摘 要：棗瘋病在我國(guó)普遍發(fā)生，會(huì)造成棗園（棗樹(shù)）減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重威脅我國(guó)棗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本文從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)認(rèn)知分類(lèi)、活體培養(yǎng)保藏、檢測(cè)鑒定、致病機(jī)理共4個(gè)維度，系統(tǒng)地總結(jié)了1947年以來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)棗瘋病病原的研究，以期為今后棗抗病品種的培育、特效專(zhuān)效農(nóng)藥及綠色防控新技術(shù)的研發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：棗瘋??；植原體；鑒定分類(lèi)；活體保藏；致病機(jī)理

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-1038（2024）12-0069-08

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.12.012

Studies on the Identification and Pathogenesis of Jujube Witches’ Broom

REN Shanjun1， REN Ruoyu2

（1. Pingyuan County Natural Resources Bureau， Dezhou 253100， China; 2. Harbin Institute of Technology （Weihai）， College of Marine Science and Technology， Weihai 264209， China）

Abstract： Jujube witches’ broom （JWB） is a widespread disease in China， leading to reduced or even complete loss of yield in jujube orchards， posing a severe threat to the healthy development of the jujube industry in China. This paper systematically summarized and evaluated the research on the pathogen JWB in China since 1947 from four aspects： morphological and molecular biological identification， live culture preservation， detection and identification， and pathogenic， to provide a reference for the future development of disease-resistant varieties， specific and effective pesticides， and new technologies for green control.

Keywords： Jujube witches’ broom; phytoplasma; identification and classification; living preservation; pathogenic mechanism

棗瘋?。╦ujube witches’ broom，JWB）屬侵染性病害，有棗樹(shù)“癌癥”之稱(chēng)。患病棗樹(shù)常無(wú)花無(wú)實(shí)，枝條叢生，花器葉化，葉片黃化，造成棗園（棗樹(shù)）減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重威脅我國(guó)棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

棗瘋病在我國(guó)發(fā)生普遍，東起山東，西至新疆，北起遼寧，南到廣東。1950—1953年河北昌黎縣50%棗園發(fā)??；1955年山東鄒縣五區(qū)棗園幾乎全部發(fā)病，六區(qū)棗園70%～80%發(fā)病。20世紀(jì)70年代初，北京密云小棗產(chǎn)區(qū)被毀；80年代該病在河南內(nèi)黃、淇縣等地蔓延。河南扁核酸、灰棗、廣洋棗發(fā)病率分別是70%、71%、20%。滄縣‘金絲小棗’棗園年發(fā)病率在70%以上。陜西彬州市紅棗、疙瘩棗、晉棗染病率分別是22%、6%、17%。該病發(fā)生速度快，河南內(nèi)黃馬上鄉(xiāng)3年間發(fā)病率由零星發(fā)病發(fā)展到30%。2016年當(dāng)?shù)卮筇飾椘骄l(fā)病率為10%，最高21%。2014—2015年甘肅寧縣馬蓮河棗區(qū)暴發(fā)棗瘋病，遼寧凌源也有發(fā)生[1]。

自1962年到2024年7月，中國(guó)知網(wǎng)上發(fā)表的關(guān)于棗瘋病的學(xué)術(shù)期刊文章有700多篇，研究?jī)?nèi)容涵蓋棗瘋病發(fā)生危害、鑒定分類(lèi)、致病機(jī)理、抗病育種、組培育苗、藥劑研發(fā)及防控技術(shù)等方面。棗瘋病病原認(rèn)知分類(lèi)、活體培養(yǎng)保藏、檢測(cè)鑒定、致病機(jī)理等研究是選育抗病品種、開(kāi)展分子抗病育種、研發(fā)特效專(zhuān)效農(nóng)藥、防控新技術(shù)的前提和基礎(chǔ)，對(duì)控制棗瘋病發(fā)生蔓延有著重要意義。本文總結(jié)了上述內(nèi)容，以期為棗瘋病的綠色防控提出技術(shù)依據(jù)。

1 認(rèn)知和分類(lèi)

