摘" 要：為了探索冰結(jié)構(gòu)蛋白（ice structuring proteins，ISPs）對(duì)低溫（4 ℃）保存下豬精液保存效果的影響，向不同稀釋倍數(shù)的豬精液中添加不同濃度的ISPs，于24、48、72、96、120 h后，測(cè)定各試驗(yàn)組豬精子前向運(yùn)動(dòng)比例和總活率。結(jié)果顯示：向稀釋8倍的豬精液中添加100 μg/mL ISPs，低溫（4 ℃）保存24 h、48 h后，精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著提高（P＜0.05），精子總活率沒(méi)有顯著變化，但其他試驗(yàn)組精子前向運(yùn)動(dòng)比例和總活率均較低；向稀釋2倍的豬精液中添加10 μg/mL ISPs，低溫（4 ℃）保存24 h和120 h后，精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著提高（P＜0.05），精子總活率沒(méi)有顯著變化，添加100 μg/mL ISPs，低溫（4 ℃）保存24 h后，精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著提高（P＜0.05），精子總活率沒(méi)有顯著變化；向去除精漿并稀釋到原密度的豬精液中添加100 μg/mL ISPs，低溫（4 ℃）保存48 h后，精子前向運(yùn)動(dòng)比例和總活率顯著提高（P＜0.05）。結(jié)果表明，豬精液中添加100 μg/mL ISPs，低溫（4 ℃）保存48 h后，均能顯著提高精子前向運(yùn)動(dòng)比例，為豬精液低溫保存提供數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞：冰結(jié)構(gòu)蛋白；不同精漿含量；精子前向運(yùn)動(dòng)比例；精子總活率

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）06-0042-08

基金項(xiàng)目：上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院?；穑↘Y6-0000-24-02）

作者簡(jiǎn)介：尚月麗，博士，主要研究方向?yàn)樯成?/p>

*通信作者：韓雪峻，主要研究方向豬精液冷凍保存及推廣應(yīng)用

全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中，人工授精使用率超過(guò)90％，豬精液長(zhǎng)途運(yùn)輸是優(yōu)秀種公豬基因傳播的主要途徑[1]。目前國(guó)內(nèi)外精液保存分為常溫液態(tài)保存（15～20 ℃）、低溫液態(tài)保存（4～10 ℃）和超低溫冷凍固態(tài)保存（液氮－196 ℃，或干冰" －80 ℃）。超低溫冷凍保存容易破壞精子膜、頂體、精子活力等，降低精子受精能力[2]，在生產(chǎn)實(shí)踐中受到限制，全球使用率不到1％[3]。精液常溫液態(tài)保存一般維持在17 ℃，可以減緩精子代謝，延長(zhǎng)精子受精能力，達(dá)到與新鮮精液接近的受孕率和產(chǎn)仔數(shù)[4]。然而，精液收集過(guò)程中可能會(huì)污染細(xì)菌，在17 ℃保存不能阻止細(xì)菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)精子質(zhì)量和功能產(chǎn)生破壞。為了減少抗生素使用，近年來(lái)開(kāi)始探索將精液稀釋，于低溫（4 ℃）保存來(lái)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，從而降低細(xì)菌對(duì)精子的破壞[5]。理論上低溫保存能降低豬精子的代謝水平，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，延長(zhǎng)精液保存時(shí)間。但豬精子對(duì)低溫比較敏感，在低溫環(huán)境容易發(fā)生冷休克現(xiàn)象，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），破壞精子膜的完整性，影響精子受孕能力[6]。

自然界中的抗凍生物在0 ℃以下產(chǎn)生的蛋白能抑制冰晶的形成，也能與細(xì)胞結(jié)合引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，從而提高細(xì)胞對(duì)低溫的抵抗能力，這種蛋白稱為冰結(jié)構(gòu)蛋白（ice structuring proteins，ISPs），也稱冰結(jié)合蛋白，抗凍蛋白，可用于精子、卵子及胚胎的冷凍保存[7]。冰結(jié)構(gòu)蛋白是由細(xì)菌、昆蟲(chóng)、深海魚(yú)、植物等產(chǎn)生[8-9]。利用自然界中這些生物的耐凍機(jī)制，分離出抗凍蛋白，能夠提高冷凍和低溫保存精子的質(zhì)量[10-11]。Masuda等[12]研究發(fā)現(xiàn)，將Ⅲ型抗凍蛋白加入精液稀釋液中，能顯著提高豬冷凍精液復(fù)蘇后精子的活力、線粒體和細(xì)胞膜的完整性以及頂體蛋白水解活性。將抗凍蛋白用于豬精液的低溫保存的研究鮮有報(bào)道。南京百斯杰生物工程有限公司從極地嚴(yán)寒地區(qū)的藍(lán)孢子菌中分離出抗凍基因，利用植物材料發(fā)酵生產(chǎn)出ISPs（BSJ-RD-000162）。在豬肉及牛肉中添加ISPs能夠提高肉的抗凍能力，保持營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味，關(guān)于其對(duì)豬精液低溫保存的影響還有待研究。因此，本研究在不同稀釋倍數(shù)的豬精液中添加ISPs，于4 ℃保存不同時(shí)間后測(cè)定精子的前向運(yùn)動(dòng)比例和總活力，以確定ISPs對(duì)豬精液低溫保存的影響，為豬精液的低溫液態(tài)運(yùn)輸提供數(shù)據(jù)支撐。

