摘要：為發(fā)掘?qū)栈菸【‵usarium oxysporum f.sp.chrysanthemi，F(xiàn)oc）具有高效拮抗作用的生防菌株資源，有效防控菊花枯萎病，采用平板稀釋法從江蘇省鹽城市菊花產(chǎn)區(qū)杭白菊和金絲皇菊的根際土壤中分離獲得菌株，以平板對峙法和抑菌譜測定篩選具有高效拮抗作用的生防細菌，通過細菌形態(tài)觀察、生理生化測定和分子生物學(xué)分析對其進行鑒定，利用離體和盆栽試驗測定生防菌對菊花枯萎病的防治效果，并于室內(nèi)測定生防菌不同發(fā)酵液對Foc菌絲生長、孢子產(chǎn)量和萌發(fā)率的影響。結(jié)果顯示，從菊花根際土壤中共分離獲得393株細菌，有7株拮抗細菌對病原菌Foc的抑制率達55%以上，其中，菌株SFB-1對Foc的抑菌率最高，可達72.55%。經(jīng)鑒定明確SFB-1為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，且其還能顯著抑制其他6種病原真菌菌絲生長。SFB-1發(fā)酵菌液可有效阻斷離體葉片上的病斑擴展，降低植株的病情指數(shù)，防效高達70.27%。此外，SFB-1菌液能引起菌絲畸形、過度分支和透明溶解，阻礙Foc菌絲生長。SFB-1菌液以劑量依賴的方式顯著降低病原菌孢子產(chǎn)量和萌發(fā)率，且其無菌上清液中含有主要的抑菌活性物質(zhì)。上述結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿SFB-1是一株具有廣譜高效抑菌活性的根際土壤細菌，具有良好的生防潛力與應(yīng)用前景，為菊花枯萎病的生物防治提供了優(yōu)質(zhì)菌種資源。

關(guān)鍵詞：菊花枯萎病；尖孢鐮刀菌；解淀粉芽孢桿菌；根際土壤

中圖分類號：S436.8⁺1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0133-10

收稿日期：2024-01-29

基金項目：江蘇省鹽城市科技基礎(chǔ)研究計劃（編號：YCBK202228）；江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所科研基金（編號：YHS202103）。

作者簡介：周小四（1989—），女，安徽銅陵人，博士，助理研究員，研究方向為植物病理學(xué)。E-mail：yczhouxiaosi@163.com。

通信作者：楊 華，碩士，副研究員，研究方向為農(nóng)業(yè)推廣。E-mail：ycyanghuayh@163.com。

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）作為多年生宿根草本植物，在我國已有數(shù)千年的栽培歷史，具有很高的觀賞、食用和藥用價值^［1］。目前，江蘇省鹽城市已成為我國重要的菊花生產(chǎn)區(qū)，種植面積常年穩(wěn)定在0.66萬 hm²以上，主產(chǎn)區(qū)集中在亭湖區(qū)黃尖鎮(zhèn)和射陽縣洋馬鎮(zhèn)等地^［2-3］。但由于菊花栽培面積不斷擴大、多年重茬種植、種植連片化、種植技術(shù)不規(guī)范等因素的影響，導(dǎo)致種植地土壤連作障礙嚴重^［3-4］。尖孢鐮刀菌菊花?；停‵.oxysporum f.sp.chrysanthemi）侵染引起的菊花枯萎病，是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要土傳真菌病害之一^［2，5］。病原菌可在土壤中存活多年，傳播方式廣，一般從植物根部侵入，導(dǎo)致維管束變褐、堵塞、腐爛壞死，引起植物地上部分缺水，葉片萎蔫、黃化，最終枯萎死亡^［6-7］。該病在我國多個菊花栽培生產(chǎn)區(qū)都有分布，且植物一旦染病，則迅速萎蔫枯死，大幅度降低了菊花的產(chǎn)量和品質(zhì)，給種植戶和生產(chǎn)企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失^［8-9］。