植物病原體是寄生于植物體內(nèi)能引發(fā)侵染性病害的生物。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)棗瘋病病原體認(rèn)知不斷深入，經(jīng)歷了由間接到直接，由寄主表征到病原本身、由形態(tài)學(xué)到分子生物學(xué)、由宏觀到微觀的發(fā)展歷程。

1.1 形態(tài)學(xué)認(rèn)知論

1.1.1 病毒推斷論

早期通過(guò)抗生素試驗(yàn)間接驗(yàn)證推斷。1947年季良在國(guó)內(nèi)調(diào)查發(fā)現(xiàn)了棗瘋病，1950年首先予以介紹。1964年王清和等[2]認(rèn)為棗瘋病系病毒引起。王焯等[3]用土霉素、四環(huán)素等治療該病成效明顯，間接證實(shí)了類(lèi)菌質(zhì)體（MLO）的存在。

1.1.2 MLO形態(tài)論

光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用開(kāi)啟了對(duì)棗瘋病病原體形態(tài)學(xué)上的認(rèn)知。1974年中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所從棗瘋病病葉中分離出類(lèi)似棒狀病毒的質(zhì)粒，認(rèn)為可能是該病病原體或病原體之一。陳作義等[4]在金絲小棗棗瘋病葉脈篩管中抽提并觀察到MLO，認(rèn)為該病原可能是MLO與病毒復(fù)合體。徐紹華[5]則從病枝超薄切片中觀察到了MLO。侯燕平等[6]觀察確定棗瘋病病原MLO的超微形態(tài)呈近圓形、橢圓形等晶格狀顆粒。

1.2 植原體分子論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)棗瘋病病原的認(rèn)識(shí)進(jìn)入分子生物學(xué)微觀時(shí)代，在分類(lèi)鑒定上取得重大突破。1992年第九屆國(guó)際菌原體組織大會(huì)提出將MLOs改名為Phytoplasmas（植原體），1994年“植原體”名稱(chēng)被正式使用。植原體是存在于植物韌皮部篩管細(xì)胞中，能引起植物黃化、叢枝、花變?nèi)~、矮縮或花器退化等癥狀，無(wú)細(xì)胞壁的病原微生物。

1.2.1 組水平分類(lèi)

微生物基因組16S rDNA（以下簡(jiǎn)寫(xiě)16Sr）、16S rRNA有良好的進(jìn)化保守性和適宜分析長(zhǎng)度及與進(jìn)化距離相匹配的變異性，能評(píng)價(jià)遺傳多態(tài)性，常被作為微生物分子序列的標(biāo)識(shí)、鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化分類(lèi)的可靠指標(biāo)。王海妮等[7]檢測(cè)認(rèn)定陜西、河北、山東棗瘋病病原歸屬于植原體16Sr V-B組。韓劍等[8]認(rèn)為，新疆棗瘋病阿克蘇株系（JWB-ASZ）、喀什株系（JWB-KHZ）棗瘋病植原體屬于16Sr V-B亞組。高靜濤等[9]用DNA標(biāo)記技術(shù)驗(yàn)證棗瘋病植原體屬于16S rDNA V-B，認(rèn)為其地域變異性較小。張曼等[10]鑒定新鄭灰棗棗瘋病植原體屬于16Sr V組。李鑫等[11]首次推斷遼寧大連地區(qū)棗瘋病病原屬16Sr V-B亞組。楊海旭等[12]研究認(rèn)為三倍體贊皇大棗棗瘋病病原屬于榆樹(shù)黃化組（16Sr V），與B亞組親緣關(guān)系最近。余賢美等[13-14]鑒定，棗瘋病植原體‘金絲4號(hào)’株系（JWB-Jinsi4，TA）、泰安圓鈴1號(hào)株系、泰安魯北株系、泰安大白鈴株系同屬于16Sr V-B組。

