摘要：[目的]基于HSFB1基因，從CDS水平探討銀白楊、響葉楊和中國山楊不同群體的遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及群體遺傳變異與適應(yīng)異質(zhì)環(huán)境之間的關(guān)系。[方法]提取HSFB1基因在各楊樹樣本中的CDS序列，并對各CDS序列分別進(jìn)行遺傳多樣性、中性檢驗(yàn)和單倍型分析。[結(jié)果]HSFB1基因在銀白楊群體中的單倍型多樣性和核苷酸多態(tài)性最低，在響葉楊和西南山楊群體中較低，在北方山楊和中部山楊群體中最高。各楊樹群體中該基因的中性檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著。CDS1系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，外類群首先分枝為響葉楊和中國山楊，銀白楊則聚于末端。CDS2單倍型分析顯示，北方與中部山楊群體單倍型種類豐富，西南山揚(yáng)、響葉楊和銀白楊群體單倍型種類相對較少。[結(jié)論]不同楊樹物種和群體在應(yīng)對我國復(fù)雜多變的地理環(huán)境和氣候條件的過程中體現(xiàn)出不同的適應(yīng)和演化特征。

關(guān)鍵詞：銀白楊；響葉楊；中國山楊；HSFB1；遺傳多樣性；單倍型網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號(hào)：S792.11；Q941+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2024）06-0112-09

楊屬（Populus）植物在北半球有廣泛的自然分布，在南半球熱帶地區(qū)（如非洲、南美洲）也有少量分布。楊屬物種及其雜交種因其生長迅速，壽命長，適應(yīng)性強(qiáng)，便于營養(yǎng)繁殖，是林業(yè)和園林綠化中的重要樹種，同時(shí)也是木材生產(chǎn)、造紙和其他木制品生產(chǎn)行業(yè)的重要植物原材料，具有巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中國楊樹資源十分豐富，幾乎遍及全國各地，人工林面積居世界之首。白楊組（Sect.Populus）楊樹在我國分布范圍最廣，從寒溫帶針葉林區(qū)到亞熱帶常綠闊葉林區(qū)，從溫帶草原和荒漠區(qū)到青藏高原高寒植被區(qū)均有生長，是研究楊樹適應(yīng)性性狀演化的理想材料嘲。

銀白楊（Populus alba L.）、響葉楊（PopuIusadenopoda Maxim）和中國山楊（Populusdavidiana Dode）是我國白楊組楊樹的幾種代表性物種。銀白楊原產(chǎn)于新疆，于東北、華北、西北和西藏等地區(qū)皆有栽培，耐寒抗旱，但不耐濕熱；響葉楊主要集中分布于東南地區(qū)，喜光，喜溫暖濕潤，耐寒性較差；中國山楊分布廣泛，呈現(xiàn)出從東北到華中到西南的方向性分布，耐寒冷、耐干旱貧瘠土壤。不同的環(huán)境和氣候條件塑造了不同地區(qū)楊樹物種和群體在耐熱性方面的差異。

隨著全球氣候變暖，高溫脅迫通過抑制光合作用，影響蛋白質(zhì)和膜的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)活性氧（ROS）的積累，改變植物激素的產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等不利作用，已成為影響植物代謝和生長發(fā)育的主要環(huán)境脅迫之一。在此情況下，植物也進(jìn)化出了相應(yīng)的高溫響應(yīng)機(jī)制。植物熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs）通過調(diào)控?zé)犴憫?yīng)基因的表達(dá)，在植物熱應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。根據(jù)序列相似性和寡聚化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征將植物的HSFs分為A、B、C三族，當(dāng)前的研究主要集中于A族基因，對B族和C族基因的研究相對缺乏。HSFB1是B旅的一個(gè)重要基因，是植物在高溫脅迫下耐熱性增強(qiáng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，有助于植物承受極端溫度的同時(shí)保持正常的細(xì)胞功能。

