摘要:為發(fā)掘?qū)栈菸【‵usarium oxysporum f.sp.chrysanthemi,F(xiàn)oc)具有高效拮抗作用的生防菌株資源,有效防控菊花枯萎病,采用平板稀釋法從江蘇省鹽城市菊花產(chǎn)區(qū)杭白菊和金絲皇菊的根際土壤中分離獲得菌株,以平板對峙法和抑菌譜測定篩選具有高效拮抗作用的生防細菌,通過細菌形態(tài)觀察、生理生化測定和分子生物學(xué)分析對其進行鑒定,利用離體和盆栽試驗測定生防菌對菊花枯萎病的防治效果,并于室內(nèi)測定生防菌不同發(fā)酵液對Foc菌絲生長、孢子產(chǎn)量和萌發(fā)率的影響。結(jié)果顯示,從菊花根際土壤中共分離獲得393株細菌,有7株拮抗細菌對病原菌Foc的抑制率達55%以上,其中,菌株SFB-1對Foc的抑菌率最高,可達72.55%。經(jīng)鑒定明確SFB-1為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens,且其還能顯著抑制其他6種病原真菌菌絲生長。SFB-1發(fā)酵菌液可有效阻斷離體葉片上的病斑擴展,降低植株的病情指數(shù),防效高達70.27%。此外,SFB-1菌液能引起菌絲畸形、過度分支和透明溶解,阻礙Foc菌絲生長。SFB-1菌液以劑量依賴的方式顯著降低病原菌孢子產(chǎn)量和萌發(fā)率,且其無菌上清液中含有主要的抑菌活性物質(zhì)。上述結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿SFB-1是一株具有廣譜高效抑菌活性的根際土壤細菌,具有良好的生防潛力與應(yīng)用前景,為菊花枯萎病的生物防治提供了優(yōu)質(zhì)菌種資源。
關(guān)鍵詞:菊花枯萎病;尖孢鐮刀菌;解淀粉芽孢桿菌;根際土壤
中圖分類號:S436.8+1 文獻標志碼:A
文章編號:1002-1302(2024)21-0133-10
收稿日期:2024-01-29
基金項目:江蘇省鹽城市科技基礎(chǔ)研究計劃(編號:YCBK202228);江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所科研基金(編號:YHS202103)。
作者簡介:周小四(1989—),女,安徽銅陵人,博士,助理研究員,研究方向為植物病理學(xué)。E-mail:yczhouxiaosi@163.com。
通信作者:楊 華,碩士,副研究員,研究方向為農(nóng)業(yè)推廣。E-mail:ycyanghuayh@163.com。
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)作為多年生宿根草本植物,在我國已有數(shù)千年的栽培歷史,具有很高的觀賞、食用和藥用價值[1]。目前,江蘇省鹽城市已成為我國重要的菊花生產(chǎn)區(qū),種植面積常年穩(wěn)定在0.66萬 hm2以上,主產(chǎn)區(qū)集中在亭湖區(qū)黃尖鎮(zhèn)和射陽縣洋馬鎮(zhèn)等地[2-3]。但由于菊花栽培面積不斷擴大、多年重茬種植、種植連片化、種植技術(shù)不規(guī)范等因素的影響,導(dǎo)致種植地土壤連作障礙嚴重[3-4]。尖孢鐮刀菌菊花?;停‵.oxysporum f.sp.chrysanthemi)侵染引起的菊花枯萎病,是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要土傳真菌病害之一[2,5]。病原菌可在土壤中存活多年,傳播方式廣,一般從植物根部侵入,導(dǎo)致維管束變褐、堵塞、腐爛壞死,引起植物地上部分缺水,葉片萎蔫、黃化,最終枯萎死亡[6-7]。該病在我國多個菊花栽培生產(chǎn)區(qū)都有分布,且植物一旦染病,則迅速萎蔫枯死,大幅度降低了菊花的產(chǎn)量和品質(zhì),給種植戶和生產(chǎn)企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[8-9]。