周張彬等[15]認(rèn)為安徽當(dāng)?shù)貤棷偛≈苍w屬于16Sr V-B組，但有生物學(xué)地域特異性。吳寬等[16]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陜西彬縣、佳縣、清澗縣3棗區(qū)的棗瘋病植原體屬于植原體16Sr Ⅴ-B亞組。林文力[17]研究認(rèn)為北京昌平地區(qū)棗瘋病植原體屬于榆樹(shù)黃化組16Sr V-B亞組。李靜霞[18]檢測(cè)得出，塔里木大學(xué)校園內(nèi)34年生贊皇棗樹(shù)植原體屬于16Sr V-B亞組阿拉爾株系（JWB-Alar）。

1.2.2 亞組水平分類(lèi)

在16S rRNA延伸因子tuf、核糖體蛋白基因rp、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因sec亞分子水平上，植原體變異更大、非同義突變更多，可對(duì)不同來(lái)源的植原體作亞組水平系統(tǒng)性精細(xì)分類(lèi)。

（1）tuf水平

在國(guó)內(nèi)，王海妮[19]首次報(bào)告棗瘋病植原體16S rRNA、tuf基因序列，初步認(rèn)為同一種病原的不同株系可能因其基因序列存在差異。楊洋[20]研究確認(rèn)大連棗瘋株系（JWB-DL）同屬于16Sr V-B亞組，因部分rRNA操縱子序列有差異，故屬于1個(gè)獨(dú)特種。田國(guó)忠等[21]驗(yàn)證，酸棗和栽培大棗植原體是同種致病菌。北京地區(qū)植原體16S rDNA基因與其它地區(qū)植原體株系差異不大，但其tuf基因地區(qū)差異較大，為在亞組水平上分類(lèi)提供了新理論依據(jù)。林文力等[22]研究得出，在tuf基因水平上，北京、河北地區(qū)棗瘋病植原體與陜西地區(qū)差異較大。韓劍等[23]同源比較認(rèn)為，在tuf水平上，新疆棗瘋病阿克蘇株系（JWB-ASZ）、喀什株系（JWB-KHZ）都屬于棗瘋病植原體16Sr V-B亞組。

（2）rp水平

核糖體蛋白質(zhì)（rp）參與構(gòu)成核糖體、DNA修復(fù)、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控和細(xì)胞分化等功能。吳寬等[24]首次報(bào)道陜西、寧夏、甘肅棗瘋病rp基因大小一致，據(jù)此將其歸類(lèi)到16Sr V-B組，把rp作為新的分類(lèi)依據(jù)。

（3）sec水平

硒半胱氨酸（sec）編碼是乳白密碼子，主要包括secY、secE、secG等3種不同的運(yùn)輸膜蛋白。在sec水平上，陳妮等[25]鑒定確認(rèn)山東臨沂植原體屬于secY" V-C亞組。

（4）多水平

在sec、rp、16Sr水平上，學(xué)者們開(kāi)展了更為精細(xì)化的系統(tǒng)分類(lèi)研究。在16Sr、rp、secY等3個(gè)水平上，陳妮等[26]鑒定認(rèn)為，山東省棗瘋病植原體分屬于16SrⅤ-B組、rp V-C亞組、secY" V-B亞組。王利平等[27]研究發(fā)現(xiàn)湖北JWB-Hubei植原體分離物，在16Sr水平上歸屬于16SrV-B亞組；在rp水平上分類(lèi)歸屬于rp V-C亞組。在rp、secY基因2個(gè)水平上，張磊等[28]把陜西、山西、山東棗瘋植原體分類(lèi)歸屬于16SrⅤ-B亞組。

在rp、secA、secY維度水平上，陳妮等[29]鑒定認(rèn)為，山東省11個(gè)地區(qū)的棗瘋病病原樣品變異更大，非同義突變更多，分屬于16Sr V-B、rp V-C、secY V-C亞組。廣州黃埔區(qū)棗瘋病植原體，從16Sr水平上屬于16Sr V-B；從secA水平上與JWB-ZY、JWB-BS親緣關(guān)系最接近[30]。

