摘要： 為揭示赤皮青岡葉色黃化變異機制，該研究以赤皮青岡葉色變異植株和正常植株的葉片為試驗材料，采用超高效液相色譜串聯質譜法和高通量RNA測序技術分別進行代謝組和轉錄組分析。結果表明：（1）代謝組在正離子（POS）、負離子（NEG）模式下分別檢測出正常植株和突變體之間存在257個和357個顯著差異代謝物（SCMs），其中槲皮素、白矢車菊素、楊梅素等多種黃酮類化合物及其糖苷衍生物（吡喃酮啡肽A、異鼠李素3-葡糖苷酸等）在突變體中顯著上調，而葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素等色素含量則顯著下降。（2）轉錄組測序檢測出4 146個差異表達基因（DEGs），其中1 711個基因上調表達，2 435個基因下調表達。（3）KEGG富集分析表明，SCMs和DEGs顯著富集到光合作用、卟啉與葉綠素代謝、類黃酮生物合成等途徑。綜上表明，突變體葉色黃化可能是受到葉綠素合成受阻、葉綠體發(fā)育異常及黃酮物質合成增加等因素的綜合影響。此外，MYB和bHLH家族基因在突變體中顯著上調，證實該兩類轉錄因子參與調控類黃酮生物合成。該研究結果為植物黃化突變的分子機制研究提供了新的見解，也為葉色功能基因挖掘與園林植物育種工作提供了參考。

關鍵詞： 赤皮青岡， 葉色突變體， 黃化， 代謝組， 轉錄組

中圖分類號： Q943文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1319-18

Combined metabolome and transcriptome analysesreveal the mechanism of etiolated mutantleaves of Quercus gilva

LIN Li1， HE Yueqiu1， WANG Hao2， LU Yunfeng2， WANG Jianjun2， HUANG Huahong3

（ 1. School of Landscape Ecology， Ningbo City College of Vocational Technology， Ningbo 315199， Zhejiang， China; 2. Ningbo Agricultural TechnologyPromotion Station， Ningbo 315100， Zhejiang， China; 3. Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China ）

Abstract： In order to reveal the etiolation mechanism of gold-coloured mutant leaves of Quercus gilva， a naturally-occurring leaf-color mutant was used as experimental materials， and the metabolome and transcriptome of mutant leaves and normal green leaves were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography-Q （UHPLC-Q） Exactive HF-X and high-throughput RNA sequencing， respectively. The results were as follows： （1） A total of 257 and 357 significantly changed metabolites （SCMs） were respectively identified under the positive ion （POS） mode and the negative ion （NEG） mode. Compared with green leaves， the content of some flavonoids such as quercetin， leucocyanidin， myricetin and their glucoside derivatives （pyranodelphinin A， isorhamnetin 3-glucuronide， etc. ） increased significantly in mutant leaves， but the content of chlorophyll a， chlorophyll b， and carotenoids decreased significantly. （ 2 ） A total of 4 146 differentially expressed genes （DEGs） were detected， of which 1 711 were up-regulated and 2 435 were down-regulated. （ 3 ） KEGG enrichment analysis showed that SCMs and DEGs were mainly enriched in photosynthesis， porphyrin and chlorophyll metabolism， and flavonoid biosynthesis. In conclusion， the inhibition of chlorophyll synthesis， chloroplast developmental abnormalities and promotion of flavonoid synthesis were the main factors driving the leaf etiolation in the mutant Q. gilva. In addition， the genes of the MYB and bHLH families were significantly up-regulated in mutant leaves， confirming these two types of transcription factors were involved in regulating flavonoid biosynthesis. This study provides new molecular insights for the phenomenon of leaf etiolation， and also provides the reference for exploring leaf color-related functional genes and breeding of landscape plant.