目前，我國尚未培育出能有效防治菊花枯萎病的抗性品種，該病的田間防治主要以換茬輪作、抗性砧木嫁接和化學(xué)藥劑防治為主^［10-12］。輪作換茬防治效果雖然明顯，但多數(shù)農(nóng)戶耕地面積較少，常常多年重茬種植；抗性砧木嫁接費工費時，育苗效率低，大面積推廣有難度；種植戶長期依賴化學(xué)農(nóng)藥，高頻次大劑量地使用化學(xué)農(nóng)藥防治病害，易引起農(nóng)藥殘留超標、抗藥性、土壤生態(tài)惡化和食品安全等一系列問題^{［3，12］}。近年來，人們利用生防菌及其次生代謝產(chǎn)物防治農(nóng)作物病害能有效降低化學(xué)藥劑對環(huán)境的污染，更為綠色安全。解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）作為與芽孢桿菌（Bacillus spp.）親緣關(guān)系極相近的一種重要的微生物，具有逆境耐受力好、對環(huán)境友好、分泌多種抑菌物質(zhì)、抗菌譜廣、促進植物生長等優(yōu)點，在植物病害防治上發(fā)揮著重要的作用^［13-15］。例如，解淀粉芽孢桿菌FZB24制成的生物殺菌劑（商品名為Taegro TM）能有效防治尖孢鐮刀菌引起的番茄枯萎病^［16］。荊卓瓊等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3可顯著抑制番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）菌絲生長，溫室防效高達81.12%^［17］。解淀粉芽孢桿菌LZN0發(fā)酵菌液能引起西瓜枯萎病菌菌絲膨大畸形，抑制孢子萌發(fā)，抑菌率可達57.07%^［18］。肖志鵬等報道，解淀粉芽孢桿菌YW-2-6對煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、小麥赤霉病菌（F.graminearum）、煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）都具有較強的抑菌作用^［19］。但是關(guān)于解淀粉芽孢桿菌防治菊花枯萎病的報道卻很少，且由于菌株根際定殖能力不強，與土著土壤微生物相容性不佳，易導(dǎo)致拮抗菌株對病害的田間防效不穩(wěn)定，地域適應(yīng)性和差異性比較大^［20-21］。因此，需要不斷篩選發(fā)現(xiàn)新的根系定殖能力強的土著生防菌株，為菊花枯萎病的防治提供優(yōu)勢菌株資源。

本研究從江蘇省鹽城市黃尖鎮(zhèn)和洋馬鎮(zhèn)菊花發(fā)病田塊中的健康植株根際土壤中分離篩選出拮抗效果好的生防細菌；選擇拮抗作用最強的菌株SFB-1進行抑菌作用和抑菌譜的測定，并通過細菌外形觀察、生理生化特點及16S rDNA序列分析對其進行鑒定；利用離體葉片和盆栽生防試驗評價SFB-1菌株對菊花枯萎病的防治效果；通過SFB-1不同發(fā)酵液對菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的抑制作用，初步探究根際土壤拮抗細菌SFB-1對菊花枯萎病菌Foc的抑菌機制，以期為菊花枯萎病的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株和植株

菊花枯萎病菌和蠶豆赤斑病菌（Botryotinia fabae）由筆者所在實驗室前期從菊花和蠶豆上分離鑒定，于4 ℃冰箱保存；西瓜枯萎病菌（F.oxysporum）、甘薯根腐病菌［F.solani（Mart.）Sacc］、甘薯白絹病菌（Sclerotium rolfsii Sacc）、小麥莖基腐菌（F.pseudograminearum）和小麥赤霉病菌（F.graminearum）等病原菌，均由江蘇徐州甘薯研究中心提供。

試驗選取菊花品種為杭白菊（早小洋菊），購于鹽城市鴻杰菊花有限公司。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡稱PDA）培養(yǎng)基成分為洗凈去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g，蒸餾水溶解并定容至1 L。LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨10 g、酵母浸粉 5 g、氯化鈉（NaCl）10 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值為7.0 ～ 7.2；LB液體培養(yǎng)基中無需加入瓊脂粉。