CDS序列（coding sequence）是指在基因組DNA中能夠編碼蛋白質(zhì)的序列，對CDS序列的比較研究有助于揭示基因的功能、變異與演化。本研究利用白楊組3種楊樹（銀白楊、響葉楊和中國山楊）在中國不同地理分布區(qū)的樣本，對各群體HSFB1基因的CDS序列進(jìn)行遺傳多樣性、單倍型網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)發(fā)育等分析，探討銀白楊、響葉楊和中國山楊群體遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系，解析群體遺傳變異與環(huán)境異質(zhì)性的關(guān)系，并為進(jìn)一步研究楊樹的耐熱機(jī)制以及后續(xù)耐高溫楊樹種的培育提供重要的科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣本采集與DNA測序

對中國自然分布的3種白楊組楊樹進(jìn)行了野外采樣，橫跨南北，涵蓋16個(gè)省、自治區(qū)、直轄市。采集了銀白楊4個(gè)種群的27個(gè)個(gè)體、響葉楊4個(gè)種群的28個(gè)個(gè)體和中國山楊27個(gè)種群的104個(gè)個(gè)體（其中包含北方山楊8個(gè)種群的30個(gè)個(gè)體，中部山楊9個(gè)種群的29個(gè)個(gè)體，以及西南山楊10個(gè)種群的45個(gè)個(gè)體），利用全球定位系統(tǒng)測量并記錄各樣本經(jīng)緯度信息。采集嫩葉，經(jīng)硅膠迅速干燥后于冰箱-80℃保存，用于提取3種楊樹的總DNA，檢測合格后委托北京貝瑞基因生物技術(shù)公司進(jìn)行基因組重測序，并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和初步處理。

1.2測序數(shù)據(jù)處理與HSFB1基因cos序列提取

基于本研究組正在進(jìn)行的2項(xiàng)研究，獲得了27個(gè)銀白楊個(gè)體、28個(gè)響葉楊個(gè)體和104個(gè)中國山楊個(gè)體的基因組重測序數(shù)據(jù)，使用BWA軟件（v0.7.17）分別與各自物種的參考基因組進(jìn)行比對（銀白楊yiYChr.fa、響葉楊yiXChr，fa和歐洲山楊Potra02_genome.fasta），輸出的結(jié)果文件（.bam）使用samtools軟件（v0.1.19）和bdtools軟件（v1.14）進(jìn)行處理，最終得到每個(gè)采樣個(gè)體的基因組全長序列文件（.fa）。

于NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nihgov/）獲取擬南芥HSFB1基因（AT4G36990）的蛋白質(zhì)序列，利用BLASTp軟件（v2.14.1）分別與銀白楊、晌葉楊、歐洲山楊（Populus tramula L.）以及毛果楊（Populus trichocarpa Torr＆Gray ex Hook.）（后續(xù)分析用作外類群）的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對?；谧罴驯葘Y(jié)果，可獲得HSFBI基因在上述4種楊樹中對應(yīng)的基因號(hào)。利用基因組注釋文件（銀白楊y.gene，gff3、響葉楊x.gene.gff3、歐洲山楊Potra02_genes，gff和毛果楊Ptrichocarpa_444_v3.1.gene.gff3）查找和獲取該基因在各楊樹基因組所在的位置和CDS區(qū)間，并使用gffread軟件（v0.12.7）從上一步獲得的銀白楊、響葉楊和中國山楊每個(gè)采樣個(gè)體的基因組序列文件以及毛果楊參考基因組序列文件中提取HSFB1基因的CDS序列，最后對4種楊樹所有個(gè)體的同一CDS序列進(jìn)行合并，用于后續(xù)的分析。

1.3遺傳多樣性、中性檢驗(yàn)和單倍型分析

單倍型多樣性（H）和核苷酸多樣性（π）是衡量物種遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)，其值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富。借助DnaSP軟件（v6.12.03），基于HSFB1基因的每個(gè)CDS序列合并文件，對銀白楊、響葉楊和中國山楊各群體中該基因的CDS多態(tài)性進(jìn)行分析：計(jì)算單倍型數(shù)量（Nh）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多態(tài)性（π）、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量（S）、Watterson's多態(tài)性估值（Bw）、最小重組事件（Rm）。還計(jì)算了Tajima's D值、Fu and Li's P and D'值以進(jìn)行中性檢驗(yàn)，從CDS水平探測銀白楊、響葉楊和中國山楊的群體歷史動(dòng)態(tài)及其在適應(yīng)環(huán)境和分化過程中的自然選擇信號(hào)。