Key words： Quercus gilva， leaf-color mutant， etiolation， metabolome， transcriptome

葉色突變是指植物在生長發(fā)育過程中發(fā)生的葉色變化現象（劉新亮等，2017）。葉色突變易于鑒別，Gustafsson最早將其分為條紋、斑點、淺綠、黃化和白化5類（Gustafsson，1942），此后Manjaya 和 Nandanwar（2007）又進一步細分出黃綠、紫葉、類病斑等類型。黃化是其中一種重要的突變類型，黃化突變體常被用于植物光合生理（張晨禹等，2019）、葉綠體超微結構（李淑培等，2023）、葉綠素生物合成（Zhu et al.，2014）等研究。此外，黃化突變在育種領域也有重要應用，許多“金葉”類園林植物品種都來自黃化突變，如‘金葉國槐’（Sophora japonica ‘Aurea’），‘中華金葉榆’（Ulmus pumila ‘Jinye’），‘金葉雞爪槭’（Acer palmatum ‘Aurea’）等。目前，有關植物葉色黃化的研究集中于少數模式植物和一些重要的農作物，比如擬南芥（Arabidopsis thaliana），水稻（Oryza sativa），黃瓜（Cucumis sativus）等（Li et al.，2012；Maekawa et al.，2015；熊興偉等，2023）。在園林植物中，僅在黃山欒樹（Koelreuteria bipinnata var. integrifoliola）（Lyu et al.， 2017），銀杏（Ginkgo biloba）（Li et al.， 2019），雜交構樹（Broussonetia kazinoki × B. papyrifera）（Wang et al.， 2022）等少數植物中有過報道。

近年來，高通量測序技術被廣泛用于生物組學研究，能夠從分子層面揭示生物現象和生物過程的發(fā)生機制（熊興偉等，2023）。并且，通過多組學的聯合應用，可以更加直觀地反映機體的變化水平，為生物體靜態(tài)和動態(tài)的變化提供更為深入和廣闊的研究視野（陸小雨等，2020）。Lyu等（2017）通過高通量測序技術，從黃山欒樹品種‘金焰彩欒’（Koelreuteria bipinnata var. integrifoliola ‘Jinyan’）中檢測出9個葉綠素代謝和14個類胡蘿卜素生物合成的關鍵基因。Wang等（2022）采用多組學方法對雜交構樹的黃葉突變體進行研究，揭示了金黃葉色表型的形成與光合色素的含量與比例變化以及葉綠體結構和功能缺陷有關。Yamashita等（2021）對茶樹黃化品種（Camellia sinensis ‘Koganemidori’）的葉綠素代謝和氨基酸積累機制進行了探究，表明供試品種的黃化表型是由于葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關基因缺乏所致，高氨基酸則源于代謝相關基因的上調表達所引起的廣泛蛋白質降解。Luo等（2022）采用轉錄組和代謝組聯用技術，揭示了甘蔗葉色黃化現象與葉綠素合成途徑減少、光合基因表達下降、金屬離子調控功能障礙以及次生代謝物質改變等因素有關?？偠灾?，植物葉色黃化與葉綠素代謝相關基因的突變或表達受阻有重要關系。此外，葉色黃化也會受到花青素、類胡蘿卜素等其他色素代謝變化的綜合作用（林馨穎等，2022）。

赤皮青岡（Quercus gilva）為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus）常綠喬木，主要分布于我國南方海拔300～1 500 m的山林地帶（中國科學院中國植物志編輯委員會，1998）。其木材質地堅硬，紋理細膩，是優(yōu)良的硬木用材樹種，也可用于低山丘陵混交造林、林下補植和園林綠化（歐陽澤怡等，2021；秦之曠等，2023）。本研究團隊于2016年在寧波海曙溪下育苗基地發(fā)現一株赤皮青岡播種變異株，其成熟葉片為黃色，新葉金黃色，枝干明黃色，并于2018年底通過嫁接繁殖多株材料，其特異性狀已連續(xù)4年表現穩(wěn)定。本研究以赤皮青岡黃化突變植株和正常植株的葉片為研究材料，采用代謝組和轉錄學聯用技術同時結合生理生化測定，擬探討：（1）赤皮青岡變異植株金黃葉色表型形成的生理機制；（2）變異植株葉色黃化的轉錄調控機制。本研究可為金葉系園林植物的選育和遺傳改良提供參考依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

以赤皮青岡黃化（突變體）植株（yellow leaf，YL）和正常植株（no yellow leaf，NYL）為研究材料，兩種材料均種植于寧波市農業(yè)技術推廣總站林特基地（121°42′24″ E、29°48′46″ N）。2021年8月采集兩種植株葉片樣品（圖1），置于液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 代謝組分析