1.1.3 供試地點及時間

試驗地點：江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗中心；試驗時間為2023年1—12月。

1.2 根際土壤生防細菌分離、純化及篩選

1.2.1 根際土壤生防細菌分離、純化及保存

分別在江蘇省鹽城市黃尖鎮(zhèn)花川村、黃尖鎮(zhèn)新閘村、洋馬鎮(zhèn)洋尖村和洋馬鎮(zhèn)賀東村杭白菊和金絲皇菊枯萎病發(fā)病田塊中采集健株的根圍及土壤樣品，稱取 10 g，置于三角瓶中，再加入90 mL無菌水，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)15 min。采用稀釋法逐級倍比稀釋土壤樣品，稀釋到終濃度為10^-6為止，用移液槍依次吸取10^-4、10^-5、10^-6等3個濃度的土壤稀釋樣液100 μL，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，每個濃度涂布至少4個平板，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。根據(jù)平板上菌落不同形態(tài)特征（大小、顏色、黏稠度等）挑取單菌落進行純化培養(yǎng)2～3代，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗細菌的篩選

采用平板對峙法，將保存于4 ℃的菊花枯萎病菌Foc接種到PDA平板上進行活化，待真菌長滿平板后，用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻地打成直徑為6 mm的圓形菌絲塊，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到PDA平板中心，在距離病原菌 25 mm 處的圓周上等距離對稱地放置2個直徑為 6 mm 的圓形無菌濾紙片，用移液器吸取10 μL的菌株發(fā)酵菌液滴到每個濾紙片中央，只接種病原菌Foc菌餅作為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)。不同時間點測量菌絲直徑（單位：cm），然后統(tǒng)計菌絲生長抑制率，計算公式如下：菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.3 菌株SFB-1 抑菌譜的測定

參照“1.2.2”節(jié)中的平板對峙法測定拮抗細菌SFB-1對其他6種病原真菌的抑制作用，統(tǒng)計菌絲生長抑制率。

1.4 菌株SFB-1的鑒定

1.4.1 形態(tài)觀察及生理生化特征測定

將篩選獲得的拮抗細菌在LB固體平板上進行活化，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》中的鑒定方法，觀察細菌菌落的形態(tài)、顏色、大小、凹凸度和邊緣平整性等特征。同時，將菌懸液滴于無菌載玻片上進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。根據(jù)東秀珠等編寫的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的檢測方案，完成菌株生理生化特性的測定，包括厭氧生長、甲基紅、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、37 ℃ 生長、pH值為5.5生長、7% NaCl生長、吲哚乙酸、產(chǎn)嗜鐵素、蛋白酶試驗等^［22］。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

挑取LB平板培養(yǎng)24 h后的拮抗細菌單菌落，接種到玻璃試管中（含50 mL LB培養(yǎng)液），28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，制成終濃度為10⁶ CFU/mL的菌懸液，1 000 r/min離心10 min，收集菌體。根據(jù)細菌基因組DNA快速提取試劑盒（購于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）說明書的操作，提取細菌基因組DNA，以其為模板，利用細菌通用引物27F/1492R（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGT ACGACTT-3′），根據(jù)PCR反應(yīng)試劑盒（TaKaRa Taq^TM，Code No.R001A）中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行16S rDNA 基因序列的PCR擴增。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進行測序，測序結(jié)果利用NCBI-BLAST進行序列比對，并使用MEGA 11.0軟件以鄰接法對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 菌株SFB-1 對菊花枯萎病的防效測定

1.5.1 離體葉片試驗的防效測定

將菊花枯萎病菌Foc接種到PDA固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d備用，在玻璃培養(yǎng)皿中放置1層無菌水浸濕了的圓形濾紙，取新鮮的菊花葉片（4～5周齡），用75%乙醇進行表面消毒30 s，無菌水沖洗 2～3次，晾干，使用滅菌的針頭在每個葉片中心位置刺傷2～3個點，然后向葉片噴灑SFB-1發(fā)酵菌液，設(shè)置4個不同濃度（1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷ CFU/mL），晾干葉片表面水分后，將葉片放置于提前備好的玻璃培養(yǎng)皿中，向刺傷處接種直徑為 6 mm 的病原菌Foc菌餅，用濕棉球給葉片莖基部保濕。試驗以噴施無菌水作為對照組，每個處理重復(fù)3次，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d（光/暗周期16 h/8 h，85%相對濕度），采用十字交叉法記錄病斑直徑。

