摘要： TCP是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。該研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)苦蕎TCP家族進(jìn)行全基因組鑒定，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析苦蕎TCP基因在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達(dá)特征。結(jié)果表明：（1）在苦蕎的基因組中鑒定出28個(gè)TCP家族成員，它們不均勻地分布在苦蕎的8條染色體上。（2）多數(shù)的苦蕎TCP基因包含1～5個(gè)外顯子。（3）系統(tǒng)發(fā)育分析將苦蕎TCP家族分為5個(gè)亞家族，種內(nèi)TCP蛋白多聚集在同一分支上。（4）共線(xiàn)性分析表明，5個(gè)苦蕎TCP基因來(lái)自全基因組復(fù)制事件。（5）順式元件分析顯示，苦蕎TCP基因的啟動(dòng)子區(qū)域的順式響應(yīng)元件主要包含脅迫響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件兩大類(lèi)。（6）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，所有苦蕎TCP基因在檢測(cè)組織中均有表達(dá)。（7）qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)tTCP3、FtTCP6、FtTCP12和FtTCP13基因在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達(dá)量發(fā)生變化，其中FtTCP3在6 h干旱處理和鹽處理時(shí)表達(dá)量均達(dá)到峰值，說(shuō)明FtTCP3基因在苦蕎應(yīng)對(duì)干旱脅迫和鹽脅迫中起正向調(diào)控作用。該研究結(jié)果為了解TCP基因家族的進(jìn)化和功能提供了新的見(jiàn)解，為苦蕎TCP基因家族的功能研究和利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 苦蕎， TCP轉(zhuǎn)錄因子， 全基因組鑒定， 非生物脅迫， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1000-3142（2024）07-1364-13

Genome-wide identification and abiotic stress analysis ofTCP transcription factors in tartary buckwheat

YANG Lanfeng1， ZHU Xudong1， ZHOU Binhan1， LUO Yirou1，LI Minghui2， FANG Zhengwu1*

（ 1. College of Agriculture/Collaborative Innovation Center for the Industrialization of Major Food Crops， Yangtze University， Jingzhou 434025，Hubei， China; 2. Agricultural Industry Service Center for Tujia Autonomous County， Yichang 443500， Hubei， China ）

Abstract： TCP is a plant-specific transcription factor that plays crucial roles in plant growth and development. In this study， bioinformatics methods were used to identify the complete genome of tartary buckwheat TCP family， and real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） analysis was conducted to investigate the expression characteristics of TCP gene under drought and salt stresses. The results were as follows： （1） A total of 28 TCP family members were identified in the tartary buckwheat genome， unevenly distributed across its eight chromosomes. （2） Most tartary buckwheat TCP genes contained 1-5 exons. （3） Phylogenetic analysis classified the tartary buckwheat TCP family into five clades， with intraspecific TCP proteins mainly clustering together. （4） Collinearity analysis indicated that there were five tartary buckwheat TCP genes originated from genome-wide replication events. （5） Cis-element analysis revealed that the promoter regions of tartary buckwheat TCP genes predominantly contained two types of cis-response elements as stress response elements and hormone response elements. （6） Transcriptomic data analysis demonstrated that all tartary buckwheat TCP genes were expressed in the examined tissues. （7） qRT-PCR results indicated that the expression levels of FtTCP3， FtTCP6， FtTCP12， and FtTCP13 changed under drought stress and salt stress conditions， with FtTCP3 peaking at 6 h of drought and salt treatments， suggesting that it plays a positive regulatory role in tartary buckwheat’s response to drought stress and salt stress. This study provides new insights into the evolution and function of the TCP gene family， and provides a reference for the functional exploration and utilization of the tartary buckwheat TCP gene family.