1.2.1 代謝物提取稱取50 mg樣品至離心管，加入400 μL的甲醇∶乙腈（V/V=1∶1，含內標）提取液。用冷凍組織研磨儀（Wonbio-96c，上海萬柏生物科技有限公司）進行研磨，提取液靜置后在4 ℃條件下13 000 g離心15 min，之后取上清液進行上機分析。YL組和NYL組各設置6個生物學重復。每個樣品取20 μL上清液，混合后用于質控分析。

1.2.2 代謝物檢測利用Thermo Fisher Scientific超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）串聯傅里葉變換質譜（Q Exactive HF-X）進行LC-MS分析。色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm；Waters，USA）。液相條件：流動相A為95%水 + 5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B為47.5%乙腈 + 47.5%異丙醇 + 5%水（含0.1%甲酸）。洗脫梯度如下。正離子模式：0 min，A/B（V/V）為100∶0；3.0 min，為80∶20；4.5 min，為65∶35；5.0 min，為0∶100；6.3 min，為0∶100；6.4 min，為100∶0；8.0 min，為100∶0。負離子模式：0 min，A/B（V/V）為100∶0；1.5 min，為95∶5；2.0 min，為90∶10；4.5 min，為70∶30；5.0 min，為0∶100；6.3 min，為100∶0；6.4 min，為100∶0；8.0 min，為100∶0。柱溫40 ℃；進樣量3 μL；流速0.4 mL·min-1。質譜條件：電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓3 500 Ｖ（正模式）和-3 500 Ｖ（負模式）；加熱溫度425 ℃；毛細管溫度325 ℃；鞘氣流速50 Arb；輔助氣流速13 Arb；掃描范圍70 ～ 1 050 m/z；一級分辨率60 000；二級分辨率7 500；碰撞能分別為20、40、60 eV；采用質譜連續(xù)掃描采集數據。

1.2.3 數據分析將原始數據導入Progenesis v2.2軟件（Waters，USA），通過與HMDB、METLIN等代謝數據庫進行比對鑒定代謝物。利用R軟件包進行代謝組數據分析和熱圖制作，對兩組樣品進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），得到模型的變量權重值（variable important in projection，VIP），以VIP > 1，P<0.05且FC（fold change）>1.10或FC < 0.91為標準篩選組間的顯著差異代謝物（significantly changed metabolites，SCMs），通過與KEGG數據庫進行代謝途徑富集。

1.3 轉錄組測序與數據處理

1.3.1 轉錄組測序及文庫構建采集YL和NYL的新鮮葉片，參考陸小雨等（2020）方法進行RNA提取和質控處理。采用TruseqTM RNA sample prep Kit（Illumina）的方法構建文庫。用帶Oligo（dT）的磁珠分離mRNA；將mRNA隨機打斷，在SMART逆轉錄酶（SMARTScribeTM Reverse Transcriptase）作用下合成cDNA第1條鏈，利用RNaseH將RNA鏈降解，合成cDNA第2條鏈；通過End-Repair Mix將雙鏈cDNA補齊，其3′末端加A處理后連接測序接頭；將cDNA進行PCR富集，利用AMPure XP beads純化產物；經過TBS-380（Picogreen）定量，按數據比例混合上機；測序時通過cBot平臺完成橋式PCR擴增，生成簇（clusters），利用IIlumina Noveseq 6000平臺完成轉錄組測序，構建Illumina PE文庫（讀長2 bp × 150 bp）。

1.3.2 數據處理將測序得到的圖像信號經CASAVA堿基識別轉換為原始數據（raw data），經過質控獲得高質量的干凈數據（clean data）。采用無參考基因組的轉錄組分析，通過Trinity v2.8.5軟件（Grabherr et al.， 2011）將Clean reads拼接成重疊群（contig）和單一序列（singleton）。此后，利用TransRate v1.0.3（Smith-unna et al.， 2016）和CD-hit v4.5.7（Li & Godzik，2006）對初始組裝序列進行優(yōu)化過濾，并利用BUSCO v3.0.2軟件（Simo et al.， 2015）再次評估，得到后續(xù)分析的最終轉錄本。