目前,我國尚未培育出能有效防治菊花枯萎病的抗性品種,該病的田間防治主要以換茬輪作、抗性砧木嫁接和化學(xué)藥劑防治為主[10-12]。輪作換茬防治效果雖然明顯,但多數(shù)農(nóng)戶耕地面積較少,常常多年重茬種植;抗性砧木嫁接費工費時,育苗效率低,大面積推廣有難度;種植戶長期依賴化學(xué)農(nóng)藥,高頻次大劑量地使用化學(xué)農(nóng)藥防治病害,易引起農(nóng)藥殘留超標、抗藥性、土壤生態(tài)惡化和食品安全等一系列問題[3,12]。近年來,人們利用生防菌及其次生代謝產(chǎn)物防治農(nóng)作物病害能有效降低化學(xué)藥劑對環(huán)境的污染,更為綠色安全。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)作為與芽孢桿菌(Bacillus spp.)親緣關(guān)系極相近的一種重要的微生物,具有逆境耐受力好、對環(huán)境友好、分泌多種抑菌物質(zhì)、抗菌譜廣、促進植物生長等優(yōu)點,在植物病害防治上發(fā)揮著重要的作用[13-15]。例如,解淀粉芽孢桿菌FZB24制成的生物殺菌劑(商品名為Taegro TM)能有效防治尖孢鐮刀菌引起的番茄枯萎病[16]。荊卓瓊等研究發(fā)現(xiàn),解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3可顯著抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)菌絲生長,溫室防效高達81.12%[17]。解淀粉芽孢桿菌LZN0發(fā)酵菌液能引起西瓜枯萎病菌菌絲膨大畸形,抑制孢子萌發(fā),抑菌率可達57.07%[18]。肖志鵬等報道,解淀粉芽孢桿菌YW-2-6對煙草赤星病菌(Alternaria alternate)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)、煙草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)都具有較強的抑菌作用[19]。但是關(guān)于解淀粉芽孢桿菌防治菊花枯萎病的報道卻很少,且由于菌株根際定殖能力不強,與土著土壤微生物相容性不佳,易導(dǎo)致拮抗菌株對病害的田間防效不穩(wěn)定,地域適應(yīng)性和差異性比較大[20-21]。因此,需要不斷篩選發(fā)現(xiàn)新的根系定殖能力強的土著生防菌株,為菊花枯萎病的防治提供優(yōu)勢菌株資源。
本研究從江蘇省鹽城市黃尖鎮(zhèn)和洋馬鎮(zhèn)菊花發(fā)病田塊中的健康植株根際土壤中分離篩選出拮抗效果好的生防細菌;選擇拮抗作用最強的菌株SFB-1進行抑菌作用和抑菌譜的測定,并通過細菌外形觀察、生理生化特點及16S rDNA序列分析對其進行鑒定;利用離體葉片和盆栽生防試驗評價SFB-1菌株對菊花枯萎病的防治效果;通過SFB-1不同發(fā)酵液對菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的抑制作用,初步探究根際土壤拮抗細菌SFB-1對菊花枯萎病菌Foc的抑菌機制,以期為菊花枯萎病的綠色防控提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 供試材料
1.1.1 供試菌株和植株
菊花枯萎病菌和蠶豆赤斑病菌(Botryotinia fabae)由筆者所在實驗室前期從菊花和蠶豆上分離鑒定,于4 ℃冰箱保存;西瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、甘薯根腐病菌[F.solani(Mart.)Sacc]、甘薯白絹病菌(Sclerotium rolfsii Sacc)、小麥莖基腐菌(F.pseudograminearum)和小麥赤霉病菌(F.graminearum)等病原菌,均由江蘇徐州甘薯研究中心提供。
試驗選取菊花品種為杭白菊(早小洋菊),購于鹽城市鴻杰菊花有限公司。
1.1.2 供試培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,簡稱PDA)培養(yǎng)基成分為洗凈去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g,蒸餾水溶解并定容至1 L。LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨10 g、酵母浸粉 5 g、氯化鈉(NaCl)10 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水溶解并定容至1 L,pH值為7.0 ~ 7.2;LB液體培養(yǎng)基中無需加入瓊脂粉。
1.1.3 供試地點及時間
試驗地點:江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗中心;試驗時間為2023年1—12月。
1.2 根際土壤生防細菌分離、純化及篩選
1.2.1 根際土壤生防細菌分離、純化及保存