Key words： tartary buckwheat， TCP transcription factors， genome-wide identification， abiotic stress， qRT-PCR

苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）為蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）一年生草本植物，俗稱(chēng)凈腸草，是一種藥食兩用型作物（Li et al.， 2019）。朱云輝和郭元新（2014）研究表明苦蕎中蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和微量元素的含量普遍高于玉米、小麥等一般糧食作物。苦蕎中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，具有抗高血壓、清除自由基、抗氧化、延緩衰老及預(yù)防心腦血管疾病等功能，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值（王為旋等，2024）?？嗍w在我國(guó)大部分地區(qū)均有種植，主要分布于東北、華北、西北和西南山區(qū)，具有生育期短、抗旱耐冷涼、耐貧瘠、適應(yīng)性較強(qiáng)等特點(diǎn)（楊恩澤等，2023）。有研究表明，干旱脅迫和鹽脅迫對(duì)苦蕎的種子萌發(fā)（李興美等，2022）、根系形態(tài)建成（董馥慧等，2021）、地上部農(nóng)藝性狀（趙海霞等，2019）和抗氧化酶活性（路之娟等，2018）等方面均會(huì)產(chǎn)生影響。因此，研究苦蕎的耐鹽性和耐旱性，探究其抗逆機(jī)理與調(diào)控對(duì)策，對(duì)實(shí)現(xiàn)干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保障糧食安全具有重要意義。

TCP是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，以玉米中的TB1基因、金魚(yú)草的CYC基因和水稻的PCF基因3個(gè)基因的首字母命名（Braun et al.， 2012）。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)堿基序列的不同，可以將其分為兩類(lèi)：Ⅰ類(lèi)（GGNCCCAC）主要誘導(dǎo)細(xì)胞分裂；Ⅱ類(lèi)（GTGGNCC）抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育（Kosugi ＆ Ohashi et al.， 2002）。TCP蛋白具有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，bHLH（螺旋-環(huán)-螺旋）結(jié)構(gòu)域和R結(jié)構(gòu)域。bHLH結(jié)構(gòu)域由59個(gè)氨基酸編碼，存在于所有TCP蛋白中，具有高度保守的特征。具有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及非生物脅迫中發(fā)揮重要作用（陳柳君，2022）；只有少部分TCP蛋白具有R結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域預(yù)計(jì)呈現(xiàn)卷曲的形狀，可能介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用和其他結(jié)構(gòu)域（Chai et al.， 2017）。大量研究表明，TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，它能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、改變細(xì)胞透性、減少有害物質(zhì)和改變激素敏感性等方式增加植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)（唐羽翔等，2022）。例如：過(guò)表達(dá)PeTCP10能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，提高抗氧化能力，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的耐鹽性（Xu et al.， 2021）；煙草NtbHLH123基因過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)煙草對(duì)鹽脅迫的耐受性，同時(shí)能誘導(dǎo)NtRbohE的表達(dá)和活性氧的產(chǎn)生，通過(guò) NtbHLH123-NtRbohE 信號(hào)通路提高轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性（An et al.， 2019）;在擬南芥中過(guò)表達(dá)OsTCP19能減少植物失水和活性氧的產(chǎn)生，增加脂滴的積累，提高轉(zhuǎn)基因植株幼苗和成熟植株的抗逆性（Mukhopadhyay ＆ Tyagi， 2015）。