將轉錄本與6大數據庫（NR、Swiss-Prot、Pfam、eggNOG、GO和KEGG）比對以獲取注釋信息。通過RSEM v1.3.1軟件（Li & Pewey， 2011）計算基因的TPM值（transcripts per million reads，每百萬讀段中來自于某轉錄本的讀段數），利用DESeq2 v1.24.0軟件（Michael et al.， 2014）篩選2個組的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），將閾值差異倍數FC ≥ 2且修正P值（P adjust）< 0.05作為篩選標準。以P adjust < 0.05為標準，采用Goatools v0.6.5軟件（Klopfenstein et al.， 2018）進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，篩選參與葉色變化的關鍵基因。

1.3.3 代謝物與基因相關性分析采用Prism 8.0（GraphPad，USA）軟件進行SCMs與DEGs的皮爾森（Pearson）相關性分析。以相關性系數|r| ≥ 0.8且P < 0.05為閾值，得到SCMs與DEGs的分子間相互作用關系數據。

1.3.4 RT-qPCR驗證選用8個DEGs進行RT-qPCR來檢驗轉錄組數據的可靠性，利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物（表1）。以CACs（Accession number：ID6728500）為內參基因（Marum et al.， 2012）。設置3個生物學重復。將熒光定量表達水平進行Log2轉換，與對應基因的轉錄組表達豐度進行比較。

1.4 葉綠素含量測定

取YL和NYL的新鮮葉片，經過稱量、研磨和過濾后，參照張麗霞等（2021）的方法來測定兩組葉片中的葉綠素含量。設置3個生物學重復。

1.5 光合參數測定

采用CI-340便攜式光合作用測定儀（CID，USA）對YL突變體和NYL植株葉片的凈光合作用、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率等光合參數進行測定。設置3個生物學重復。

2結果與分析

2.1 代謝組測序結果與分析

2.1.1 代謝組的多元統(tǒng)計分析對YL和NYL兩組樣本在正、負離子模式下的UHPLC-Q Exactive HF-X數據進行代謝物組成的多元統(tǒng)計分析。PCA分析結果顯示，正離子模式下第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別占總變量的40.60%和19.10%，負離子模式下第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別占總變量的37.30%和24.10%（圖2：A，B）。OPLS-DA分析結果（圖2：C，D）顯示，兩種離子模式下差異代謝物R2值均高于Q2值，并且Q2與Y軸截距小于0，說明樣本數據描述良好。

在正、負離子模式下共鑒定出614個SCMs，其中，正離子模式下257個，上調的有148個，下調的有109個，負離子模式下357個，上調的有147個，下調的有210個（圖2：E，F）。

2.1.2 主要的SCMs分析從614個SCMs中篩選出相對含量前30的差異代謝物。由表2可知，黃酮類化合物有9種，均在YL組表達上調，以吡喃酮啡肽A上調最為顯著，上調了2.28倍，槲皮素3-O-（6″-乙酰葡萄糖苷）也上調了1.55倍；5種核苷及其衍生物在YL中有差異積累，其中2種嘧啶核苷顯著上調，3種嘌呤核苷顯著下調；9種脂類代謝物中，有5種在YL中上調，主要為異戊烯醇脂類；2種有機酸中，1種顯著上調，另1種顯著下調。

2.1.3 SCMs的KEGG通路分析將YL和NYL的SCMs進行KEGG富集分析，共富集到66條通路，主要包含甘油磷脂代謝、輔助因子生物合成、類黃酮生物合成、ABC轉運蛋白、異黃酮生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝等13條代謝通路（圖3）。其中，黃酮類生物合成富集的SCMs最多，包括類黃酮生物合成富集12個、異黃酮生物合成富集7個、黃酮和黃酮醇生物合成富集4個，說明黃酮類物質可能與YL葉色黃化有關。此外，甘油磷脂代謝、輔酶合成代謝、ABC轉運蛋白、氨基糖和核苷酸糖代謝、苯丙烷生物合成分別富集了17、12、7、6、4個代謝物。

2.2 轉錄組測序結果與分析

2.2.1測序質量分析對NYL和YL材料的RNA進行轉錄組測序，質控后共獲得44.26 Gb干凈數據（clean data）（表3）。各樣品的干凈序列（clean read）條數在43 864 122和56 594 944之間，Q20值在97.61%和97.79%之間，Q30值在93.03%和93.49%之間，GC堿基占比在44.49%～44.99%之間，滿足于后續(xù)分析要求。