1.5.2 盆栽試驗的防效測定

將菊花幼苗移栽到塑料盆缽中，溫室條件下（光/暗周期16 h/8 h，85%相對濕度）培養(yǎng)幼苗4～5周，選擇長勢基本一致的健康菊花苗進行試驗，向每盆菊花苗的根部澆灌終濃度為1×10⁷ CFU/mL 的200 mL SFB-1發(fā)酵菌液，以澆灌等量無菌水作為對照，24 h后向每盆菊花苗的根部澆灌150 mL新鮮的病原菌Foc孢子懸浮液（1×10⁶ CFU/mL），每盆種植1顆菊花苗，每處理10盆，重復(fù)3次。根據(jù)Ploetz等的分級標準，對菊花枯萎病的病情等級進行分級（0級：植株健康；1級：輕度褪綠和萎蔫，葉柄不下垂；2級：中度褪綠、萎蔫，少數(shù)葉柄下垂和（或）莖基部開裂；3級：嚴重褪綠、萎蔫，葉柄下垂，植株矮化；4級：死亡）^［23］。接種病原菌15 d后，調(diào)查記載各處理發(fā)病株數(shù)、統(tǒng)計病情指數(shù)和防效。計算公式如下：病情指數(shù)=［∑（不同病級株數(shù)×代表級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高代表級數(shù)）］×100；防效=（對照病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.6 菌株SFB-1 對病原菌菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的影響

1.6.1 病原菌菌絲形態(tài)的觀察

用直徑6 mm的打孔器取生長旺盛的菊花枯萎病菌的菌餅轉(zhuǎn)接到裝有20 mL液體 PDA培養(yǎng)基的9 cm無菌玻璃培養(yǎng)皿中，隨后加入終濃度為1×10⁷ CFU/mL的SFB-1發(fā)酵菌液，對照加入等體積的無菌水，封口膜封口，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，挑取菌落邊緣的少量菌絲，顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)。

1.6.2 病原菌孢子產(chǎn)孢試驗

用直徑6 mm的無菌打孔器從枯萎病菌菌落外邊緣均勻地取3個圓形菌餅，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL液體 PDA培養(yǎng)基的250 ml無菌錐形瓶中，處理組加入1%比例的SFB-1發(fā)酵菌液，設(shè)置3個不同終濃度（1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷ CFU/mL），以加入等量PDA培養(yǎng)液作為對照，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d，吸取菌液滴在血球計數(shù)板上，統(tǒng)計孢子數(shù)目，每個處理重復(fù)3次。

1.6.3 病原菌分生孢子萌發(fā)試驗

生長5 d的菌落用無菌水沖洗3次，用4層無菌濾紙過濾，獲得新鮮的病原菌孢子，利用血球計數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1×10⁶個孢子/mL。將孢子懸液加入 2 mL 的滅菌離心管中，處理組加入等比例SFB-1發(fā)酵菌液，設(shè)置6個不同濃度（1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷ CFU/mL），以PDA和無菌水（Water）處理作為對照。將不同處理的孢子懸浮液置于無光的25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，用移液器吸取孢子懸浮滴在載玻片上，顯微鏡下觀測分生孢子萌發(fā)數(shù)（每處理約300個孢子），計算孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率。

計算公式如下：孢子萌發(fā)率＝（萌發(fā)的孢子數(shù)／觀測的總孢子數(shù)）×100%；孢子萌發(fā)抑制率＝（對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率）／對照組孢子萌發(fā)率×100%。

1.7 菌株SFB-1無菌上清液的制備及抑菌作用測定

1.7.1 菌株SFB-1無菌上清液的制備

挑取 SFB-1單菌落，接種到含有5 mL LB培養(yǎng)液的玻璃試管中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，再將種子液按1%比例轉(zhuǎn)接到裝有100 mL LB培養(yǎng)液的錐形瓶中進行擴大培養(yǎng)，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng) 24 h，12 000 r/min離心20 min，用移液器吸取上清液，通過直徑為0.22 μm的無菌細菌濾器過濾2～3次，過濾液即為SFB-1的無菌上清液。