分別在江蘇省鹽城市黃尖鎮(zhèn)花川村、黃尖鎮(zhèn)新閘村、洋馬鎮(zhèn)洋尖村和洋馬鎮(zhèn)賀東村杭白菊和金絲皇菊枯萎病發(fā)病田塊中采集健株的根圍及土壤樣品,稱取 10 g,置于三角瓶中,再加入90 mL無菌水,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)15 min。采用稀釋法逐級倍比稀釋土壤樣品,稀釋到終濃度為10-6為止,用移液槍依次吸取10-4、10-5、10-6等3個濃度的土壤稀釋樣液100 μL,均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上,每個濃度涂布至少4個平板,28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。根據(jù)平板上菌落不同形態(tài)特征(大小、顏色、黏稠度等)挑取單菌落進行純化培養(yǎng)2~3代,-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 拮抗細菌的篩選
采用平板對峙法,將保存于4 ℃的菊花枯萎病菌Foc接種到PDA平板上進行活化,待真菌長滿平板后,用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻地打成直徑為6 mm的圓形菌絲塊,將菌絲塊轉(zhuǎn)接到PDA平板中心,在距離病原菌 25 mm 處的圓周上等距離對稱地放置2個直徑為 6 mm 的圓形無菌濾紙片,用移液器吸取10 μL的菌株發(fā)酵菌液滴到每個濾紙片中央,只接種病原菌Foc菌餅作為對照,28 ℃恒溫培養(yǎng)。不同時間點測量菌絲直徑(單位:cm),然后統(tǒng)計菌絲生長抑制率,計算公式如下:菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。
1.3 菌株SFB-1 抑菌譜的測定
參照“1.2.2”節(jié)中的平板對峙法測定拮抗細菌SFB-1對其他6種病原真菌的抑制作用,統(tǒng)計菌絲生長抑制率。
1.4 菌株SFB-1的鑒定
1.4.1 形態(tài)觀察及生理生化特征測定
將篩選獲得的拮抗細菌在LB固體平板上進行活化,28 ℃倒置培養(yǎng)48 h。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》中的鑒定方法,觀察細菌菌落的形態(tài)、顏色、大小、凹凸度和邊緣平整性等特征。同時,將菌懸液滴于無菌載玻片上進行革蘭氏染色,顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。根據(jù)東秀珠等編寫的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的檢測方案,完成菌株生理生化特性的測定,包括厭氧生長、甲基紅、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、37 ℃ 生長、pH值為5.5生長、7% NaCl生長、吲哚乙酸、產(chǎn)嗜鐵素、蛋白酶試驗等[22]。
1.4.2 分子生物學(xué)鑒定
挑取LB平板培養(yǎng)24 h后的拮抗細菌單菌落,接種到玻璃試管中(含50 mL LB培養(yǎng)液),28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,制成終濃度為106 CFU/mL的菌懸液,1 000 r/min離心10 min,收集菌體。根據(jù)細菌基因組DNA快速提取試劑盒(購于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)說明書的操作,提取細菌基因組DNA,以其為模板,利用細菌通用引物27F/1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCTTGT ACGACTT-3′),根據(jù)PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa TaqTM,Code No.R001A)中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行16S rDNA 基因序列的PCR擴增。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進行測序,測序結(jié)果利用NCBI-BLAST進行序列比對,并使用MEGA 11.0軟件以鄰接法對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。