目前，TCP轉(zhuǎn)錄因子家族在許多植物中已經(jīng)被鑒定出，如在擬南芥中鑒定出24個(gè)TCP成員（Zhou et al.， 2015），在李子中鑒定出19個(gè)TCP成員（Zhou et al.， 2016），在葡萄中鑒定出15個(gè)TCP成員（冀志蕊等，2015），在玉米中鑒定出29個(gè)TCP成員（Chai et al.， 2017），在茶樹(shù)中鑒定出36個(gè)TCP成員（溫貝貝等，2019），而在苦蕎中的鑒定和表達(dá)分析尚未見(jiàn)被報(bào)道。隨著基因組數(shù)據(jù)的發(fā)表，苦蕎中的轉(zhuǎn)錄因子被陸續(xù)報(bào)道，如FtMYB12的異源表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)冷脅迫的耐受性（Zhou et al.， 2015）， 過(guò)表達(dá)蕎麥FtbHLH3基因能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗干旱/氧化應(yīng)激的能力（Yao et al.， 2017），苦蕎毛狀根中過(guò)表達(dá)FtDREB6能提高植物SOD和CAT的酶活性且MDA含量下降，說(shuō)明過(guò)表達(dá)FtDREB6能提高植物的抗旱性（趙夢(mèng)雨等，2022），但是苦蕎TCP轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的作用尚不明確。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)苦蕎TCP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)干旱處理和鹽處理下苦蕎TCP基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，擬探討以下問(wèn)題：（1）苦蕎TCP轉(zhuǎn)錄因子家族理化性質(zhì)、親緣進(jìn)化關(guān)系、結(jié)構(gòu)特征和順式作用元件；（2）苦蕎TCP轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達(dá)變化情況。以期挖掘與苦蕎非生物脅迫相關(guān)的TCP基因，為深入研究苦蕎TCP轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)非生物脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和脅迫處理

所選材料為苦蕎麥品種‘川蕎一號(hào)’，種植于長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地。選取外形飽滿(mǎn)，大小均勻的種子，用水浸泡24 h后剝掉外殼，25 ℃催芽，發(fā)芽后移入發(fā)芽盒中，置于25 ℃、16 h光照/8 h黑暗的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將1周的幼苗用15% PEG600和200 mol·L-1 NaCl溶液進(jìn)行脅迫處理，以清水處理為空白對(duì)照，2個(gè)脅迫處理和對(duì)照均在0、3、6、9 h時(shí)取樣品全部葉片，置于2 mL離心管中，液氮冷凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 FtTCP基因家族成員鑒定

從苦蕎基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Pinku1（http：//mbkbase.org/Pinku1/）下載苦蕎蛋白序列，從TAIR（http：//www.Arabidposis.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥蛋白序列，以擬南芥TCP蛋白序列為參考序列，使用TBtools軟件的BLAST板塊對(duì)苦蕎的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)和篩選，剔除重復(fù)的和無(wú)TCP保守結(jié)構(gòu)域的序列，得到TCP蛋白候選序列。將所有候選蛋白序列提交至NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和PFAM（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，具有TCP保守結(jié)構(gòu)域的蛋白被確定為苦蕎TCP家族成員。

1.3 FtTCP基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

從BGDB（http：//buckwheat.kazusa.or.jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載甜蕎蛋白序列；從Ensembl Plants（http：//plants.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)下載水稻、甜菜的蛋白序列。利用TBtools軟件將苦蕎TCP蛋白序列與甜菜、水稻、擬南芥和甜蕎的TCP蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，獲取TCP同源蛋白序列。利用Cluster-X 2.0軟件對(duì)5個(gè)物種的TCP蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，利用 MEGA 6.0 軟件，并采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)置為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.4 FtTCP基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)和啟動(dòng)子序列分析

使用MEME（https：//meme-suite.org/）網(wǎng)站在線(xiàn)預(yù)測(cè)TCP蛋白基序；使用NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）預(yù)測(cè)苦蕎TCP 蛋白結(jié)構(gòu)域；使用Protparam（https：//web.expasy.org/protparam）在線(xiàn)軟件，對(duì)苦蕎TCP蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用 WOLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)苦蕎TCP蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；使用TBtools軟件從苦蕎基因組中提取TCP基因的啟動(dòng)子序列；利用Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行順式作用元件分析。

1.5 FtTCP基因染色體定位和共線(xiàn)性分析

從Pinku1數(shù)據(jù)庫(kù)下載苦蕎的全基因組文件和GFF3注釋文件，利用TBtools軟件對(duì)苦蕎TCP基因進(jìn)行染色體定位；利用MCScanX軟件分析苦蕎、甜蕎、水稻、甜菜和擬南芥5個(gè)物種基因序列重復(fù)的事件。