1.7.2 菌株SFB-1對病原菌的抑制作用

參照“1.2.2”節(jié)中的平板對峙法測定菌株SFB-1無菌上清液對病原菌Foc菌絲體生長的抑制作用，將直徑為6 mm的病原菌菌餅置于PDA固體培養(yǎng)基平板中央，用直徑為6 mm 的無菌打孔器在距離PDA固體培養(yǎng)基平板的中點25 mm處對稱打2個孔，分別加入60 μL SFB-1無菌水上清液，以加入無菌水作為對照，封口膜封口，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，測量菌絲生長的抑制率，每個處理重復(fù)3次。參照“1.6.2”和“1.6.2”節(jié)測定菌株SFB-1無菌上清液對病原菌孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的抑制作用，以無菌水處理作為對照。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有試驗至少設(shè)置3次獨立重復(fù)，試驗過程中獲得的數(shù)據(jù)都利用Microsoft Excel 2019和GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計和制圖，采用SPSS 22.0軟件的Duncan’s新復(fù)極差法對不同處理進行差異顯著性分析，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花根際土壤拮抗細菌的分離及篩選

采用平板稀釋法從江蘇省鹽城市黃尖鎮(zhèn)花川村和新閘村、洋馬鎮(zhèn)洋尖村和賀東村等地的杭白菊和金絲皇菊發(fā)病田塊的健株根際土壤中共分離純化獲得393株細菌。通過平板對峙法篩選出23株對菊花枯萎病菌Foc具有拮抗效果的菌株，其中，有7株拮抗細菌對病原菌Foc的抑制率達55%以上，分別是SFB-1、SFB-6、SFB-102、SFB-122、SFB-337、SFB-348、SFB-360，對峙培養(yǎng)5 d后，菌株SFB-1對菊花枯萎病菌的抑制率最高（圖1），因此選擇菌株SFB-1開展后續(xù)研究。

菊花枯萎病菌Foc在PDA平板上正常生長情況下，菌落呈粉白色、淺粉紅色至肉色，菌絲呈突起絮狀，較蓬松，菌絲體向平板邊緣均勻延伸生長，培養(yǎng)5 d后，菌絲平均直徑可達8.38 cm（圖1-A、圖1-B）。生防菌SFB-1與病原菌Foc平板對峙培養(yǎng)，導(dǎo)致菌落顏色變深，菌絲生長變慢卷縮，對峙培養(yǎng)2、3、4、5 d后，SFB-1菌株對病原菌Foc菌絲的生長抑制率分別為45.12%、62.62%、68.10%、72.55%（圖1-A、圖1-C）。上述結(jié)果表明，根際土壤拮抗細菌SFB-1對菊花枯萎病菌具有很強的抑菌效果。

2.2 拮抗菌株SFB-1對其他植物病原真菌的抑菌活性

根據(jù)根際土壤細菌對菊花枯萎病菌抑制作用的結(jié)果（圖1），選取了抑菌效果最好的，且菌落形態(tài)具有代表性的菌株SFB-1為供試菌株，測定其對另外6種常見病原真菌的抑菌效果。由表1可知，菌株SFB-1對其他6種常見的植物病原真菌都表現(xiàn)出良好的抑制效果，菌絲生長的抑制率均在55%以上，其中對西瓜枯萎病菌和甘薯白絹病菌的抑制作用較強，抑制率分別為71.55%、73.92%，對蠶豆赤斑病菌的抑菌活性最弱，抑制率僅為55.96%，表明SFB-1是一株具有廣譜抑菌活性的根際土壤細菌。

2.3 拮抗菌株SFB-1的鑒定

SFB-1菌株在LB培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)24 h后，菌落顏色為不透明的灰白色，形狀呈圓形，邊緣不規(guī)則，濕潤有黏性，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落表面粗糙，有褶皺狀隆起，形成一層生物膜（圖2-A）。顯微鏡觀察菌株SFB-1呈典型的短桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色結(jié)果呈陽性（圖2-B）。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》分析菌株 SFB-1 的生理生化特征。如表2所示，SFB-1菌株能在溫度37 ℃、pH值 5.5和7% NaCl中生長，可以利用β-1，3-葡萄糖和蔗糖，其在淀粉水解、明膠液化、產(chǎn)吲哚乙酸活性、蛋白酶活性、產(chǎn)嗜鐵素試驗中檢測結(jié)果為陽性，其他生理生化檢測結(jié)果為陰性。