1.2.3 復(fù)合侵染

何放亭等[31]首次確認(rèn)棗瘋病系棗瘋病MLO和泡桐叢枝病MLO混合侵染。李婷婷等[32]在我國(guó)棗樹(shù)上首次發(fā)現(xiàn)16Sr V和16Sr I兩個(gè)組植原體復(fù)合侵染。但徐啟聰?shù)萚33]檢測(cè)了7個(gè)地區(qū)14個(gè)品種32個(gè)棗瘋病樣品都屬于榆樹(shù)黃化16Sr V-B亞組，不存在與其他病原混合感染，只是16S rDNA、SR、secY序列上有差異。因此是否存在復(fù)合侵染尚需深入研究。

2 活體培養(yǎng)保藏

活體培養(yǎng)保藏是植原體分類(lèi)鑒定、致病機(jī)理、抗性機(jī)理、分子育種、藥劑防效試驗(yàn)等的研究基礎(chǔ)。植原體僅能在活體寄主上繁殖保藏，定期繼代培養(yǎng)是保存棗樹(shù)與植原體共生體的關(guān)鍵技術(shù)。

2.1 分離、提取、富集純化

棗瘋病植原體的分離、提取、純化是活體培養(yǎng)保藏的前提和基礎(chǔ)。2015年后國(guó)內(nèi)開(kāi)展了植原體繼代培養(yǎng)試驗(yàn)。陳昱圻等[34]用超速離心法分離到植原體DNA。傅強(qiáng)等[35]用脈沖電泳方法+差速離心法也分離出其植原體DNA。劉玲雪等[36]用氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心法富集純化出其植原體DNA。但因其費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，培養(yǎng)基易受污染，或易產(chǎn)生管理失誤致使菌種被毀，故尚需研究改進(jìn)。

2.2 活體培養(yǎng)保藏

帶病原組織培養(yǎng)可間接保存棗瘋病病原。2013年侯曉杰等[37]恢復(fù)培養(yǎng)超低溫保存的棗瘋病植原體全部死亡，其可行性有待更多驗(yàn)證。2005年，田國(guó)忠等[38]在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)棗瘋病植原體分離物進(jìn)行組織培養(yǎng)、繁殖，保存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年，能較理想地長(zhǎng)期保存植原體株系（分離物）。

培養(yǎng)基成分的選擇是組織培養(yǎng)保藏植原體的基礎(chǔ)。葛宏等[39]建立了棗瘋病植原體組培苗保藏體系，認(rèn)為啟動(dòng)培養(yǎng)基最適的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合、增殖培養(yǎng)基組合、壯苗培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基分別是MS＋KT 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L、MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L、MS＋KT 2.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L、1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L。目前的研究只是初步的，尚無(wú)成功案例。

總體看，目前棗瘋病植原體尚不能直接人工培養(yǎng)、不易提純，體外活體培養(yǎng)保藏技術(shù)尚未成功，限制了分子生物學(xué)致病機(jī)制等研究。建立規(guī)范、有效、安全、簡(jiǎn)便的植原體組織培養(yǎng)保藏程序和技術(shù)迫在眉睫。

3 檢測(cè)和鑒定

3.1 間接觀察

20世紀(jì)60年代前后，觀察寄主器官的形態(tài)變化和應(yīng)用噴射、注射、灌注四環(huán)素等抑制試驗(yàn)間接研究，認(rèn)識(shí)棗瘋病病原。王清和[2]用11種化學(xué)藥劑處理?xiàng)棷偛〔∪~和健康葉，定性證明了病葉中病原體是病毒。但這些方法預(yù)見(jiàn)性差、檢測(cè)周期長(zhǎng)、觀察部位受限等，無(wú)法剔除潛隱性病毒干擾，準(zhǔn)確性差。

3.2 形態(tài)觀察

3.2.1 普通光學(xué)觀察

二十世紀(jì)六七十年代，在光學(xué)顯微鏡下觀察到棗瘋病病原體五角形晶體、棒狀質(zhì)粒結(jié)構(gòu)形態(tài)。王焯等[3]在顯微鏡下觀察到了患病金絲小棗葉脈中的MLO。盡管光學(xué)顯微鏡能直接觀察到寄主組織中棗瘋病病原微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，但技術(shù)程序復(fù)雜、不穩(wěn)定，觀察到組織少，特異性差。