1.5 菌株SFB-1 對菊花枯萎病的防效測定
1.5.1 離體葉片試驗的防效測定
將菊花枯萎病菌Foc接種到PDA固體培養(yǎng)基平板上,28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d備用,在玻璃培養(yǎng)皿中放置1層無菌水浸濕了的圓形濾紙,取新鮮的菊花葉片(4~5周齡),用75%乙醇進行表面消毒30 s,無菌水沖洗 2~3次,晾干,使用滅菌的針頭在每個葉片中心位置刺傷2~3個點,然后向葉片噴灑SFB-1發(fā)酵菌液,設(shè)置4個不同濃度(1×104、1×105、1×106、1×107 CFU/mL),晾干葉片表面水分后,將葉片放置于提前備好的玻璃培養(yǎng)皿中,向刺傷處接種直徑為 6 mm 的病原菌Foc菌餅,用濕棉球給葉片莖基部保濕。試驗以噴施無菌水作為對照組,每個處理重復(fù)3次,置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d(光/暗周期16 h/8 h,85%相對濕度),采用十字交叉法記錄病斑直徑。
1.5.2 盆栽試驗的防效測定
將菊花幼苗移栽到塑料盆缽中,溫室條件下(光/暗周期16 h/8 h,85%相對濕度)培養(yǎng)幼苗4~5周,選擇長勢基本一致的健康菊花苗進行試驗,向每盆菊花苗的根部澆灌終濃度為1×107 CFU/mL 的200 mL SFB-1發(fā)酵菌液,以澆灌等量無菌水作為對照,24 h后向每盆菊花苗的根部澆灌150 mL新鮮的病原菌Foc孢子懸浮液(1×106 CFU/mL),每盆種植1顆菊花苗,每處理10盆,重復(fù)3次。根據(jù)Ploetz等的分級標準,對菊花枯萎病的病情等級進行分級(0級:植株健康;1級:輕度褪綠和萎蔫,葉柄不下垂;2級:中度褪綠、萎蔫,少數(shù)葉柄下垂和(或)莖基部開裂;3級:嚴重褪綠、萎蔫,葉柄下垂,植株矮化;4級:死亡)[23]。接種病原菌15 d后,調(diào)查記載各處理發(fā)病株數(shù)、統(tǒng)計病情指數(shù)和防效。計算公式如下:病情指數(shù)=[∑(不同病級株數(shù)×代表級數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高代表級數(shù))]×100;防效=(對照病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。
1.6 菌株SFB-1 對病原菌菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的影響
1.6.1 病原菌菌絲形態(tài)的觀察
用直徑6 mm的打孔器取生長旺盛的菊花枯萎病菌的菌餅轉(zhuǎn)接到裝有20 mL液體 PDA培養(yǎng)基的9 cm無菌玻璃培養(yǎng)皿中,隨后加入終濃度為1×107 CFU/mL的SFB-1發(fā)酵菌液,對照加入等體積的無菌水,封口膜封口,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d,挑取菌落邊緣的少量菌絲,顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)。
1.6.2 病原菌孢子產(chǎn)孢試驗
用直徑6 mm的無菌打孔器從枯萎病菌菌落外邊緣均勻地取3個圓形菌餅,轉(zhuǎn)接到裝有100 mL液體 PDA培養(yǎng)基的250 ml無菌錐形瓶中,處理組加入1%比例的SFB-1發(fā)酵菌液,設(shè)置3個不同終濃度(1×105、1×106、1×107 CFU/mL),以加入等量PDA培養(yǎng)液作為對照,25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d,吸取菌液滴在血球計數(shù)板上,統(tǒng)計孢子數(shù)目,每個處理重復(fù)3次。
1.6.3 病原菌分生孢子萌發(fā)試驗
生長5 d的菌落用無菌水沖洗3次,用4層無菌濾紙過濾,獲得新鮮的病原菌孢子,利用血球計數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1×106個孢子/mL。將孢子懸液加入 2 mL 的滅菌離心管中,處理組加入等比例SFB-1發(fā)酵菌液,設(shè)置6個不同濃度(1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107 CFU/mL),以PDA和無菌水(Water)處理作為對照。將不同處理的孢子懸浮液置于無光的25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,用移液器吸取孢子懸浮滴在載玻片上,顯微鏡下觀測分生孢子萌發(fā)數(shù)(每處理約300個孢子),計算孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率。