1.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

從NCBI CEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE126576）獲得苦蕎不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。提取苦蕎TCP基因在根、莖、葉、花、花后13 d、花后19 d和花后25 d的RNA-seq數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，利用TBtools 軟件繪制苦蕎TCP基因的組織表達(dá)譜。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

取100 mg苦蕎葉片置于研缽中，加入液氮后迅速磨成粉末，使用RNA試劑盒提取苦蕎葉片總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其質(zhì)量，使用超微量核酸儀測(cè)定其濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將苦蕎RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，濃度稀釋至100 ng·μL-1，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用Primer 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物 （表1），F(xiàn)tH3（HM628903）為內(nèi)參基因。PCR體系為2× mix 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1 FtTCP基因家族的鑒定和分析

基于保守結(jié)構(gòu)域，從苦蕎的全基因組中鑒定出28個(gè)苦蕎TCP家族成員，根據(jù)其蛋白分子量大小依次命名為FtTCP1-FtTCP28。由表2可知，苦蕎TCP基因家族理化性質(zhì)差異較大，氨基酸長(zhǎng)度在84～475 aa之間；分子量（molecular weight，MW）在9.50～51.04 kD之間；等電點(diǎn)（pI）介于4.93～9.71之間；酸性蛋白和堿性蛋白分布均勻；脂肪指數(shù)為53.29～97.50；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，除FtTCP1和FtTCP2定位在細(xì)胞質(zhì)中外，其余26個(gè)均定位于細(xì)胞核中。不穩(wěn)定指數(shù)介于34.88～71.12之間。

2.2 FtTCP基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為了全面分析苦蕎TCP基因家族的功能，首先對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。選取苦蕎、水稻、擬南芥、甜菜和甜蕎5個(gè)物種共121條TCP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。結(jié)果顯示，苦蕎TCP基因家族被劃分為5個(gè)亞家族（A1-A5），分別含有20個(gè)、39個(gè)、21個(gè)、17個(gè)、24個(gè)成員?？嗍wTCP基因在A2中分布最多，有9個(gè)成員；在A3亞族中分布最少，只有2個(gè)成員。甜蕎和苦蕎同屬蕎麥屬，親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化樹(shù)末端有20對(duì)苦蕎和甜蕎TCP蛋白兩兩相聚；苦蕎與水稻進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，這與單子葉和雙子葉植物進(jìn)化關(guān)系一致。在同一亞族內(nèi)，種內(nèi)的TCP蛋白更容易聚集在一起。

2.3 FtTCP基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

利用28個(gè)苦蕎TCP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2：A），苦蕎TCP蛋白被分為4組，其中Ⅰ組中有5個(gè)成員，Ⅱ組中有6個(gè)成員，Ⅲ組中有12個(gè)成員，Ⅳ中有5個(gè)成員。相鄰分支的苦蕎TCP基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)；保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，28個(gè)苦蕎TCP蛋白共有10個(gè)motif（圖2：B），F(xiàn)tTCP8、FtTCP9、FtTCP6、FtTCP12、FtTCP11、FtTCP4、FtTCP1不含Motif 1；Motif 4位于N端附近。大部分苦蕎TCP蛋白含有2～3個(gè)保守基序，F(xiàn)tTCP1上只有1個(gè)保守基序，F(xiàn)tTCP7上含有4個(gè)保守基序，F(xiàn)tTCP26和FtTCP28上含有6個(gè)保守基序；所有苦蕎TCP基因都只包含1個(gè)典型的TCP結(jié)構(gòu)域（圖2：C）；基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖2：D），11個(gè)苦蕎TCP基因包含內(nèi)含子，Ⅲ組中內(nèi)含子數(shù)量最多，推測(cè)該亞族在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了內(nèi)含子的插入。內(nèi)含子長(zhǎng)度存在較大差異，導(dǎo)致這些基因的長(zhǎng)度差距較大。FtTCP28基因的長(zhǎng)度最長(zhǎng)，它的長(zhǎng)度約占基因總長(zhǎng)度的50%。