3.2.2 電鏡觀察

20世紀(jì)80年代初，徐紹華[5]在電鏡下觀察到了棗瘋病枝超薄切片中的病原體MLO。1984年，史春霖等[40]用掃描電鏡觀察到病株韌皮細(xì)胞篩管中MLO呈大小不等的球狀體，認(rèn)為是觀察病株組織內(nèi)MLO分布情況的好方法。該方法能直接清晰地觀察細(xì)胞間正常的相互關(guān)系、病原結(jié)構(gòu)形態(tài)、較長(zhǎng)時(shí)間地保留細(xì)胞的原貌，但工序繁瑣、技術(shù)復(fù)雜。1994年陳功友等[41]從材料固定、脫水、浸透、包埋等方面對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)。1999年侯燕平等[6]應(yīng)用改進(jìn)技術(shù)15～16 h完成了對(duì)棗瘋病枝條不同部位組織、器官的超微觀察，更簡(jiǎn)便、更快速。劉永光[42]也在電鏡下觀察了泰安棗瘋病樣品。申仲妹等[43]應(yīng)用熒光顯微技術(shù)對(duì)越冬‘條棗’病枝中棗瘋病病原進(jìn)行了鑒定，能快速、便捷地進(jìn)行定量、定性判斷。

3.2.3 DPAI染色輔助觀察

4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DPAI）能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合并對(duì)其熒光染色。1993年田硯亭等[44]首次應(yīng)用DPAI染色法檢測(cè)到MLO。田國(guó)忠[45]把DAPI染色+PCR技術(shù)應(yīng)用于種苗和媒體昆蟲(chóng)的帶菌檢測(cè)。王秀伶等[46]應(yīng)用DPAI技術(shù)初步選定最佳枝條并進(jìn)行熒光顯微觀察。李成亮[47]應(yīng)用DPAI染色技術(shù)鑒定出新疆棗瘋病等6種植原體。DAPI能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，對(duì)活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色，輔助熒光顯微鏡觀測(cè)，但DPAI有毒性，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有潛在危害。

3.3 ELISA檢驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）是用酶標(biāo)準(zhǔn)體作用于酶對(duì)應(yīng)底物，以產(chǎn)生有色物質(zhì)為指標(biāo)，用比色法判斷特異抗原抗體反應(yīng)的血清學(xué)方法。1988年王振東等[48]制備了棗瘋病類(lèi)菌原體抗血清，認(rèn)為ELISA技術(shù)可用于棗瘋病病原間接鑒定研究。該方法有特異性、靈敏性、操作簡(jiǎn)便、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但干擾因素多、結(jié)果不夠可靠。

張學(xué)祥[49]建立了棗瘋植原體SecY蛋白ELISA檢測(cè)方法，李靜霞[18]用此法對(duì)塔里木大學(xué)校園內(nèi)棗樹(shù)病樹(shù)取樣檢測(cè)Sec A蛋白、Imp蛋白、rp S3蛋白、rpl22蛋白、rpl15蛋白、Sec Y蛋白，從中篩選相應(yīng)蛋白，為開(kāi)展血清學(xué)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。該方法可信度較高，但效價(jià)低。

3.4 單克隆檢測(cè)

單一B細(xì)胞克隆能產(chǎn)生高度均一、僅針對(duì)特定抗原的抗體。1990年，韓國(guó)安等[50]用單克隆抗體準(zhǔn)確、快速、靈敏檢測(cè)了棗瘋病MLO數(shù)量和移動(dòng)，成為其診斷、鑒定、流行、防治等有效手段。

3.5 核酸印跡檢測(cè)

16Sr DNA編碼序列在進(jìn)化上高度保守，常被用作植原體系統(tǒng)發(fā)育及分類(lèi)研究。1994年林木蘭等[51]用核酸雜交技術(shù)檢測(cè)泡桐叢枝病類(lèi)菌原體。2002年，王宇[52]用核酸印跡雜交法檢測(cè)到棗瘋病植原體（Candidatus phytoplasma ziziph）。該鑒定方法準(zhǔn)確、靈敏，但雜交因素影響標(biāo)記效率，有待于改進(jìn)。