以毛果楊為外類群，利用MEGA11軟件的鄰域連接（NJ）法，對HSFB1基因的每個(gè)CDS分別進(jìn)行單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，以分析不同楊樹群體之間的聚類情況和進(jìn)化關(guān)系。使用Network 10.2軟件的中間連接（MJ）法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)銀白楊、響葉楊和中國山楊群體的采樣信息和各采樣點(diǎn)單倍型種類及數(shù)量，繪制單倍型地理分布比例圖。

2結(jié)果

2.1HSFB1基因CDS水平的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)

4種楊樹與擬南芥蛋白質(zhì)序列比對的最佳結(jié)果顯示，HSFB1基因在銀白楊、響葉楊、歐洲山楊和毛果楊中對應(yīng)的基因號(hào)分別為evm.model.Chr07.389、evm.modeI.Chr07.416、Potra2n7e 16268.1和Potri.007G043800.1.p。4種楊樹的基因組注釋文件（gff3）皆顯示HSFB7基因位于第7號(hào)染色體，含有2個(gè)CDS區(qū)。對該基因2個(gè)CDS序列在銀白楊、響葉楊和3個(gè)中國山楊群體中的遺傳變異分析的結(jié)果如表1。

核苷酸多態(tài)性（π）顯示，在物種間，銀白楊中HSFB7基因2個(gè)CDS序列π的均值（π=0.001 2）略低于響葉楊（π=0.0016），明顯低于中國山楊（π=0.004 2）。而在中國山楊物種內(nèi)部，西南山楊（π=0.002 5）lt;中部山楊（π=0.0071）lt;北方山楊（π=0.007 4）；考慮多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量的Watterson's多態(tài)性（θw）也表現(xiàn)出類似的趨勢，但銀白楊（θw=0.001 7）高于響葉楊（θw=0.000 9）?？偟膩砜矗谖锓N水平上，銀白楊和響葉楊群體HSFB1基因的CDS具有相對較低的遺傳多樣性，中國山楊遺傳多樣性更高。在種內(nèi)群體水平上，西南山楊群體遺傳多樣性水平低，北方地區(qū)和中部地區(qū)的中國山楊群體遺傳多樣性水平較高。

中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示（表1），從物種水平進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，銀白楊HSFB1基因CDS序列的Fu and Li's D*and P為正，Tajfma's D為負(fù)；響葉楊的Tajima'sD和Fu and Li'sP為正，D*為負(fù)；中國山楊整體的Tajima's D和Fu and Li'sD'and P檢驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)一致均為負(fù)值。據(jù)此本研究推測，響葉楊和銀白楊有經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)的可能性，而中國山楊更可能經(jīng)歷了擴(kuò)張。在中國山楊種內(nèi)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，北方山楊群體的Tajima's D和Fu and Li's F*檢驗(yàn)值為負(fù)，但Fu and Li's D*檢驗(yàn)值為正；中部山楊群體的Tajima's D和Fu and Li'sD'and P檢驗(yàn)結(jié)果均為負(fù)；西南山楊群體的Fuand Li's D*andF+為正，Tajima's D為負(fù)。這說明中部山楊和北方山楊群體可能處于擴(kuò)張階段，西南山楊群體有經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)的可能性。若中性檢驗(yàn)Tajima's D值與Fu and Li's D'and P值均顯著背離0，則說明序列中的核苷酸位點(diǎn)變化偏離中性模型，但檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著。此外，重組分析表明，山楊群體最小重組事件大?。≧m）為1～3，而銀白楊和響葉楊群體中未有重組事件發(fā)生，表明這2種楊樹群體重組水平很低。

2.2HSFB1基因CDS序列的單倍型分析

單倍型檢測結(jié)果表明（表1），在3種楊樹共5個(gè)群體中，HSFB1基因CDS1單倍型多樣性最豐富的是北方山楊（Hd=0.775），單倍型多樣性最低的是響葉楊（ Hd=0.507）。CDS2單倍型最豐富的仍為北方山楊（Hd=0.865），單倍型最為單一的為銀白楊（Hd=0），只有1種單倍型。