2.4 FtTCP基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析

順式作用元件分析（圖3）顯示，苦蕎TCP基因啟動(dòng)子區(qū)主要包含脅迫響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件，其中激素響應(yīng)元件種類(lèi)多且分布廣泛，推測(cè)苦蕎TCP基因在激素調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在39個(gè)響應(yīng)元件中，光照響應(yīng)元件有24個(gè)，占比約61.53%，說(shuō)明苦蕎TCP基因的轉(zhuǎn)錄可能受光周期調(diào)控。脫落酸ABRE響應(yīng)元件在苦蕎26個(gè)FtTCP基因中都有分布，在FtTCP12中響應(yīng)程度最高。

光照響應(yīng)元件G-box和box 4存在于24個(gè)苦蕎TCP基因中；厭氧響應(yīng)元件ARE存在于5個(gè)苦蕎TCP基因中；光照響應(yīng)元件Gap-box、CAG-motif和GTGGC-motif分別只在FtTCP19、FtTCP2、FtTCP20中存在，生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-box僅在FtTCP6中分布。其中，非生物脅迫響應(yīng)元件如MBS、LAR、GC-motif、ARE在大部分的TCP基因中都有分布，其中ARE只在FtTCP6、FtTCP13和FtTCP17基因中沒(méi)有分布。因此推測(cè)苦蕎TCP基因在苦蕎的光周期、激素調(diào)節(jié)和逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

2.5 染色體定位和共線(xiàn)性分析

由圖4可知，28個(gè)苦蕎TCP基因被定位到苦蕎的8條染色體上，其中，F(xiàn)t8上分布的基因最多，有7個(gè)，占總基因數(shù)的25%，說(shuō)明Ft8染色體在苦蕎TCP基因組的進(jìn)化中起到了重要作用；Ft1、Ft5、Ft7染色體上分布的基因最少，均只有2個(gè)。

為了分析TCP基因在物種內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系，在苦蕎全基因組內(nèi)進(jìn)行共線(xiàn)性分析（圖5），發(fā)現(xiàn)共有5個(gè)苦蕎TCP基因的4對(duì)片段復(fù)制基因?qū)?，占基因家族成員的19%，共線(xiàn)性對(duì)只分布在Ft1、Ft3、Ft5、Ft8染色體上，其中Ft3上有2個(gè)成員，其余的均只有1個(gè)成員。為了進(jìn)一步研究苦蕎TCP基因的進(jìn)化過(guò)程，對(duì)苦蕎、甜菜、擬南芥、水稻4個(gè)物種間的共線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行了分析（圖6），發(fā)現(xiàn)苦蕎和甜菜之間的共線(xiàn)性對(duì)有7對(duì)，苦蕎和擬南芥之間的共線(xiàn)性對(duì)有8對(duì)，水稻和擬南芥之間的共線(xiàn)性對(duì)有7對(duì)，其中苦蕎染色體Ft2、Ft4、Ft6、Ft7與其他物種的染色體不存在共線(xiàn)性。