3.5.1 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是應(yīng)用體外酶促反應(yīng)，把要擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物，經(jīng)過(guò)“高溫變性、低溫退火、引物PCR擴(kuò)增延伸”3步反應(yīng)循環(huán)合成特異DNA片段，實(shí)現(xiàn)DNA迅速擴(kuò)增，特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間。何放亭等[31]應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出MLO的16S rDNA片段。李永等[53]研制了PCR、nested-PCR技術(shù)及PCR快速檢測(cè)試劑盒。2011年余賢美等[14]以DNA粗提物為模板應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。總體來(lái)看，PCR、nested-PCR技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，適于病原低濃度時(shí)應(yīng)用，但有交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)特殊物種檢測(cè)受限。

3.5.2 RAPD檢測(cè)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）以DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)核苷酸序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)整個(gè)序列的基因組進(jìn)行分析。樊新萍等[54]用RAPD技術(shù)檢測(cè)到酸棗、辣椒棗、郎棗葉脈中棗瘋病植原體基因。該技術(shù)更快速、更有效，適用于不同品種植原體的檢測(cè)，但有無(wú)擴(kuò)增偏差、產(chǎn)物彌散分布或者單一色帶，不能辨認(rèn)，結(jié)果不穩(wěn)定，酚、氯仿等試劑容易造成DNA的損耗等問(wèn)題。

3.5.3 qPCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（quantitative real-time PCR，qPCR）是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，用熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次PCR擴(kuò)增循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。2010年侯立華等[55]建立了棗瘋病植原體拷貝數(shù)qPCR檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便高效，能定量、實(shí)時(shí)、直觀地判斷結(jié)果，靈敏性、特異性、精確性、安全性、重復(fù)性都很好。苑贊[56]首次建立并應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測(cè)植原體的含量和活性。2014年，韓劍等[57]優(yōu)化建立了棗瘋病植原體的TaqMan探針qPCR檢測(cè)方法，奠定了分子量級(jí)植原體檢測(cè)和病級(jí)分級(jí)基礎(chǔ)。

3.5.4 LAMP可視化檢測(cè)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）需要有針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物、1種鏈置換DNA聚合酶及在63 ℃左右等溫條件下保溫30～60 min。韓劍等[58]改進(jìn)設(shè)計(jì)了4條特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，建立了LAMP可視化檢測(cè)方法，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍，可通過(guò)肉眼觀察直接判定結(jié)果。該技術(shù)不依賴(lài)專(zhuān)門(mén)儀器設(shè)備，檢測(cè)成本低，適用于現(xiàn)場(chǎng)高通量快檢。于少帥[59]認(rèn)為多位點(diǎn)序列分析是全面檢測(cè)鑒定植原體及株系遺傳多樣性有效、可靠的方法。在此基礎(chǔ)上，王圣潔等[60]建立的棗瘋植原體Real-time LAMP檢測(cè)方法具有特異性、靈敏度、重復(fù)性、即時(shí)性、可溯源等特點(diǎn)，適于檢測(cè)田間隱性帶病株。

3.6 定向基因檢測(cè)

定向基因檢測(cè)有靶標(biāo)基因tuf檢測(cè)和TDK基因檢測(cè)。王圣潔等[6０]首次建立了植原體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能同時(shí)檢測(cè)3種16Sr V-B亞組，高效、特異、簡(jiǎn)便、成本較低，但可靠性有待驗(yàn)證。2023年，宋傳生等[6１]在國(guó)內(nèi)首次獲得了棗瘋病植原體胸苷激酶基因（TDK），認(rèn)為其適于棗瘋病植原體分子分類(lèi)、JWB-Heze TDK體外酶活性測(cè)定和抗體制備。植原體TDK基因比其16S rDNA基因的保守程度低，該方法尚需完善和改進(jìn)。

3.7 木材解剖檢測(cè)

2023年，劉子菁[62]解剖了兩組患有不同程度棗瘋病的棗樹(shù)木材，輔以木材化學(xué)檢測(cè)手段，認(rèn)為射線比量可作為棗樹(shù)感染植原體發(fā)病的關(guān)鍵木材解剖學(xué)因子。該方法宜于棗瘋病早期診斷關(guān)鍵因子篩選，但程序復(fù)雜、間接、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