1" 材料與方法

1.1 材料

豬精液采自上海祥欣畜禽有限公司東灘種公豬站2～3歲大白公豬。ISPs由南京百斯杰生物工程有限公司提供。豬精液稀釋劑為江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的全能健豬精液稀釋粉保存劑。計(jì)算機(jī)輔助精子分析（computer assisted sperm analysis，CASA）系統(tǒng)購(gòu)自福州鴻視野軟件技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬精液采集

利用手握法采集6頭大白種公豬精液，將采集的精液置于37 ℃保溫箱中1 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，選擇外觀呈乳白色、稍腥而無(wú)異味、密度在2億/mL以上、直線運(yùn)動(dòng)精子70％以上的合格精液，不添加任何抗生素和防腐劑。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)1：將豬精液8倍稀釋，稀釋后分為6組，分別添加0（A1組）、0.1（B1組）、1（C1組）、10（D1組）、100（E1組）、1 000 μg/mL" ISPs（F1組），充分混合，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 1.5 mL。試驗(yàn)重復(fù)3次。

試驗(yàn)2：將豬精液2倍稀釋，稀釋后分為 5組，分別添加0（A2組）、10（B2組）、100（C2組）、1 000（D2組）、3 000 μg/mL ISPs（E2組），充分混合，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1.5 mL。試驗(yàn)重復(fù)3次。

試驗(yàn)3：將豬精液4倍稀釋，2 h內(nèi)溫度過(guò)度到25 ℃，950 r/min離心15 min，去除上層精漿，用精液稀釋劑將精子稀釋至原密度（2億/mL），分為7組，分別添加0（A3組）、0.1（B3組）、1（C3組）、10（D3組）、100（E3組）、1 000（F3組）、3 000 μg/mL ISPs（G3組），充分混勻，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1.5 mL。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 精液低溫保存及回溫

將處理后的精液于17 ℃放置1 h，然后于9 ℃放置1 h，4 ℃保存?zhèn)溆?。分別于4 ℃保存24、48、72、96、120 h后取出，先9 ℃放置1 h，17 ℃放置2 h，然后室溫25 ℃平衡2 h，37 ℃孵育5 min，待精子活力恢復(fù)后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 測(cè)定精子質(zhì)量指標(biāo)

將精子調(diào)整為統(tǒng)一密度，取5 μL精液滴加于載玻片檢測(cè)腔室中，置于37 ℃恒溫載物臺(tái)上，利用計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀測(cè)定精子質(zhì)量指標(biāo)。測(cè)定指標(biāo)為：精子總活力，指精子運(yùn)動(dòng)速率大于20 μm/s的精子比例；精子前向運(yùn)動(dòng)比例，指直線率大于75％、運(yùn)動(dòng)速率大于50 μm/s的精子比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel初步整理后，應(yīng)用GraphPad Prism Vol.10.2.1統(tǒng)計(jì)分析作圖軟件的單因素方差分析程序（ANOVA）來(lái)分析各組間的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2" 結(jié)果與分析

2.1 ISPs對(duì)稀釋8倍精液4 ℃保存效果的影響

如表1所示，將精液8倍稀釋后，相比對(duì)照組A1，添加1 000 μg/mL ISPs顯著提高了" " 4 ℃保存24、48、96 h后精子總活力（P＜0.05）；而添加0.1 μg/mL ISPs于4 ℃保存24 h后，精子總活力顯著下降（P＜0.05）。