2.6 FtTCP基因家族的表達(dá)模式分析

為了探究苦蕎TCP基因在不同組織下的表達(dá)模式，根據(jù)苦蕎TCP基因在不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)FPKM值繪制表達(dá)譜熱圖（圖7）。FtTCP18在莖中表達(dá)量最高，F(xiàn)tTCP22 在根和莖中特異表達(dá)，F(xiàn)tTCP2和FtTCP4在花中特異表達(dá)，F(xiàn)tTCP14、FtTCP15、FtTCP12、FtTCP9、FtTCP7、FtTCP11在花后13 d表達(dá)量較高；FtTCP3、FtTCP6、FtTCP13在葉中表達(dá)量最高；FtTCP8在花中隨著開(kāi)花時(shí)間的增加，表達(dá)量越來(lái)越高，在開(kāi)花后第25天表達(dá)最顯著；FtTCP1在花中表達(dá)量最高，隨著開(kāi)花時(shí)間的增加，表達(dá)量逐漸降低。這表明苦蕎TCP基因參與到苦蕎根、莖、葉和花等組織的發(fā)育過(guò)程中。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，篩選出4個(gè)具有組織表達(dá)特異性的苦蕎TCP基因（FtTCP3、FtTCP6、FtTCP12和FtTCP13），并進(jìn)行干旱脅迫和鹽脅迫試驗(yàn)。qRT-PCR分析（圖8）顯示，在干旱脅迫下，F(xiàn)tTCP3表達(dá)明顯上調(diào)，表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在6 h時(shí)達(dá)到峰值；FtTCP6、FtTCP12和FtTCP13的表達(dá)量均降低，F(xiàn)tTCP6和FtTCP12在處理3 h后表達(dá)量降低明顯；FtTCP13在處理時(shí)段均略微低于對(duì)照水平。在模擬鹽脅迫處理下，F(xiàn)tTCP3基因表達(dá)模式同干旱處理下類(lèi)似；FtTCP13表達(dá)量先略微升高后降低，表達(dá)量變化不顯著；FtTCP6和FtTCP13的表達(dá)量明顯降低。

3討論

本研究共鑒定出28個(gè)苦蕎TCP家族成員，發(fā)現(xiàn)苦蕎TCP家族成員的分子量和等電點(diǎn)存在較大差異，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，暗示其功能的多樣性（王玉鳳等，2023）。細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，有26個(gè)苦蕎TCP蛋白定位在細(xì)胞核中，這與TCP基因在茶樹(shù)（溫貝貝等，2019）中的研究結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化分析將苦蕎、甜蕎、擬南芥、水稻和甜菜的TCP蛋白分為5個(gè)亞家族（A1-A5），每個(gè)亞家族中都有苦蕎TCP蛋白分布，其中A2中包含9個(gè)苦蕎TCP蛋白。FtTCP26、FtTCP4和FtTCP14、FtTCP15這兩組蛋白位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的獨(dú)立分支上，推測(cè)這兩組基因在苦蕎中單獨(dú)進(jìn)化而來(lái)。往往聚類(lèi)關(guān)系越近，其結(jié)構(gòu)和功能越相似（冀志蕊等， 2015）。FtTCP11與AtTCP2，F(xiàn)tTCP1、FtTCP2與AtTCP19位于同一分支上，推測(cè)FtTCP1、FtTCP2和FtTCP11響應(yīng)苦蕎的非生物脅迫（Xu et al.， 2017）。FtTCP6和FtTCP12在種內(nèi)進(jìn)化樹(shù)同一分支末端，具有相似的保守基序和結(jié)構(gòu)，它們對(duì)干旱脅迫和鹽脅迫的響應(yīng)程度相似，進(jìn)一步說(shuō)明位于同一亞族的基因往往具有相似的生物學(xué)功能。