2.2.2 差異表達基因統(tǒng)計從YL和NYL的樣品中分別鑒定了46 391個和48 018個表達基因，其中16 699個和15 072個基因分別在YL和NYL中特異表達（圖4：A）。以NYL為對照組，在YL中共檢測到4 146個DEGs，其中1 711個上調，2 435個下調（圖4：B）。

2.2.3 DEGs的GO功能分析GO分析表明，YL和NYL的3 612個DEGs（P < 0.05）顯著富集到12個生物學過程、14個細胞組分和2個分子功能條目（圖5）。在生物學過程中，富集基因最多的是前體代謝產物和能量產生，其次為光合作用、色素生物合成過程、色素代謝過程、卟啉化合物生物合成過程等，涉及過程多與光合作用或葉綠素合成有關，以下調基因為主，也有少數與磷酸脫氫酶、質體丙酮酸激酶、葡萄糖基轉移酶及二氫黃酮醇還原酶相關的代謝途徑發(fā)生了不同程度上調。在細胞組分中，富集最多的GO條目是質體和葉綠體，其次為類囊體膜、光合膜、葉綠體類囊體膜等，均以下調基因的數目較多。在分子功能中，存在顯著差異的代謝途徑最少，僅有四吡咯結合和葉綠素結合，均以下調基因居多，其中葉綠素結合途徑當中的下調基因占總數的90%以上。GO功能富集分析表明，YL的葉色黃化突變與光合作用、葉綠素代謝等過程有密切關系。

2.2.4 差異代謝途徑的KEGG富集分析KEGG富集分析結果顯示，共有744條DEGs被注釋到KEGG通路，其中192條基因顯著富集到植物-病原體相互作用、光合作用、乙醛酸及二羧酸代謝等

12個過程（表4）。與光合作用相關的途徑有5種，具體如下：光合作用-天線蛋白質富集因子最高，為0.666 7，該通路注釋到10個基因，全部為捕光葉綠素蛋白復合體（light-harvesting chlorophyll protein complex，LHC）編碼基因；富集到光合作用的基因有23個，主要涉及光系統(tǒng)的反應中心復合物（reaction-center complex，RCC）；富集到光合生物碳固定途徑的有16個，包括磷酸丙糖異構酶（triosephosphate isomerase，TIM）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPA）等關鍵酶的編碼基因；富集到卟啉和葉綠素代謝的有12個；富集到乙醛酸及二羧酸代謝的有22個基因。此外，一些DEGs也參與了類黃酮生物合成、花青素生物合成、氨基酸代謝、苯丙烷生物合成等途徑。

2.2.5 差異轉錄因子鑒定與分析轉錄因子因與功能基因調控區(qū)域結合而影響基因表達，進而會對許多生物學過程產生影響（劉玉飛等，2022）。

對4 146個DEGs中的轉錄因子基因進行鑒定，共篩得39個轉錄因子相關基因，屬于15個家族（圖6）。其中，差異基因數目最多的是MYB家族（8個DEGs），AP2/ERF和bHLH次之，分別有5個和4個，WRKY、bZIP和SBP則都有3個。15個轉錄因子家族中， WRKY、GRAS、AP2/ERF和C2H2以下調基因居多，其他則以上調為主。

2.2.6 DEGs的RT-qPCR驗證分析選取8個DEGs進行qPCR驗證，結果（圖7）表明，熒光定量表達與轉錄組基因表達的變化趨勢一致，證實轉錄組數據可靠。

2.3 YL的DEGs和SCMs關聯分析

2.3.1 色素代謝相關DEGs和SCMs的關聯分析植物葉片顏色主要由葉綠素、類胡蘿卜素、花青素等植物色素決定（林馨穎等，2022）。通過測定赤皮青岡YL和NYL的葉綠素和類胡蘿卜素含量，發(fā)現YL中葉綠素a（0.35 mg·g-1）、葉綠素b（0.31 mg·g-1）、總葉綠素（0.66 mg·g-1）以及類胡蘿卜素（0.05 mg·g-1）的含量都較NYL（分別為2.38、1.49、3.87、0.44 mg·g-1）顯著下降。此外，葉綠素a/b的比值也顯著降低（圖8），表明YL可能受到環(huán)境脅迫（Sun et al.， 2022）。該比值的變化會造成葉綠素a對不同波長吸收的改變，進而對葉色產生影響（李麗菁等，2022）。