計算公式如下:孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)的孢子數(shù)/觀測的總孢子數(shù))×100%;孢子萌發(fā)抑制率=(對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對照組孢子萌發(fā)率×100%。
1.7 菌株SFB-1無菌上清液的制備及抑菌作用測定
1.7.1 菌株SFB-1無菌上清液的制備
挑取 SFB-1單菌落,接種到含有5 mL LB培養(yǎng)液的玻璃試管中,28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,再將種子液按1%比例轉(zhuǎn)接到裝有100 mL LB培養(yǎng)液的錐形瓶中進行擴大培養(yǎng),28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng) 24 h,12 000 r/min離心20 min,用移液器吸取上清液,通過直徑為0.22 μm的無菌細菌濾器過濾2~3次,過濾液即為SFB-1的無菌上清液。
1.7.2 菌株SFB-1對病原菌的抑制作用
參照“1.2.2”節(jié)中的平板對峙法測定菌株SFB-1無菌上清液對病原菌Foc菌絲體生長的抑制作用,將直徑為6 mm的病原菌菌餅置于PDA固體培養(yǎng)基平板中央,用直徑為6 mm 的無菌打孔器在距離PDA固體培養(yǎng)基平板的中點25 mm處對稱打2個孔,分別加入60 μL SFB-1無菌水上清液,以加入無菌水作為對照,封口膜封口,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,測量菌絲生長的抑制率,每個處理重復(fù)3次。參照“1.6.2”和“1.6.2”節(jié)測定菌株SFB-1無菌上清液對病原菌孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的抑制作用,以無菌水處理作為對照。
1.8 數(shù)據(jù)分析
所有試驗至少設(shè)置3次獨立重復(fù),試驗過程中獲得的數(shù)據(jù)都利用Microsoft Excel 2019和GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計和制圖,采用SPSS 22.0軟件的Duncan’s新復(fù)極差法對不同處理進行差異顯著性分析,不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
2 結(jié)果與分析
2.1 菊花根際土壤拮抗細菌的分離及篩選
采用平板稀釋法從江蘇省鹽城市黃尖鎮(zhèn)花川村和新閘村、洋馬鎮(zhèn)洋尖村和賀東村等地的杭白菊和金絲皇菊發(fā)病田塊的健株根際土壤中共分離純化獲得393株細菌。通過平板對峙法篩選出23株對菊花枯萎病菌Foc具有拮抗效果的菌株,其中,有7株拮抗細菌對病原菌Foc的抑制率達55%以上,分別是SFB-1、SFB-6、SFB-102、SFB-122、SFB-337、SFB-348、SFB-360,對峙培養(yǎng)5 d后,菌株SFB-1對菊花枯萎病菌的抑制率最高(圖1),因此選擇菌株SFB-1開展后續(xù)研究。
菊花枯萎病菌Foc在PDA平板上正常生長情況下,菌落呈粉白色、淺粉紅色至肉色,菌絲呈突起絮狀,較蓬松,菌絲體向平板邊緣均勻延伸生長,培養(yǎng)5 d后,菌絲平均直徑可達8.38 cm(圖1-A、圖1-B)。生防菌SFB-1與病原菌Foc平板對峙培養(yǎng),導(dǎo)致菌落顏色變深,菌絲生長變慢卷縮,對峙培養(yǎng)2、3、4、5 d后,SFB-1菌株對病原菌Foc菌絲的生長抑制率分別為45.12%、62.62%、68.10%、72.55%(圖1-A、圖1-C)。上述結(jié)果表明,根際土壤拮抗細菌SFB-1對菊花枯萎病菌具有很強的抑菌效果。
2.2 拮抗菌株SFB-1對其他植物病原真菌的抑菌活性