基于細菌16S rDNA基因的通用引物27F/1492R，測序獲得菌株SFB-1的16S rDNA基因序列，大小為1 448 bp， 將測序結(jié)果在NCBI（National Center for Biotechnology Information，https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)菌株SFB-1與解淀粉芽孢桿菌 （B.amyloliquefaciens） GKT04（KY328743.1）相似性為99.93%（圖3）。利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SFB-1菌株與解淀粉芽孢桿菌聚為同一分支。綜合細菌形態(tài)、生理生化和分子學(xué)鑒定結(jié)果，明確SFB-1菌株為解淀粉芽孢桿菌。

2.4 菌株SFB-1對菊花枯萎病的防治效果

為探究SFB-1菌株對菊花枯萎病的防治效果，本研究利用不同濃度SFB-1發(fā)酵菌液（1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷ CFU/mL）和無菌水對照處理，接種菊花枯萎病原菌Foc，統(tǒng)計菊花離體葉片和盆栽幼苗的發(fā)病情況。由圖4-A可知，未接種病原菌的葉片顏色鮮綠，經(jīng)病原菌Foc侵染的菊花葉片出現(xiàn)明顯的黑褐色病斑，接種3 d后，葉片病斑平均直徑可達19.13 mm（圖4-B）。經(jīng)SFB-1發(fā)酵菌液處理的菊花葉片病斑直徑明顯小于對照（圖 4-A、圖4-B），其中，終濃度為1×10⁷ CFU/mL的SFB-1發(fā)酵菌液處理的菊花葉片病斑直徑最小，抑制率可達84.31%（圖4-B）。在盆栽試驗中，未接種病原菌的菊花苗長勢良好，植株葉片保持鮮綠；無菌水和病原菌Foc共處理15 d后，植株出現(xiàn)葉片發(fā)黃、萎蔫和枯萎死亡的癥狀；1×10⁷ CFU/mL 濃度的SFB-1發(fā)酵菌液和病原菌Foc共處理的菊花苗未出現(xiàn)枯萎死亡的現(xiàn)象，僅少部分植株莖基部葉片出現(xiàn)發(fā)黃、脫落癥狀（圖4-C）。病情指數(shù)和防效的統(tǒng)計結(jié)果顯示，SFB-1發(fā)酵菌液處理后，植株的病情指數(shù)顯著低于無菌水對照，防效可達70.27%（表3）。由此表明，菌株 SFB-1 可以有效抑制病原菌侵染離體葉片，顯著降低菊花枯萎病的發(fā)生和嚴重程度。

2.5 菌株SFB-1對菊花枯萎病菌菌絲體形態(tài)、分生孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的影響

液體PDA培養(yǎng)條件下，無菌水對照處理的病原菌Foc菌絲體粗細均勻，表面光滑；SFB-1發(fā)酵菌液（1×10⁷ CFU/mL）處理引起病原菌Foc菌絲體出現(xiàn)扭曲畸形、異常分支增多、長度變短，部分菌絲變透明溶解、斷裂等現(xiàn)象（圖5）。表明菌株SFB-1能夠誘導(dǎo)菊花枯萎病菌菌絲體畸變、溶解、斷裂，從而抑制菌絲體的正常生長。

分別用PDA液培養(yǎng)基（對照）和終濃度為1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷ CFU/mL的SFB-1發(fā)酵菌液處理正常的菌絲，用顯微鏡觀察并統(tǒng)計處理3 d后病原菌分子孢子的產(chǎn)生情況，如圖6所示，與對照組相比，隨著SFB-1濃度增加分生孢子產(chǎn)量明顯減少。1×10⁷ CFU/mL SFB-1菌液處理的病原真菌分生孢子產(chǎn)量最少（2.38×10⁵個/mL），抑制率達90%（圖6-B）。表明SFB-1菌株可顯著抑制病原菌孢子的產(chǎn)生，且這種抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴的方式。