4 致病機(jī)理

棗瘋病植原體侵染后能引起棗樹(shù)組織結(jié)構(gòu)、生理代謝、基因轉(zhuǎn)錄及菌根內(nèi)菌群等變化。侵染過(guò)程有3個(gè)階段：第1階段（嫁接0～2 WAG），植原體僅入侵到細(xì)胞外區(qū)域，DAPI染色鑒定不到植原體，輕微影響棗基因表達(dá)；第2個(gè)階段（嫁接后37～39 WAG），韌皮部中植原體群體增加，開(kāi)始顯著影響棗樹(shù)基因表達(dá)，DAPI藍(lán)色熒光更強(qiáng)、DEGs（差異表達(dá)基因）更多；第3個(gè)階段（48～52 WAG）JWB癥狀嚴(yán)重，摧毀了棗樹(shù)的防御系統(tǒng)，完成侵入過(guò)程，DAPI檢測(cè)觀察出少、弱的藍(lán)熒光，轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析（RNA-Seq）鑒定出較少的DEGs，JWB植原體的種群密度變小[63]。

4.1 侵染引起寄主變化

4.1.1 組織結(jié)構(gòu)改變

棗瘋病植原體侵染后引發(fā)棗樹(shù)葉片葉綠素含量下降、光合能力減弱。葉片黃化是寄主對(duì)植原體入侵的光合應(yīng)答模式，引起寄主早期過(guò)敏性壞死反應(yīng)。葉片厚度、角質(zhì)層和表皮細(xì)胞變薄，薄壁組織細(xì)胞顯著減少，葉脈組織排列紊亂，形成層明顯變形和減少，厚角細(xì)胞和晶體分泌細(xì)胞明顯減少，感染棗瘋病的棗樹(shù)光合能力僅1.1 μmol/（m2·s），遠(yuǎn)低于健康樹(shù)。

4.1.2 代謝功能改變

棗瘋病植原體侵染會(huì)觸發(fā)病株應(yīng)急反應(yīng)，花器、葉片、枝條、根的過(guò)氧化物酶（POD）酶活性、同工酶活性顯著高于健株，出現(xiàn)新酶帶、產(chǎn)生特異同工酶組分。李玲等[64]測(cè)序分析，健康、感病‘木棗’葉片組間基因表達(dá)差異集中表現(xiàn)在黃酮類(lèi)化合物、苯丙烷類(lèi)化合物、不飽和脂肪酸生物合成途徑，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，淀粉、蔗糖代謝和脂肪酸代謝等方面。

4.1.3 光合系統(tǒng)改變

光合系統(tǒng)進(jìn)行光合作用，依賴(lài)于光合酶催化作用。光合酶參與植物光合作用、生長(zhǎng)發(fā)育、抗病免疫、抗過(guò)氧化等過(guò)程。劉志國(guó)[65]首次獲得5個(gè)棗光合作用相關(guān)基因，認(rèn)為ZjRCA2起活化核酮糖-1，5二磷酸羧化酶/加氧酶的作用。從侵染中期開(kāi)始，感病品種光合色素含量明顯下降，后期顯著降低；與同品種健樹(shù)相比，嫁接侵染15周后感病品種光系統(tǒng)Ⅱ的光合活性（Fv/Fm、ΦPSII）和潛在活性（Fv/Fo）極顯著降低；受侵染的抗病品種光系統(tǒng)Ⅱ的光合活性在初期、中期始終顯著高于‘星光’嫁接到健樹(shù)上的對(duì)照，后恢復(fù)正常水平。

4.1.4 激素、保護(hù)酶改變

植原體侵染改變了棗樹(shù)體內(nèi)激素和保護(hù)酶合成相關(guān)的基因表達(dá)，激發(fā)其防衛(wèi)反應(yīng)。杜紹華等[66]發(fā)現(xiàn)，敏感品種組培苗內(nèi)源玉米素（ZT）含量高于抗病品種，接種植原體后內(nèi)源ZT含量水平極顯著下降。感病品種灰棗的過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶活性差異明顯。