根據(jù)根際土壤細菌對菊花枯萎病菌抑制作用的結(jié)果(圖1),選取了抑菌效果最好的,且菌落形態(tài)具有代表性的菌株SFB-1為供試菌株,測定其對另外6種常見病原真菌的抑菌效果。由表1可知,菌株SFB-1對其他6種常見的植物病原真菌都表現(xiàn)出良好的抑制效果,菌絲生長的抑制率均在55%以上,其中對西瓜枯萎病菌和甘薯白絹病菌的抑制作用較強,抑制率分別為71.55%、73.92%,對蠶豆赤斑病菌的抑菌活性最弱,抑制率僅為55.96%,表明SFB-1是一株具有廣譜抑菌活性的根際土壤細菌。
2.3 拮抗菌株SFB-1的鑒定
SFB-1菌株在LB培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好,培養(yǎng)24 h后,菌落顏色為不透明的灰白色,形狀呈圓形,邊緣不規(guī)則,濕潤有黏性,隨著培養(yǎng)時間的延長,菌落表面粗糙,有褶皺狀隆起,形成一層生物膜(圖2-A)。顯微鏡觀察菌株SFB-1呈典型的短桿狀,兩端鈍圓,革蘭氏染色結(jié)果呈陽性(圖2-B)。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》分析菌株 SFB-1 的生理生化特征。如表2所示,SFB-1菌株能在溫度37 ℃、pH值 5.5和7% NaCl中生長,可以利用β-1,3-葡萄糖和蔗糖,其在淀粉水解、明膠液化、產(chǎn)吲哚乙酸活性、蛋白酶活性、產(chǎn)嗜鐵素試驗中檢測結(jié)果為陽性,其他生理生化檢測結(jié)果為陰性。
基于細菌16S rDNA基因的通用引物27F/1492R,測序獲得菌株SFB-1的16S rDNA基因序列,大小為1 448 bp, 將測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進行BLAST序列比對,發(fā)現(xiàn)菌株SFB-1與解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens) GKT04(KY328743.1)相似性為99.93%(圖3)。利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)SFB-1菌株與解淀粉芽孢桿菌聚為同一分支。綜合細菌形態(tài)、生理生化和分子學(xué)鑒定結(jié)果,明確SFB-1菌株為解淀粉芽孢桿菌。
2.4 菌株SFB-1對菊花枯萎病的防治效果
為探究SFB-1菌株對菊花枯萎病的防治效果,本研究利用不同濃度SFB-1發(fā)酵菌液(1×104、1×105、1×106、1×107 CFU/mL)和無菌水對照處理,接種菊花枯萎病原菌Foc,統(tǒng)計菊花離體葉片和盆栽幼苗的發(fā)病情況。由圖4-A可知,未接種病原菌的葉片顏色鮮綠,經(jīng)病原菌Foc侵染的菊花葉片出現(xiàn)明顯的黑褐色病斑,接種3 d后,葉片病斑平均直徑可達19.13 mm(圖4-B)。經(jīng)SFB-1發(fā)酵菌液處理的菊花葉片病斑直徑明顯小于對照(圖 4-A、圖4-B),其中,終濃度為1×107 CFU/mL的SFB-1發(fā)酵菌液處理的菊花葉片病斑直徑最小,抑制率可達84.31%(圖4-B)。在盆栽試驗中,未接種病原菌的菊花苗長勢良好,植株葉片保持鮮綠;無菌水和病原菌Foc共處理15 d后,植株出現(xiàn)葉片發(fā)黃、萎蔫和枯萎死亡的癥狀;1×107 CFU/mL 濃度的SFB-1發(fā)酵菌液和病原菌Foc共處理的菊花苗未出現(xiàn)枯萎死亡的現(xiàn)象,僅少部分植株莖基部葉片出現(xiàn)發(fā)黃、脫落癥狀(圖4-C)。病情指數(shù)和防效的統(tǒng)計結(jié)果顯示,SFB-1發(fā)酵菌液處理后,植株的病情指數(shù)顯著低于無菌水對照,防效可達70.27%(表3)。由此表明,菌株 SFB-1 可以有效抑制病原菌侵染離體葉片,顯著降低菊花枯萎病的發(fā)生和嚴重程度。
2.5 菌株SFB-1對菊花枯萎病菌菌絲體形態(tài)、分生孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的影響
液體PDA培養(yǎng)條件下,無菌水對照處理的病原菌Foc菌絲體粗細均勻,表面光滑;SFB-1發(fā)酵菌液(1×107 CFU/mL)處理引起病原菌Foc菌絲體出現(xiàn)扭曲畸形、異常分支增多、長度變短,部分菌絲變透明溶解、斷裂等現(xiàn)象(圖5)。表明菌株SFB-1能夠誘導(dǎo)菊花枯萎病菌菌絲體畸變、溶解、斷裂,從而抑制菌絲體的正常生長。