分子孢子萌發(fā)是病原真菌致病的關(guān)鍵因子之一，為探究菌株SFB-1對菊花枯萎病菌的抑菌機理，本研究檢測了不同濃度SFB-1發(fā)酵菌液對病原菌Foc分生孢子萌發(fā)的影響。由圖7可知，用PDA、無菌水和不同濃度的SFB-1發(fā)酵菌液分別處理分生孢子24 h后，PDA和無菌水處理的孢子萌發(fā)率分別為82.36%、80.81%，二者無顯著性差異（圖7-A、圖7-B）。SFB-1發(fā)酵菌液可明顯降低分生孢子的萌發(fā)率，且隨著SFB-1菌液濃度的增加，對病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果越強，1×10² CFU/mL的 SFB-1菌液處理的孢子萌發(fā)率最高（60.99%），抑制率為25.67%，1×10⁷ CFU/mL的SFB-1菌液處理的孢子萌發(fā)率最低（4.43%），抑制率為94.63%（圖7）。上述結(jié)果說明，SFB-1菌株以劑量依賴的方式顯著抑制病原菌的分生孢子萌發(fā)。

2.6 拮抗菌株SFB-1無菌上清液是抑菌的主要活性物質(zhì)

為研究拮抗菌株SFB-1抑制菊花枯萎病菌的主要活性物質(zhì)，本研究以無菌水和LB培養(yǎng)液為對照，探究SFB-1發(fā)酵菌液（1×10⁷ CFU/mL）、無菌上清液和重懸菌體液對病原菌Foc的菌絲生長、分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)的影響。由表4可知，與無菌水和LB培養(yǎng)液相比，SFB-1發(fā)酵菌液、無菌上清液和重懸菌體液均能顯著抑制病原菌的菌絲生長，降低分生孢子的產(chǎn)量和萌發(fā)率。SFB-1無菌上清液和發(fā)酵菌液對菊花枯萎病菌的菌絲生長的抑制作用無顯著差異，抑制率分別為72.36%、73.07%，但卻顯著高于重懸菌體液處理組（表4）。此外，SFB-1無菌上清液和發(fā)酵菌液處理的病菌產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率也顯著低于重懸菌體液處理組（表4）。上述結(jié)果暗示了SFB-1無菌上清液中含有抑制菊花枯萎病菌生長的主要活性物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

由尖孢鐮刀菌菊花?；鸵鸬目菸∈亲顕乐氐耐羵鞑『χ?，在菊花的整個生育期均有發(fā)生，造成嚴重的產(chǎn)量損失^［24］。菊花枯萎病的防治長期依賴于化學(xué)藥劑，易導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和土壤微生態(tài)惡化等一系列問題^［3］。近年來，有益微生物以其低殘留、無毒害、對環(huán)境友好等優(yōu)勢受到越來越多人的關(guān)注，針對植物枯萎病的生物防治國內(nèi)外開展了大量的研究。美國已經(jīng)獲得用于防治尖孢鐮刀菌引起的豆類、麥類、棉花及花生枯萎病的商品化生物菌劑GB03（商品名為Kodiak）、MB1600（商品名為Subtilex）和FZB24（商品名為Taegro^TM）^{［16，25-26］}。多黏擬桿菌NSY50是一種潛在的生物防治劑，具有較好的防治黃瓜枯萎病的效果^［27］。黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)的枯草芽孢桿菌菌劑，可用于防治黃瓜枯萎病和保護地蔬菜枯萎病，已大面積推廣^{［14，28］}。但關(guān)于菊花枯萎病的生防菌株的研究比較少。因此，本研究從江蘇省鹽城市菊花主產(chǎn)區(qū)發(fā)病田塊中健康植株的根際土壤中分離獲得393株細菌，有7株拮抗細菌對病原菌Foc的抑菌率達55%以上，其中，對峙培養(yǎng)5 d，菌株 SFB-1 對菊花枯萎病菌的拮抗作用最高，抑菌率高達72.55%，且對6種常見植物病原真菌（西瓜枯萎病菌、蠶豆赤斑病菌、甘薯根腐病菌、甘薯白絹病菌、小麥赤霉病菌和小麥莖基腐菌）均表現(xiàn)出良好的抑菌作用。經(jīng)細菌形態(tài)、生理生化和分子學(xué)鑒定分析，明確SFB-1菌株為解淀粉芽孢桿菌。防效試驗結(jié)果顯示，SFB-1菌株可顯著降低菊花植株的病情指數(shù)，防效高達70.27%。綜合上述結(jié)果表明， 菌株SFB-1是一株具有廣譜抑菌活性的根際土壤生防細菌，對菊花枯萎病具有較好的防治效果，生防潛力和應(yīng)用前景良好。