4.1.5 氨基酸代謝改變

侵染后整個(gè)生長(zhǎng)季棗瘋病病葉中游離氨基酸代謝都維持在高水平。莽克強(qiáng)等[67]研究發(fā)現(xiàn)，棗瘋病病葉中游離氨基酸總量約是健康葉的10～15倍，谷酰胺、天門(mén)冬酰胺約是健康葉的4～5倍，精氨酸積累不正常，病毒嚴(yán)重干擾了病葉的代謝。

4.2 基因轉(zhuǎn)錄及互作

眾多學(xué)者開(kāi)展了植原體效應(yīng)因子與寄主間互作模式的研究。屈曉逸[68]預(yù)測(cè)出棗瘋病植原體的11種效應(yīng)因子，構(gòu)建了9種對(duì)應(yīng)的誘餌載體。效應(yīng)因子SJP1/2和CIN類(lèi)TCP轉(zhuǎn)錄因子ZjTCP2相互作用，擾亂了生長(zhǎng)素信號(hào)途徑，導(dǎo)致花器發(fā)育異常[69]。

MAPKKK（MAP激酶-激酶-激酶）是MAPK級(jí)聯(lián)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的啟動(dòng)激酶，在響應(yīng)棗瘋病植原體侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。倪靜[70]認(rèn)為，棗瘋病植原體致病因子Zaofeng 8能夠和棗TCP轉(zhuǎn)錄因子互作，引發(fā)病株矮化、小葉、花器發(fā)育不良等。李繼東等[71]鑒定認(rèn)為，ZjAP2*9、ZjERF49和ZjERF91是響應(yīng)棗瘋病植原體最重要轉(zhuǎn)錄因子。陳立川[72]發(fā)現(xiàn)，致病因子Zaofeng 3可以與大量MADS轉(zhuǎn)錄因子、少量TCP轉(zhuǎn)錄因子互作，間接調(diào)控TCP轉(zhuǎn)錄因子下游基因的表達(dá)，影響擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育。陳鵬[73]鑒定認(rèn)為，Zaofeng 6抑制ZjTCP7表達(dá)誘導(dǎo)叢枝病發(fā)生。劉偉等[74]認(rèn)為，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子可能是引發(fā)染病棗樹(shù)花器異常發(fā)育的關(guān)鍵基因。唐嫣[75]認(rèn)為，JWB157是引起花葉癥狀的效應(yīng)因子，而JWB406是引起叢枝癥狀的效應(yīng)因子。

2018年董雅容等[76]克隆了棗瘋植原體免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白基因IMP-DZ，構(gòu)建了JWB蛋白表達(dá)載體異源表達(dá)IPM蛋白。2019年高瑞等[77]認(rèn)為，IMP與FD-C系同一類(lèi)型免疫膜蛋白，承受了在進(jìn)化過(guò)程中來(lái)自寄主更大的選擇壓力。

植原體常借助分泌蛋白酶完成侵染和定殖。2023年，高小語(yǔ)[78]在國(guó)內(nèi)首次篩選確定了6個(gè)具有超敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）抑制功能的非典型分泌蛋白，能顯著上調(diào)程序化細(xì)胞死亡抑制因子，可能進(jìn)而抑制植物HR抑制因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

4.3 引起寄主菌根變化

棗瘋病植原體侵染，引起患病冬棗根部?jī)?nèi)生細(xì)菌菌群在屬水平上的降低。邱志偉等[79]從健康冬棗樹(shù)根內(nèi)分離出內(nèi)生細(xì)菌菌群分屬于6個(gè)屬18個(gè)菌株，從感病冬棗樹(shù)根內(nèi)僅分離出芽孢桿菌屬10株、假單胞菌屬7株。對(duì)于侵染后棗瘋病植原體與菌根之間的互作機(jī)制研究尚屬空白。

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收稿日期：2024-07-15

第一作者簡(jiǎn)介：任善軍（1974—），男，高級(jí)農(nóng)藝師，本科，主要從事果樹(shù)技術(shù)推廣工作