如表2所示，將精液8倍稀釋后，與對(duì)照組A1相比，添加0.1、1、10、100 μg/mL ISPs，均顯著提高了4 ℃保存24 h后精子前向運(yùn)動(dòng)比例（P＜0.05）；添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存48 h后精子前向運(yùn)動(dòng)比例（P＜0.05），但保存72 h后，精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著降低（P＜0.05）；添加1 000 μg/mL ISPs時(shí)，4 ℃保存120 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著降低（P＜0.05）。

總的來(lái)說(shuō)，將精液8倍稀釋后，添加100 μg/mL ISPs能顯著提高4 ℃保存48 h的精子前向運(yùn)動(dòng)比例，而對(duì)精子總活力沒(méi)有顯著影響，但這兩個(gè)指標(biāo)均較低。

2.2 ISPs對(duì)稀釋2倍精液4 ℃保存效果的影響

如表3所示，將精液2倍稀釋后，與對(duì)照組A2相比，添加100 μg/mL ISPs顯著抑制了4 ℃保存48 h的精子總活力（P＜0.05），對(duì)其他保存時(shí)間的精子總活力沒(méi)有顯著影響；而添加" " " " 1 000 μg/mL ISPs顯著降低了4 ℃保存48、72、96、120 h后的精子總活力（P＜0.05）；添加3 000 μg/mL ISPs均顯著抑制了精子總活力（P＜0.05）。

如表4所示，將精液2倍稀釋后，與對(duì)照組A2相比，添加10 μg/mL ISPs，4 ℃保存24、120 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著提高（P＜0.05）；添加100 μg/mL ISPs，4 ℃保存24 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著提高（P＜0.05），但保存48 h卻顯著降低（P＜0.05）；添加1 000 μg/mL ISPs，4 ℃保存24 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著提高（P＜0.05），但其他時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P＜0.05）；添加3 000 μg/mL ISPs，各時(shí)間點(diǎn)的精子前向運(yùn)動(dòng)比例均顯著下降（P＜0.05）。

總的來(lái)說(shuō)，將精液2倍稀釋后，添加10 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存精子前向運(yùn)動(dòng)比例，對(duì)精子總活力沒(méi)有影響；添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存24 h的精子前向運(yùn)動(dòng)比例，并對(duì)精子總活力沒(méi)有影響。

2.3 ISPs對(duì)無(wú)精漿精液4 ℃保存效果的影響

如表5所示，在無(wú)精漿精液中添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存48 h的精子總活力" （P＜0.05），而對(duì)其他時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有影響；添加1、10 μg/mL ISPs對(duì)大部分保存時(shí)間的精子總活力沒(méi)有影響；而添加0.1、3 000 μg/mL ISPs顯著降低了所有保存時(shí)間的精子總活力（P＜0.05），添加1 000 μg/mL ISPs也顯著降低了大部分保存時(shí)間的精子總活力（P＜0.05）。

如表6所示，在無(wú)精漿精液中添加100 μg/mL ISPs，4 ℃保存48 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著提高（P＜0.05），而在96 h顯著下降（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化；添加0.1、3 000 μg/mL ISPs，所有保存時(shí)間的精子前向運(yùn)動(dòng)比例均顯著下降（P＜0.05）；添加1、10 μg/mL ISPs，大部分保存時(shí)間的精子前向運(yùn)動(dòng)比例沒(méi)有顯著變化；添加1 000 μg/mL ISPs，4 ℃保存96、120 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例顯著降低（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化。

總的來(lái)說(shuō)，在無(wú)精漿精液中添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存48 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例和精子總活力。

3" 討論

目前種豬精液通常經(jīng)稀釋后在17 ℃條件下進(jìn)行運(yùn)輸，不過(guò)有報(bào)道稱，將精漿增加到10％，于17 ℃保存72 h會(huì)顯著降低精子活力[13]，引發(fā)頂體獲能、分泌[14]。近來(lái)有研究提出通過(guò)稀釋降低保存溫度，以減少抗生素使用[15]。不過(guò)，精液在－5～5 ℃處于冰晶潛熱階段，由液相變?yōu)楣滔鄷r(shí)會(huì)釋放熱量，同時(shí)精子會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，破壞精子膜完整性[6]。雖然4～5 ℃保存可以有效抑制細(xì)菌增殖，但隨著溫度降低直線運(yùn)動(dòng)精子會(huì)大量減少[16]，為了提高精子前向運(yùn)動(dòng)比例，有研究報(bào)道添加20％蛋黃[17]或20％脫脂奶粉[4]可幫助精子對(duì)抗低溫，但精子前向運(yùn)動(dòng)比例在保存24 h后迅速下降，維持在30％～45％。在試驗(yàn)1中發(fā)現(xiàn)，ISPs能提高" 4 ℃保存精子前向運(yùn)動(dòng)比例，但均維持在較低水平。在試驗(yàn)1的基礎(chǔ)上，將精液2倍稀釋，添加ISPs后發(fā)現(xiàn)，精子總活力由之前的10％左右提高到70％左右，且4 ℃保存120 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例也有大幅提高，接近國(guó)標(biāo)規(guī)定的70％。本研究一定程度上顯著提高了豬精液4 ℃保存時(shí)的精子前向運(yùn)動(dòng)比例，延長(zhǎng)了保存時(shí)間，有望拓寬豬精液低溫液態(tài)保存運(yùn)輸。