啟動(dòng)子分析有助于闡明基因表達(dá)的調(diào)控和響應(yīng)機(jī)制，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件的分析，得到與植物非生物脅迫相關(guān)的重要元件，進(jìn)而分析各種元件相互作用而形成的復(fù)雜代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（劉營(yíng)等，2022）?？嗍wTCP基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有大量的光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)元件，這與在柳枝稷（Huo et al.， 2019）和矮牽牛（Zhang et al.， 2020）中對(duì)TCP基因家族的順式元件分析一致。其中，MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物細(xì)胞的形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過(guò)程（王艷朋等，2021）；bZIP轉(zhuǎn)錄因子在抵御生物及非生物脅迫中發(fā)揮著非常重要的作用（馬鑫磊等，2022）；ARF是一種能夠與生長(zhǎng)素響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程（郝彥蓉等，2020），MYB、bZIP、ARF在苦蕎TCP家族啟動(dòng)子區(qū)域大量存在，說(shuō)明苦蕎TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫方面發(fā)揮作用。此外，26個(gè)苦蕎TCP基因啟動(dòng)子區(qū)域均含有大量的ABRE響應(yīng)元件，ABRE是一個(gè)參與脫落酸（abscisic acid， ABA）反應(yīng)的順式作用元件，啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)ABRE響應(yīng)元件，說(shuō)明苦蕎TCP轉(zhuǎn)錄因子在ABA信號(hào)通路中能直接調(diào)控下游基因。Bano等（2021）研究表明，ABRE在Ntbhlh15、NtbHLH135.1、NtbHLH40.1中分布廣泛，這些基因均響應(yīng)低溫脅迫，表明ABRE元件在應(yīng)對(duì)低溫脅迫中起重要作用。外源施加ABA可以上調(diào)OsTCP19的轉(zhuǎn)錄水平，從而參與調(diào)節(jié)水稻的耐旱性（Mukhopadhyay ＆ Tyagi， 2015）。毛竹TCP10可以通過(guò)調(diào)節(jié)ABA信號(hào)通路對(duì)植物的耐旱性起正調(diào)控作用，通過(guò)茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， Me-JA）介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)側(cè)根生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用（張志強(qiáng)等， 2020）。因此，推測(cè)苦蕎TCP基因可能參與了ABA等激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而在非生物脅迫中發(fā)揮作用。關(guān)于苦蕎TCP基因在ABA信號(hào)途徑中的調(diào)控機(jī)理，仍需進(jìn)一步深入探討。

苦蕎主要種植于我國(guó)西南地區(qū)，對(duì)惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性（鄭逢盛等，2021）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，大部分苦蕎TCP基因在根、莖、葉、花中都有表達(dá)，說(shuō)明苦蕎TCP基因家族參與到苦蕎根、莖、葉和花等組織的發(fā)育過(guò)程中。本研究根據(jù)苦蕎不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選取了4個(gè)具有組織特異性的苦蕎TCP基因（FtTCP3、FtTCP6、FtTCP12和FtTCP13）進(jìn)行干旱脅迫和鹽脅迫處理，以干旱脅迫和鹽脅迫試驗(yàn)的熒光定量PCR數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行苦蕎TCP基因的差異表達(dá)分析。本研究發(fā)現(xiàn)FtTCP3、FtTCP6、FtTCP12和FtTCP13在干旱脅迫和鹽脅迫處理后的表達(dá)量均發(fā)生變化，F(xiàn)tTCP6、FtTCP12和FtTCP13在干旱脅迫下的表達(dá)量明顯降低，在鹽脅迫下，F(xiàn)tTCP6和FtTCP12的表達(dá)下降顯著；FtTCP3基因表達(dá)量在鹽脅迫和干旱脅迫下均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)且在處理6 h時(shí)表達(dá)量最高。這說(shuō)明FtTCP3、FtTCP6、FtTCP12和FtTCP13均在不同程度上響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫，推測(cè)苦蕎TCP基因家族在響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫下發(fā)揮作用。

4結(jié)論

本研究從苦蕎的全基因組中鑒定出28個(gè)苦蕎TCP基因家族成員，分屬于5個(gè)亞家族?；虮磉_(dá)分析表明，苦蕎TCP家族成員具有明顯的組織特異性，qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)tTCP3、FtTCP6、FtTCP12、FtTCP13在不同程度上響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫，推測(cè)苦蕎TCP基因可能參與調(diào)控苦蕎的干旱和鹽等逆境響應(yīng)過(guò)程。本研究為了解TCP基因家族的進(jìn)化和功能提供了新的見(jiàn)解，對(duì)研究苦蕎抗逆性和生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的指導(dǎo)作用。

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（責(zé)任編輯鄧斯麗）