在葉綠素合成途徑中，谷氨酸-tRNA還原酶（glutamyl-tRNA reductase，HemA）、尿卟啉原脫羧酶（uroporphyrinogen decarboxylase，HemE）、原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，HemF）、原葉綠素酸酯氧化還原酶（protochlorophyllide oxidoreductase，POR）等9種酶的相關DEGs都出現下調表達，其中編碼HemE的基因下降80%（4/5），編碼POR的2個基因表達量下調超過66.7%（2/3），編碼HemA、HemB（δ-aminolevulinic acid dehydratase）、DVR（divinyl protochlorophyllide a 8-vinyl-reductase）和ChlI（Mg-chelatase subunit ChlI-1）的基因表達下調都均約50%（圖9：A）。

類胡蘿卜素也是參與植物光合作用的主要色素之一。YL中類胡蘿卜素含量［（0.056 1±0.008 9）mg·g-1］較NYL（0.441 5±0.083 0 mg·g-1）顯著減少。在類胡蘿卜素生物合成途徑中（圖9：B），八氫番茄紅素合酶（phytoene synthase，PSY）是該途徑的第1個合成酶，編碼該酶基因的表達量下降了80%（4/5），其顯著下調會對后續(xù)通路產生重要影響。番茄紅素ε環(huán)化酶（lycopene ε-cyclase，LCYE）是葉黃素代謝途徑中的關鍵酶，催化線性的番茄紅素環(huán)化形成胡蘿卜素，再進一步合成葉黃素。LCYE基因的表達量也出現顯著下降，下調約80%（4/5），會對葉黃素生物合成產生影響，進而影響突變體的葉色表現。

類黃酮合成的起始代謝物為對香豆酰輔酶A（p-coumaroyl-CoA），通過苯丙烷生物合成途徑產生。在YL組中，編碼4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate-CoA ligase）的基因 4CL表達上調（圖9：C），但并未對香豆酰輔酶A的含量形成顯著影響。在類黃酮生物合成初期階段，編碼查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）和查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）的基因表達顯著上調，導致柚皮素查爾酮（naringenin chalcone）和柚皮素（naringenin）在YL中積累增多（FC = 1.05）。在此后的步驟中，許多關鍵酶的基因表達水平也顯著上調，其中黃酮醇合酶（flavonol synthase，FLS）的基因表達量上調了6.98倍，類黃酮3′-單加氧酶（flavonoid 3′-monooxygenase，F3′H）的基因表達上調了5.77倍，二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydrofla-vonol-4-reductase，DFR）的基因表達水平也顯著上調了4.44倍。這些基因的表達上調，與YL中槲皮素（quercetin）、白矢車菊素（leucocyanidin）、楊梅素 （myricetin） 在內的多種黃酮類化合物的積累具有較強的相關性（|r| ≥ 0.8）（圖9：D；圖10）。

2.3.2 光合作用相關DEGs和SCMs的關聯分析在光合作用途徑中，共有28個編碼PS I、PS Ⅱ和LHC核心蛋白的DEGs表達水平發(fā)生變化（圖11）。其中，與PS I反應中心相關的8個DEGs，都在YL中表現下調。與PS Ⅱ反應中心相關的10個DEGs，只有編碼PS Ⅱ反應中心D1蛋白（photosystem Ⅱ P680 reaction center D1 protein）的psbA基因上調，5個PS Ⅱ放氧增強蛋白（photosystem Ⅱ oxygen-evolving enhancer protein）和4個不同分子量蛋白的DEGs都表現為下調。此外，編碼葉綠素a/b結合蛋白的10個基因（LHCA 1、LHCA 2-1、LHCA 2-2、LHCA 4、LHCB 1-1、LHCB 1-2、LHCB 2、LHCB 4、LHCB 6、LHCB 7）在YL葉片中下調表達。綜上結果表明，下調的與光合作用有關的編碼基因對YL葉片中葉綠體的發(fā)育有影響，這與YL組葉片葉綠素含量降低的情況相符。葉綠素含量減少，引起YL組光合速率下降（表5）。