分別用PDA液培養(yǎng)基(對照)和終濃度為1×105、1×106、1×107 CFU/mL的SFB-1發(fā)酵菌液處理正常的菌絲,用顯微鏡觀察并統(tǒng)計處理3 d后病原菌分子孢子的產(chǎn)生情況,如圖6所示,與對照組相比,隨著SFB-1濃度增加分生孢子產(chǎn)量明顯減少。1×107 CFU/mL SFB-1菌液處理的病原真菌分生孢子產(chǎn)量最少(2.38×105個/mL),抑制率達90%(圖6-B)。表明SFB-1菌株可顯著抑制病原菌孢子的產(chǎn)生,且這種抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴的方式。
分子孢子萌發(fā)是病原真菌致病的關(guān)鍵因子之一,為探究菌株SFB-1對菊花枯萎病菌的抑菌機理,本研究檢測了不同濃度SFB-1發(fā)酵菌液對病原菌Foc分生孢子萌發(fā)的影響。由圖7可知,用PDA、無菌水和不同濃度的SFB-1發(fā)酵菌液分別處理分生孢子24 h后,PDA和無菌水處理的孢子萌發(fā)率分別為82.36%、80.81%,二者無顯著性差異(圖7-A、圖7-B)。SFB-1發(fā)酵菌液可明顯降低分生孢子的萌發(fā)率,且隨著SFB-1菌液濃度的增加,對病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果越強,1×102 CFU/mL的 SFB-1菌液處理的孢子萌發(fā)率最高(60.99%),抑制率為25.67%,1×107 CFU/mL的SFB-1菌液處理的孢子萌發(fā)率最低(4.43%),抑制率為94.63%(圖7)。上述結(jié)果說明,SFB-1菌株以劑量依賴的方式顯著抑制病原菌的分生孢子萌發(fā)。
2.6 拮抗菌株SFB-1無菌上清液是抑菌的主要活性物質(zhì)
為研究拮抗菌株SFB-1抑制菊花枯萎病菌的主要活性物質(zhì),本研究以無菌水和LB培養(yǎng)液為對照,探究SFB-1發(fā)酵菌液(1×107 CFU/mL)、無菌上清液和重懸菌體液對病原菌Foc的菌絲生長、分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)的影響。由表4可知,與無菌水和LB培養(yǎng)液相比,SFB-1發(fā)酵菌液、無菌上清液和重懸菌體液均能顯著抑制病原菌的菌絲生長,降低分生孢子的產(chǎn)量和萌發(fā)率。SFB-1無菌上清液和發(fā)酵菌液對菊花枯萎病菌的菌絲生長的抑制作用無顯著差異,抑制率分別為72.36%、73.07%,但卻顯著高于重懸菌體液處理組(表4)。此外,SFB-1無菌上清液和發(fā)酵菌液處理的病菌產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率也顯著低于重懸菌體液處理組(表4)。上述結(jié)果暗示了SFB-1無菌上清液中含有抑制菊花枯萎病菌生長的主要活性物質(zhì)。
3 討論與結(jié)論
由尖孢鐮刀菌菊花?;鸵鸬目菸∈亲顕乐氐耐羵鞑『χ?,在菊花的整個生育期均有發(fā)生,造成嚴重的產(chǎn)量損失[24]。菊花枯萎病的防治長期依賴于化學(xué)藥劑,易導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和土壤微生態(tài)惡化等一系列問題[3]。近年來,有益微生物以其低殘留、無毒害、對環(huán)境友好等優(yōu)勢受到越來越多人的關(guān)注,針對植物枯萎病的生物防治國內(nèi)外開展了大量的研究。美國已經(jīng)獲得用于防治尖孢鐮刀菌引起的豆類、麥類、棉花及花生枯萎病的商品化生物菌劑GB03(商品名為Kodiak)、MB1600(商品名為Subtilex)和FZB24(商品名為TaegroTM)[16,25-26]。多黏擬桿菌NSY50是一種潛在的生物防治劑,具有較好的防治黃瓜枯萎病的效果[27]。黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)的枯草芽孢桿菌菌劑,可用于防治黃瓜枯萎病和保護地蔬菜枯萎病,已大面積推廣[14,28]。但關(guān)于菊花枯萎病的生防菌株的研究比較少。因此,本研究從江蘇省鹽城市菊花主產(chǎn)區(qū)發(fā)病田塊中健康植株的根際土壤中分離獲得393株細菌,有7株拮抗細菌對病原菌Foc的抑菌率達55%以上,其中,對峙培養(yǎng)5 d,菌株 SFB-1 對菊花枯萎病菌的拮抗作用最高,抑菌率高達72.55%,且對6種常見植物病原真菌(西瓜枯萎病菌、蠶豆赤斑病菌、甘薯根腐病菌、甘薯白絹病菌、小麥赤霉病菌和小麥莖基腐菌)均表現(xiàn)出良好的抑菌作用。經(jīng)細菌形態(tài)、生理生化和分子學(xué)鑒定分析,明確SFB-1菌株為解淀粉芽孢桿菌。防效試驗結(jié)果顯示,SFB-1菌株可顯著降低菊花植株的病情指數(shù),防效高達70.27%。綜合上述結(jié)果表明, 菌株SFB-1是一株具有廣譜抑菌活性的根際土壤生防細菌,對菊花枯萎病具有較好的防治效果,生防潛力和應(yīng)用前景良好。
