王淑娟+王+君+鄧方寧+姜翠鳳+李慶達(dá)

摘 要：目的：實驗通過采集黃河三角洲地區(qū)耐鹽植物鹽芥的根際土壤，采用Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法3種方法提取根際土壤的總DNA，測定提取的純度和濃度。方法：對以上3種方法進(jìn)行改進(jìn)后，獲得了較高的DNA質(zhì)量和提取率。結(jié)果：采用SDS加蛋白酶K和溶菌酶的方法，提取總DNA的濃度為145.3μg/g，A260/A280為1.82；在高鹽改進(jìn)法中將樣品反復(fù)凍融5次，提取總DNA的濃度為141.3μg/g，A260/A280為1.81。優(yōu)化后的提取方法均得到了純度較高的DNA樣品，本實驗為后續(xù)微生物多樣性的研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鹽芥；根際土壤；總DNA

中圖分類號 Q89 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）22-0042-02

Abstract：Objective：Total DNA of the rhizosphere soil from the salt-tolerant plants Thellungiella salsugineain the Yellow River Delta was extracted by Martin method， SDS method and improved high-salt method. Method：Two modified methods were obtained. Conclusion：From the SDS method added with protease K and lysozyme， the concentration of total DNA was 145.3μg/g， A260/A280 was 1.82. After 5 times of frozen-melt treatments， 141.3μg/g total DNA concentration was obtained using improved high-salt method， A260/A280 was 1.81. These two methods got purified DNA samples， and provided the foundation for the further research of microbial diversity.

Key words：Thellungiella salsuginea；Rhizosphere soil；Total DNA

2000年，山東師范大學(xué)逆境植物實驗室首次提議將鹽生植物鹽芥作為研究植物耐鹽性的又一模式系統(tǒng)[1]。濱州地處黃河三角洲，瀕臨渤海，多鹽漬土壤，適宜鹽生植物鹽芥的生長[1]。本實驗采集了鹽芥根際土壤，運(yùn)用Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法3種方法提取土壤中的總DNA，用核酸蛋白測定儀測定其純度。通過對3種方法進(jìn)行改良，獲得了較高濃度和純度的根際土壤總DNA，為后續(xù)微生物多樣性的研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑與藥品 EDTA、Tris-HCl、CTAB、SDS、70%的乙醇、異丙醇、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、溶菌酶、蛋白酶K等一系列實驗藥品。

1.2 實驗主要使用儀器 恒溫振蕩培養(yǎng)箱、核酸蛋白測定儀、臺式高速冷凍離心機(jī)、Biorad凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀。

1.3 實驗樣品 采取鹽生植物鹽芥的根際土壤。選取4個地點采集鹽芥，每一個地點采集2株鹽芥作為實驗對象，把同一個采樣點的2株鹽芥根際土壤混合，做為實驗樣品，4℃冰箱中保存以備用。

2 實驗方法

2.1 Martin法 稱取1g土樣分別加入4個5mL無菌離心管中，依次加入0.8g酸洗石英砂，3mLDNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸鹽，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8）[2]，渦旋混勻后，在恒溫震動培養(yǎng)箱中以225r/min分別震蕩2h、4h、6h、8h后，在低溫高速離心機(jī)中4℃下12000r/min離心15min，用移液槍取上清液移到1.5mL 離心管中，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻，以12000r/min離心15min后，移到離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫沉淀過夜，4℃下12000r/min離心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存。

2.2 SDS法[3] 稱取1g土樣分別加入4個5mL無菌離心管中，依次加入1.35mLDNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸鹽，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8），4和5號離心管加入10μL蛋白酶K，6、7號離心管加入20μg/mL的溶菌酶和10μL蛋白酶K，在恒溫震動培養(yǎng)箱中以225r/min震蕩2h，再加入0.15mL的20%SDS，60℃水浴2h，每隔15min輕輕顛倒幾下，水浴結(jié)束后室溫12000r/min離心15min，用移液槍收集上清于1.5mL離心管中，在沉淀中再加入0.45mL的DNA提取液和50μL20%的SDS，在振蕩器上渦旋15s，60℃水浴15min，室溫下12000r/min離心10min后，用移液槍取上清液移到1.5mL離心管中，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）混勻，以12000r/min離心15min后，移到離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫沉淀過夜，4℃下12000r/min離心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存。

2.3 高鹽改進(jìn)法 稱取1g土樣分別加入3個5mL無菌離心管中，依次加3mL DNA提取液（100mmol/L Tris-HCL，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸鹽，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8），渦旋混勻，加入20μL蛋白酶K，37℃水浴30min，中間混勻數(shù)次，然后加入0.3mL 20% SDS在60℃下水浴2h，每隔15min混勻顛倒一次，然后放入-70℃中冷凍15min。再放入60℃水浴中融化15min，分別反復(fù)3次，5次，7次。凍融結(jié)束后4℃下12000r/min離心15min，移到1.5mL 離心管中，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25：24：1）混勻，12000r/min離心15min后移到離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫沉淀過夜，4℃下12000r/min離心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存[4，5]。endprint

2.4 根際土壤總DNA的濃度分析 將所提取到的總DNA各吸取1μL，用核酸蛋白測定儀下測定其濃度和純度。

3 結(jié)果與分析

3.1 根際土壤總DNA的提取 將運(yùn)用改良的Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法對提取出來的的總DNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖1所示，泳道1、2、3分別是高鹽改進(jìn)法反復(fù)凍融3次，5次，7次的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融5次時DNA濃度較高（泳道2）；泳道4，5是SDS法中添加蛋白酶K，泳道6，7是SDS法中添加蛋白酶K和溶菌酶，發(fā)現(xiàn)后者濃度較高（如泳道6），但出現(xiàn)拖尾，說明DNA出現(xiàn)斷裂。泳道8，9，10和11是采用Martin法分別振蕩2h，4h，6h和8h時的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)振蕩6h和8h得到的樣品濃度較高（泳道10和11），但是振蕩8h的條帶有明顯的拖尾，說明振蕩時間太久使得DNA斷裂。

3.2 根際土壤總DNA的分析 將提取的DNA用核算分析儀測定濃度和純度，如表1所示。結(jié)果表明，2種改良方法獲得了較高的DNA濃度和純度。一種是改良的SDS法，即在SDS法中加蛋白酶K和溶菌酶，提取總DNA的濃度為145.3μg/g，A260/A280為1.82；第二種是改良的高鹽法，即在高鹽改進(jìn)法中將樣品反復(fù)凍融5次，提取總DNA的濃度為141.3μg/g，A260/A280為1.81。

4 結(jié)論

微生物多樣性的研究是基于根際土壤總DNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，因此，選取有效簡便的方法成為根本。本實驗對Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法3種總DNA提取方法進(jìn)行了改良，高效提取鹽芥根際土壤種的總DNA，對后續(xù)微生物多樣性分析實驗奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[2]陳旭玉，周亞奎，鄭服從，等.橡膠林土壤微生物2種DNA提取方法的比較[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008， 28（03）：22-23.

[3]張海燕，王彩虹，龔明福，等.一種簡單有效且適于土壤微生物多樣性分析的DNA提取方法[J].生物技術(shù)通報，2009，25（08）：49-50.

[4]Tebbe CC， Vahjen W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast[J]. Appl Environ Microbiol，1993，59（2）：657-665.

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（責(zé)編：張宏民）endprint