3討論

3.1 葉綠素合成受阻和葉綠體發(fā)育異常導致YL葉色黃化

葉色是植物的一個重要性狀，其形成涉及較多復雜的生物學過程（Wang et al.， 2022）。在高等植物中，葉色表現主要決定于葉綠素代謝過程（吳硯農等，2021），通常是因基因突變引起的葉綠素合成受阻或降解加速，導致植株葉色黃化（朱美玉，2020）。在YL突變體的葉綠素合成過程中，共有HemA、HemB、HemE、ChlI、POR等9種酶的基因下調表達，涉及從L-谷氨酰-tRNA到葉綠素酸酯合成的大多數過程。其中， HemA催化L-谷氨酰-TRNA（L-glutamate-TRNA）還原，是調控葉綠素合成的第一個限速反應（Zhao et al.， 2014）。HemB則參與δ-氨基乙酰丙酸（δ-aminolevulinate）向膽色素原轉化，也是葉綠素合成的關鍵步驟（Yang et al.， 2015）。HemA和HemB基因在YL中的表達量均下調約50%，推測是由于該兩個前端基因的顯著下調導致葉綠素合成的前體物質減少，引起后續(xù)反應受阻，進而使葉片整體變色。若突變發(fā)生于葉綠素合成的后期基因，則突變體通常形成條紋或斑點狀（Sakuraba et al.， 2015）。例如，HemE基因突變會導致玉米（Zea mays）葉片出現病斑（Hu et al.， 1998），HemF基因突變則會引起玉米葉片黃化壞死（Williams et al.， 2006）。此外，ChlI基因表達下調也可能引起YL葉色黃化。ChlI是鎂離子螯合酶（Mgch）的三個亞基之一，Mgch則是葉綠素合成途徑（鎂分支）中的第一種酶，也是一種關鍵的限速酶（羅莎等，2015）。已有研究表明，Mgch亞基編碼基因ChlI、ChlD的表達會受該酶底物濃度的影響（Zhang et al.， 2006）。在YL黃化突變體中，ChlI基因表達量下調約50%，推測可能是由于其前體—原卟啉IX（protoporphyrin IX）含量降低所致。并且，該過程也可能進一步抑制后續(xù)反應，最終導致YL組葉綠素含量顯著減少。此外，YL中類胡蘿卜素含量的顯著下降，對突變體黃化現象的形成也有一定影響。但是，突變體中葉綠素與類胡蘿卜素的比值（Chl/Car）未發(fā)生顯著改變，兩組比值分別為8.21和8.31，說明Chl/Car比值對YL的黃葉表型影響不大。

葉綠體結構異常也可能導致植株葉色黃化（江新鳳，2021）。在YL突變體中，有33條與光合作用相關的DEGs表達水平發(fā)生變化，其中28條為PS I、PS Ⅱ的RCC和LHC的編碼基因。Psa和Psb家族中許多基因的下調表達，可能導致PS Ⅰ和PS Ⅱ中相關蛋白的功能受阻。已有研究證實，PS Ⅱ蛋白復合物的顯著下調會引起不良基粒的堆疊（熊興偉等，2023）。LHC與色素結合起到吸收和傳遞光能的作用，并能實現光保護，其表達下降會導致葉綠體中基粒堆積異常，引起黃葉表型（Kim et al.， 2009）。在對水稻黃葉突變體的研究中，Wu等（2007）發(fā)現葉綠體發(fā)育相關基因以及PS Ⅱ蛋白復合體基因的表達都會受葉綠素合成中間產物的調控。在擬南芥研究中，LHCB基因的表達受到葉綠素合成相關酶（如Mgch）的反饋調節(jié)（Mochizuki et al.， 2001）。由此推測，葉綠素合成途徑受阻，其中間產物和相關酶的含量發(fā)生變化，從而抑制葉綠體光系統(tǒng)中RCC和LHC的基因表達，影響類囊體膜結構的形成，進而導致葉綠體發(fā)育異常、葉色黃化。此外，葉綠素缺乏與葉綠體發(fā)育異常，也導致YL突變體捕光能力下降，對光合作用產生不良影響。