解淀粉芽孢桿菌是一種與芽孢桿菌極相似，可產(chǎn)芽孢、逆境耐受力好、抑菌譜廣、安全有效的益生細菌^［15］。關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的抑菌作用機制主要包括2個方面，一方面是阻礙菌絲的生長使其畸形消融、斷裂、萎縮和原生質(zhì)體外漏等；另一方面是降低分生孢子的萌發(fā)率^［29］。朱娜等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌TS-1203能明顯抑制膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌絲生長和孢子萌發(fā)，對蘋果炭疽葉枯病的防效達70.1%^［30］。解淀粉芽孢桿菌QSB-6對鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)有較強的抑制作用，可引起菌絲體膨大變粗、破裂以及原生質(zhì)體滲漏^［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，SFB-1發(fā)酵菌液對菊花枯萎病菌Foc的菌絲生長具有很強的抑制作用，顯微下觀察發(fā)現(xiàn)，無菌水對照處理的病原菌Foc菌絲粗細均勻，表面光滑，SFB-1發(fā)酵菌液抑制了菌絲生長，導(dǎo)致其出現(xiàn)扭曲畸形、分支變多變短、部分菌絲變透明、消融、斷裂等現(xiàn)象。同時，SFB-1發(fā)酵菌液以劑量依賴的方式顯著降低病原菌Foc分生孢子產(chǎn)量和孢子萌發(fā)率，1×10⁷ CFU/mL 終濃度的SFB-1發(fā)酵菌液處理的病原菌產(chǎn)孢量為2.38×10⁵ 個/mL，抑制率達90%，孢子萌發(fā)率僅為4.43%，萌發(fā)抑制率高達94.63%。表明SFB-1發(fā)酵菌液可通過直接抑制菊花枯萎病菌菌絲生長，降低分子孢子產(chǎn)量和萌發(fā)率，從而達到抑制病原菌的作用。此外，SFB-1 菌液和病原菌共處理的菊花離體葉片，較對照組葉片發(fā)病程度較輕，病斑擴展直徑顯著下降，表明解淀粉芽孢桿菌SFB-1能夠顯著抑制菊花枯萎病菌Foc的侵染，有效遏制病斑在菊花葉片上的擴展。

王文迪等報道解淀粉芽孢桿菌可通過菌體本身或胞外代謝產(chǎn)物（多種酶類、脂肽類物質(zhì)和抑菌蛋白等）抑制植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，從而大幅度降低病害的發(fā)生和嚴重程度^［29］。例如，Cui等利用GFP熒光標記解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2，并監(jiān)測其在玉米根際和組織中的定殖模式，發(fā)現(xiàn)B9601-Y2大量定殖于玉米主根、根毛和根之間的連接處，隨后進入莖和葉，直接抑制玉米葉枯病菌（Bipolaris maydis）的生長，降低病害的嚴重程度^［32］。解淀粉芽孢桿菌BA-26胞外產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)能破壞灰葡萄孢菌（B.cinerea）的細胞結(jié)構(gòu)，引起菌絲膨大變粗并抑制孢子萌發(fā)^［33］。Al-Mutar等報道，解淀粉芽孢桿菌DHA6發(fā)酵菌液中含有大量的脂肽類物質(zhì)（伊枯草菌素、表面活性素和芽孢菌霉素等），能破壞西瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.niveum）菌絲體結(jié)構(gòu)，抑制病原真菌生長^［34］。本研究中發(fā)現(xiàn)，SFB-1 發(fā)酵菌液、無菌上清液和重懸菌體液對病原菌Foc的菌絲生長、分生孢子產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)均有抑制作用。SFB-1發(fā)酵菌液和無菌上清液對病原菌Foc的抑制作用無顯著差異，但其抑菌效果顯著強于重懸菌體液處理組。表明拮抗細菌SFB-1無菌上清液中含有重要的抗菌活性物質(zhì)，后續(xù)將進一步分析鑒定抗菌活性物質(zhì)的具體成分，驗證其抑菌功能，解析SFB-1菌株對菊花枯萎病的防控機理，為菊花枯萎病的綠色防控提供基礎(chǔ)。

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