)基下處理10 d被選為處理的最適合條件，進(jìn)而開展耐冬的處理研究。

2.4 秋水仙素處理耐冬組織的倍性檢測

使用流式細(xì)胞儀，測定了經(jīng)秋水仙素處理（濃度20 mg·L-1， 處理10 d）的56個獨立愈傷來源的分化組織（其中含有4個芽組織）的倍性變化情況（圖2：A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，秋水仙素誘導(dǎo)對耐冬的倍性產(chǎn)生了顯著改變， 除了少數(shù)的愈傷組織為二倍體，大部分愈傷組織和芽組織中倍性呈現(xiàn)出非整倍性的梯度性變化（圖2：B），其中最小倍性為1.2倍，最大倍性為3.2倍。這說明秋水仙素處理造成了耐冬染色體倍性的不穩(wěn)定變異，但是整倍性加倍或者減少的事件出現(xiàn)的情況較低。

3討論與結(jié)論

3.1 山茶屬植物組培再生和染色體倍性維持

在染色體倍性的鑒定中，與核型鑒定方法相比，流式細(xì)胞術(shù)由于準(zhǔn)確性較高、檢測速度較快等特性被廣泛推廣，適用于大規(guī)模組織樣品的倍性檢測分析，有利于高效獲得染色體倍性的變化信息（瑞菲爾·努納茲等， 2005；李靖等， 2008）。山茶屬植物的組織中含有多種次生代謝物質(zhì)，其中單寧化合物在流式分析過程中能夠跟熒光染料（如碘化丙啶）結(jié)合，造成較強(qiáng)的背景信號（Huang et al.， 2013）。在山茶屬植物中，通過優(yōu)化細(xì)胞核裂解液和選取次生代謝物含量低的幼嫩組織，流式細(xì)胞分析通常能解決背景信號的問題（Huang et al.， 2013）。但是，一些山茶屬植物材料（油茶、茶梅等）的單寧類物質(zhì)含量較高，使得在流式分析的重復(fù)性不高（賈文慶，2015）。Weber等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，植物愈傷組織均為未分化的、較為幼嫩的細(xì)胞團(tuán)，其中次生代謝物含量較少，有利于開展流式細(xì)胞儀檢測。本試驗使用脫分化的愈傷組織進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，能獲得重復(fù)性較高的細(xì)胞核分離效果，增強(qiáng)了檢測的穩(wěn)定性。因此，本研究方案減少了雜質(zhì)對山茶倍性測定的影響，避免了山茶新鮮組織中單寧等物質(zhì)的背景熒光，提高了實驗的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。

Syeed等（2021）研究表明組織培養(yǎng)及其再生的過程能夠造成染色體的斷裂、重組等，從而影響染色體倍性的變異。如Ali等（2017）在香芹（Coriandrum sativum）中的研究發(fā)現(xiàn)，基因組大小在體胚誘導(dǎo)組織與種子萌發(fā)苗之間存在較大變異，說明培養(yǎng)基條件能夠影響基因組的穩(wěn)定性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)的組織再生過程中，不同倍性的山茶屬種質(zhì)的染色體倍性相對穩(wěn)定，這保障了研究方案中不同處理對染色體倍性的連續(xù)性研究。但是，不同的組培條件對山茶屬基因組穩(wěn)定性的影響研究還不充分。山茶屬植物組培再生途徑周期較長，激素的組成、培養(yǎng)時間等條件對染色體倍性的維持和變化的研究還有待進(jìn)一步深入。

3.2 秋水仙素處理山茶屬植物后染色體倍性的變化

在觀賞植物的染色體加倍的報告中，使用秋水仙素對植物進(jìn)行誘導(dǎo)的成功率最高（Manzoor et al.， 2019）。例如，在與山茶屬近緣的杜鵑花（Rhododendron fortune）中，利用0.1%秋水仙素處理24 h就能高效地誘導(dǎo)出多倍體組織（Mo et al.， 2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，山茶屬植物對秋水仙素具有較高的抵抗性，在30 mg·L-1的培養(yǎng)基中其半致死的時間約為1個月。本試驗使用固體培養(yǎng)基對山茶進(jìn)行了培養(yǎng)，研究表明秋水仙素的處理能夠使再生組織的染色體倍性發(fā)生顯著變化，但是極少（約為1%）出現(xiàn)類似整倍性的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，秋水仙素處理后的山茶組織呈現(xiàn)頻繁的非整倍體細(xì)胞。盡管類似的結(jié)果在其他植物中也有發(fā)現(xiàn)，如柑橘（Gmitterjr et al.， 1991）、葡萄（Kara et al.， 2019）等。Park等（2016）研究指出，由于非整倍體植物通常表現(xiàn)出發(fā)育異常、不育或致死性，因此很少評估非整倍體植物的經(jīng)濟(jì)用途。Park等（1999）通過使用未成熟種子的培養(yǎng)和隨后的胚培養(yǎng)，從184個不同的三倍體雜交葡萄藤之間的各種雜交中回收了5個染色體數(shù)目在51～59之間的非整倍體植物。在山茶屬植物中的非整倍體出現(xiàn)得較多（56個樣品中有38個組織的倍性在1.5～2.5倍之間），推斷其形成原因如下：（1）由于秋水仙素處理對組培不同類型細(xì)胞中紡錘絲的作用存在特殊性，山茶屬植物組培條件下細(xì)胞處于不均勻等分裂狀態(tài)，它抑制紡錘絲的效果不盡相同，因此產(chǎn)生的并不是完整的多倍體，并存在染色體缺失、染色體嵌合等情況，造成倍性檢測的結(jié)果不均一；（2）山茶屬植物對秋水仙素的響應(yīng)存在差異，盡管前期實驗設(shè)計中的秋水仙素濃度對愈傷組織的生長抑制作用不明顯，但是處理濃度及作用時間可能在細(xì)胞增殖過程中存在敏感性差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)11個組織樣品（19.6%）產(chǎn)生了低于1.5倍性的特異現(xiàn)象，我們推測這可能是由于在有絲分裂過程中，秋水仙素的處理導(dǎo)致細(xì)胞中染色體加倍過程出現(xiàn)障礙，因此造成丟失了部分染色體。綜上結(jié)果，秋水仙素對山茶屬植物處理條件（如秋水仙素的處理濃度、處理時間、處理部位等）需要進(jìn)一步優(yōu)化，以達(dá)到最佳的整倍體誘導(dǎo)的效果。

本實驗通過探索組培條件下山茶種質(zhì)的維持與變化情況，測試了使用秋水仙素對山茶種質(zhì)資源的加倍的最適條件，為今后探索山茶種質(zhì)資源的加倍提供了基礎(chǔ)，并為山茶多倍體的育種打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯鄧斯麗）