3.2 類黃酮物質合成是YL葉色黃化的物質基礎

采用非靶向代謝組（LC-MS）分析，在YL組中共檢測到614個SCMs，主要涉及黃酮類、氨基酸、氨基糖或核苷酸糖等。黃酮類物質中的SCMs數量最多，有23個，包括白矢車菊素、楊梅素、槲皮素等類黃酮化合物及其糖苷衍生物。其中，吡喃酮啡肽A在YL突變體中上調倍數最大，達2.28倍。該物質最早發(fā)現于黑加侖種子提取物中（Lu et al.， 2000），目前關于其合成途徑和形成機制尚不清楚。黃酮類等含氮化合物中形成SCMs的積累，表明YL突變體中與碳和氮相關的通路發(fā)生了代謝重編。在YL中，參與葉綠素合成、碳固定以及光合作用的DEGs主要表現為下調表達（HEMA、TIM、GAPA、LHC等），會造成光合作用受阻，進而導致下游的糖酵解、TCA循環(huán)等碳代謝過程受到抑制（宋建民等，1998）。糖酵解和TCA循環(huán)的中間體是黃酮類物質碳骨架的主要來源（劉健偉，2016），代謝速率下降會影響類黃酮的生物合成。然而，代謝組數據分析表明，兩個代謝通路的中間產物及相關酶的含量在YL中無顯著變化。并且，YL組中糖酵解途徑的丙酮酸激酶（pyruvate kinase）編碼基因表達上調了3.14倍，TCA循環(huán)中蘋果酸合酶（malate synthase）編碼基因表達上調達20.42倍，說明黃化突變促進了葉片中糖酵解和TCA循環(huán)的代謝。相同現象也在赤霞珠葡萄的黃化突變體中被發(fā)現，原因可能是黃化葉片對碳源和氮源的征調能力更強（陳迎春，2011），使得黃酮類物質合成的碳骨架供應充足。此外，由于葉綠素合成受阻，減少了對氮的消耗，因此氮積累也可能在一定程度上促進了黃酮類物質的合成與積累，并為YL葉色黃化表現的形成提供了物質基礎（江新鳳，2021）。

3.3 轉錄因子參與YL葉色黃化過程

轉錄因子對生物的生長發(fā)育具有重要的調節(jié)作用，許多種類還參與對非生物脅迫的應答（Sun et al.， 2022）。在YL中，轉錄因子富集最多的DEGs為MYB、AP2/ERF和bHLH。An等（2017）研究表明，MYB家族轉錄因子能夠介導類黃酮合成途徑中很多關鍵酶的轉錄，促進黃酮類物質產生。bHLH轉錄因子則被證實參與對環(huán)境脅迫的應答，并能協(xié)同MYB調控類黃酮生物合成（Liu et al.， 2018；Wang et al.， 2018）。在YL組中，CHS、CHI、F3H、FLS等類黃酮合成關鍵酶的基因表達上調，可能是受MYB和bHLH轉錄因子的調控。此外，AP2/ERF家族4個DEGs表達發(fā)生顯著改變，該基因家族主要參與強光照、高溫、強光等非生物脅迫的應激反應（Wu et al.， 2015）。WRKY、HSF等與逆境脅迫相關的DEGs也出現富集，表明YL黃化突變體可能受到環(huán)境脅迫。進一步分析脅迫條件發(fā)現，其可能源于強光或水分缺失。黃化突變體因缺少葉綠素而更容易遭受強光脅迫。江新鳳（2021）研究證實強光脅迫能誘導MYhak9i78fPCCEIEzw70uxjUAHF31MmJRCDd85UBGqsUA=B基因上調并參與植株黃化過程。此外，更快的蒸騰速率可能使YL遭受水分脅迫。YL的蒸騰速率是NYL的1.42倍，蒸騰速率過快易導致植株缺水（張麗霞等，2021）。因此推測，YL受到強光或缺水脅迫，誘導MYB、bHLH等轉錄因子表達上調并參與類黃酮的生物合成，促進黃酮類化合物的產生。

4結論

本研究通過代謝組和轉錄組聯用技術探索赤皮青岡葉色黃化的形成機制。結果表明，YL金黃葉色可能是受到葉綠素合成受阻、葉綠體發(fā)育異常以及黃酮類物質合成加強等因素的綜合作用。此外，在YL組還發(fā)現MYB和bHLH家族的基因表達水平顯著上調，證實了該兩類轉錄因子參與調控類黃酮的生物合成。本研究拓展了對赤皮青岡黃葉表型形成機制的認識，為更多“金葉”類型園林植物資源的選育工作提供了理論依據。

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（責任編輯李莉王登惠）