解淀粉芽孢桿菌是一種與芽孢桿菌極相似,可產(chǎn)芽孢、逆境耐受力好、抑菌譜廣、安全有效的益生細菌[15]。關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的抑菌作用機制主要包括2個方面,一方面是阻礙菌絲的生長使其畸形消融、斷裂、萎縮和原生質(zhì)體外漏等;另一方面是降低分生孢子的萌發(fā)率[29]。朱娜等研究發(fā)現(xiàn),解淀粉芽孢桿菌TS-1203能明顯抑制膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)菌絲生長和孢子萌發(fā),對蘋果炭疽葉枯病的防效達70.1%[30]。解淀粉芽孢桿菌QSB-6對鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)有較強的抑制作用,可引起菌絲體膨大變粗、破裂以及原生質(zhì)體滲漏[31]。本研究發(fā)現(xiàn),SFB-1發(fā)酵菌液對菊花枯萎病菌Foc的菌絲生長具有很強的抑制作用,顯微下觀察發(fā)現(xiàn),無菌水對照處理的病原菌Foc菌絲粗細均勻,表面光滑,SFB-1發(fā)酵菌液抑制了菌絲生長,導(dǎo)致其出現(xiàn)扭曲畸形、分支變多變短、部分菌絲變透明、消融、斷裂等現(xiàn)象。同時,SFB-1發(fā)酵菌液以劑量依賴的方式顯著降低病原菌Foc分生孢子產(chǎn)量和孢子萌發(fā)率,1×107 CFU/mL 終濃度的SFB-1發(fā)酵菌液處理的病原菌產(chǎn)孢量為2.38×105 個/mL,抑制率達90%,孢子萌發(fā)率僅為4.43%,萌發(fā)抑制率高達94.63%。表明SFB-1發(fā)酵菌液可通過直接抑制菊花枯萎病菌菌絲生長,降低分子孢子產(chǎn)量和萌發(fā)率,從而達到抑制病原菌的作用。此外,SFB-1 菌液和病原菌共處理的菊花離體葉片,較對照組葉片發(fā)病程度較輕,病斑擴展直徑顯著下降,表明解淀粉芽孢桿菌SFB-1能夠顯著抑制菊花枯萎病菌Foc的侵染,有效遏制病斑在菊花葉片上的擴展。
王文迪等報道解淀粉芽孢桿菌可通過菌體本身或胞外代謝產(chǎn)物(多種酶類、脂肽類物質(zhì)和抑菌蛋白等)抑制植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā),從而大幅度降低病害的發(fā)生和嚴重程度[29]。例如,Cui等利用GFP熒光標記解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2,并監(jiān)測其在玉米根際和組織中的定殖模式,發(fā)現(xiàn)B9601-Y2大量定殖于玉米主根、根毛和根之間的連接處,隨后進入莖和葉,直接抑制玉米葉枯病菌(Bipolaris maydis)的生長,降低病害的嚴重程度[32]。解淀粉芽孢桿菌BA-26胞外產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)能破壞灰葡萄孢菌(B.cinerea)的細胞結(jié)構(gòu),引起菌絲膨大變粗并抑制孢子萌發(fā)[33]。Al-Mutar等報道,解淀粉芽孢桿菌DHA6發(fā)酵菌液中含有大量的脂肽類物質(zhì)(伊枯草菌素、表面活性素和芽孢菌霉素等),能破壞西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)菌絲體結(jié)構(gòu),抑制病原真菌生長[34]。本研究中發(fā)現(xiàn),SFB-1 發(fā)酵菌液、無菌上清液和重懸菌體液對病原菌Foc的菌絲生長、分生孢子產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)均有抑制作用。SFB-1發(fā)酵菌液和無菌上清液對病原菌Foc的抑制作用無顯著差異,但其抑菌效果顯著強于重懸菌體液處理組。表明拮抗細菌SFB-1無菌上清液中含有重要的抗菌活性物質(zhì),后續(xù)將進一步分析鑒定抗菌活性物質(zhì)的具體成分,驗證其抑菌功能,解析SFB-1菌株對菊花枯萎病的防控機理,為菊花枯萎病的綠色防控提供基礎(chǔ)。
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