在本研究中，將精液2倍稀釋，在較長(zhǎng)的保存時(shí)間內(nèi)，精子都保持著較高的前向運(yùn)動(dòng)比例，而將精液8倍稀釋或去除精漿，ISPs的添加效果只能持續(xù)48 h，表明ISPs持續(xù)發(fā)揮其抗低溫作用可能與精漿有關(guān)。ISPs由自然界生物自身產(chǎn)生，可以保持血液或者體液在冰點(diǎn)以下正常運(yùn)行[7，18]，接近或者完全一致的動(dòng)物體液環(huán)境可能更能促進(jìn)ISPs發(fā)揮其抗凍功能。不過(guò)具體的活性機(jī)制不清楚，需要進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，在太平洋鮑魚(yú)精液中添加" " "10 μg/mL ISPs能提高冷凍保存精子的活率，提高精子頂體的完整性、膜完整性、線粒體膜電位，提高受孕率和孵化率[19]。ISPs能顯著提高鱘魚(yú)精子活率[20]，減少冷凍保存對(duì)安卡拉鴨精子DNA的損傷[21]。研究顯示，添加1 μg/mL ISPs能提高雞精子前向運(yùn)動(dòng)比例和總活力，提高精子膜功能和線粒體活性，提高受孕率和孵化率[22]。冷凍保存時(shí)加入ISPs能顯著提高食蟹獼猴精子活力，提高線粒體膜電位比例，通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞分子功能和精子生物學(xué)過(guò)程提高冷凍精子質(zhì)量[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同精漿含量的精液中添加100 μg/mL ISPs，4 ℃保存時(shí)對(duì)精子均有較好的保護(hù)作用。在不同物種上的研究表明，低溫及超低溫保存時(shí)添加ISPs對(duì)不同物種精子有保護(hù)作用。

不過(guò)也有不一樣的結(jié)果，添加10 μg/mL ISPs顯著提高了水牛精子冷凍保存時(shí)前向運(yùn)動(dòng)比例，提高了精子膜完整性，不過(guò)對(duì)精子4 ℃保存沒(méi)有任何作用[24]。但是該研究只測(cè)定了ISPs對(duì)精子4 ℃保存2 h的效果，可能是時(shí)間太短，ISPs還沒(méi)有發(fā)揮作用。該研究使用的是無(wú)精漿保存，與本研究的試驗(yàn)3類似，本研究也發(fā)現(xiàn)ISPs對(duì)精子前向運(yùn)動(dòng)比例和總活力的效果在4 ℃保存48 h才顯示出。在羊上的研究表明，冷凍保存時(shí)在精液中加入ISPs，隨著添加水平的增加，精子活力下降，精子質(zhì)膜完整性和低滲耐受性也下降[25]，這可能是因?yàn)檠蚓幽そY(jié)構(gòu)與豬精子膜結(jié)構(gòu)中脂質(zhì)含量不同。

在本研究中，添加1 000 μg/mL或以上ISPs對(duì)精子前向運(yùn)動(dòng)比例有顯著的抑制作用，與報(bào)道高濃度ISPs對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用有關(guān)[8]，但是也有報(bào)道稱ISPs安全無(wú)毒[26]，與本研究中高濃度表現(xiàn)出副作用和中等濃度的促進(jìn)作用類似，與之前的報(bào)道基本類似。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，ISPs對(duì)豬精液4 ℃保存效果受劑量和時(shí)間影響，還與精液中精漿含量有關(guān)。在不同精漿含量的豬精液中添加100 μg/mL ISPs，可以提高4 ℃保存48 h精子前向運(yùn)動(dòng)比例；通過(guò)在2倍稀釋精液中添加100 μg/mL ISPs，精子4 ℃保存120 h仍能維持較高的前向運(yùn)動(dòng)比例。本研究為拓寬豬精液低溫液態(tài)保存運(yùn)輸提供了數(shù)據(jù)支撐。

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