以毛果楊為外類群，借助MEGA11構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，HSFB1基因的2個(gè)CDS序列具有不同的樹狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。變異位點(diǎn)較多的CDS1系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1A）顯示出清晰的群體結(jié)構(gòu)：與外類群距離均等分為兩大枝，一枝為響葉楊個(gè)體，另一枝為其他2種楊樹的所有個(gè)體，而該支又進(jìn)一步分為中國山楊所有個(gè)體一枝（北方、中部和西南個(gè)體均隨機(jī)分布），銀白楊個(gè)體一枝聚于末端。這說明銀白楊、響葉楊和中國山楊3種楊樹的HSFB1基因CDS1序列之間存在明顯的分化，但中國山楊內(nèi)部無明顯分化。CDS2序列由于變異位點(diǎn)較少（5個(gè)群體變異位點(diǎn)數(shù)平均值小于5），系統(tǒng)發(fā)育樹皆聚為一枝（圖1B），無明顯分布規(guī)律，說明這3種楊樹分化不明顯，仍共享基因庫。

為進(jìn)一步探究HSFB1基因CDS2序列在銀白楊、響葉楊、中國山楊群體中的變異和演化的模式，結(jié)合采樣信息本課題組繪制了單倍型地理分布比例圖，并構(gòu)建了單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。除外類群毛果楊的單倍型H1外，CDS2共鑒定出17種單倍型。其中，銀白楊群體為單一單倍型H10；響葉楊群體中存在2個(gè)不同的單倍型H10和H18，H10占比更大（57.14％）；北方山楊群體中檢測到11種不同單倍型H3-H8，H10，H13-H16，其中H5（21.67％）、H10 （16.67％）和H4 （16.67％）為主要的單倍型；中部山楊群體中檢測到12種單倍型H2-H6，H8-H13，H17，其中H10（ 44.83％）和H8（15.52％）為主要單倍型；西南山楊群體種中存在4種單倍型H2，H6，H8和H10，其中H2占比最大（90.00％）?？偟膩砜?，最常見的2種單倍型（頻率gt;25％）為：H10（ 38.75％）和H2（26.86％）。H10為唯一一個(gè)在銀白楊、響葉楊、中國山楊所有群體中均有分布的單倍型，H6，H8，H10為中國山楊內(nèi)部共享的3種單倍型。H18為響葉楊特有單倍型，H7、H14、H15和H16為北方山楊特有的4種單倍型，H9、H11、H12和H17為中部山楊特有的4種單倍型，銀白楊和西南山楊無特有單倍型。

最后，Network構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示（圖2），外類群H1首先與H10相連，以H10為中心又分別衍生出其他單倍型，可分為3個(gè)譜系，說明H10最為古老。3種中部山楊特有單倍型（H11、H12、H17）都先與北方山楊特有單倍型H14相連后再與單倍型H10相連，而西南山楊中占比極大的H2單倍型依次通過中部山楊特有單倍型H12、北方山楊特有單倍型H14與單倍型H10相連。據(jù)此，本研究推測H10為祖先單倍型。以上結(jié)果為中國山楊起源于北方地區(qū)，逐漸向南方擴(kuò)散和遷移的推論提供了又一個(gè)有力的證據(jù)。

3討論

遺傳多樣性是生物經(jīng)歷長期演化過程的產(chǎn)物，反映了物種或群體適應(yīng)外部環(huán)境因素變化的能力。熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFB1是植物應(yīng)對高溫脅迫的重要的調(diào)節(jié)因子之一。研究表明，其作為轉(zhuǎn)錄共激活，抑制子負(fù)向調(diào)控?zé)嵴T導(dǎo)基因的表達(dá)，從而正向調(diào)控耐熱性獲得，在提高植物耐熱性方面起著重要作用。利用我國白楊組3種代表性楊樹的5個(gè)天然群體共159個(gè)采樣個(gè)體，對HSFB1基因的2個(gè)CDS序列進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，銀白楊的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多態(tài)性（π）最低，響葉楊和西南山楊較低，北方山楊和中部山楊最高（表1），與前人的研究結(jié)果一致，也符合廣域種一般比窄域種遺傳多樣性更高這一理論，以及山楊分布的高海拔山區(qū)受農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等人類活動(dòng)擾動(dòng)少的現(xiàn)實(shí)情況。不同楊樹群體間遺傳多樣性表現(xiàn)出明顯差異，這可能是受到不同地區(qū)的環(huán)境條件和氣候特征，如溫度、濕度、海拔、光照等因素的影響，群體經(jīng)歷自然選擇發(fā)生局部適應(yīng)的結(jié)果。Tajima's D和Fu and Li's D'andP中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，中部山楊和北方山楊群體可能處于擴(kuò)張階段，而響葉楊、銀白楊和西南山楊群體有經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)的可能性。群體擴(kuò)張有助于遺傳多樣性的提高，而瓶頸效應(yīng)則會(huì)降低遺傳多樣性，這與上文北方和中部山楊群體遺傳多樣性高，響葉楊、銀白楊和西南山楊群體遺傳多樣性低的結(jié)果相對應(yīng)。但中性檢驗(yàn)均不顯著，這與Hou Z等人的對中國山楊和銀白楊的研究結(jié)果一致。

HSFB1基因的CDS1系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，銀白楊、響葉楊和中國山楊物種間存在顯著分化，銀白楊和中國山楊親緣關(guān)系更近；而CDS2單倍型分析表明，3種楊樹中單倍型H10頻率最高且分布最廣泛，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示其與外類群相連且位于網(wǎng)絡(luò)中心，為最古老的祖先單倍型。銀白楊群體中僅一種單倍型H10，這可能與群體內(nèi)變異程度和環(huán)境壓力有極大關(guān)系。干旱化和沙漠化等惡劣環(huán)境因素可能導(dǎo)致了銀白楊群體的遺傳漂變和瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致遺傳多樣性減少，單一單倍型的形成可能是銀白楊群體長期適應(yīng)沙漠環(huán)境的結(jié)果。此外，繁殖方式也會(huì)極大影響遺傳多樣性。對印度喜瑪偕爾邦肯瑙爾地區(qū)的銀白楊群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)銀白楊群體的遺傳多樣性很低，這與本研究的結(jié)果類似。在該研究期間，未觀察到任何開花現(xiàn)象只存營養(yǎng)繁殖，且觀察雜合度（Ho）小于預(yù)期雜合度（He）說明群體中存在近交現(xiàn)象。無性繁殖是楊樹物種的一個(gè)共同特征，銀白楊的根蘗繁殖在某些地區(qū)也較為普遍。由于銀白楊種子萌發(fā)期和幼苗期需要較多的降水，本研究推測新疆地區(qū)的天然銀白楊群體更偏向無性繁殖，這是新疆地區(qū)銀白楊遺傳多樣性低和單倍型單一的另一個(gè)可能原因；響葉楊群體只有2種單倍型H10和H18，且H18為特有單倍型。在當(dāng)前的全球氣候模型中，植物對熱脅迫的代謝適應(yīng)能力仍然較弱，高溫環(huán)境對楊樹生長發(fā)育的限制較大，如夏季高溫可顯著影響青楊（Populus cathayana Rehder）的生長和光合作用，毛白楊（Populus tomentosa Carr.）的可變剪切過程受高溫影響嚴(yán)重。然而響葉楊在東南地區(qū)夏季炎熱多雨的情況下生長良好，故推測新變異H18在響葉楊對亞熱帶季風(fēng)氣候的適應(yīng)上，特別是在高溫脅迫下耐熱性的提升方面，具有極及其關(guān)鍵的作用；而中國山楊群體則擁有最多的單倍型種類，其中北方山楊和中部山楊明顯豐富于西南山楊。在北方，除了中國東北的長白山以及朝鮮半島2個(gè)公認(rèn)的溫帶針闊混交林冰期避難所，Wang J等人對香楊（Populus koreana Rehder）的最新研究又發(fā)現(xiàn)大興安嶺北部避難所的存在。避難所群體往往擁有更高的遺傳多樣性，多個(gè)避難所之間的基因流又使得遺傳多樣性分布格局更加復(fù)雜。本研究顯示，北方山楊的遺傳多樣性和單倍型多樣性最高，這與ZHAO D等人的研究結(jié)果一致，其原因很可能是北方山楊是避難所群體，且中國山楊的遷移路線是從北向南；H2單倍型在兩南山楊中占比極大（90％），在中部山楊中占比較小，而在北方山楊樣本中未發(fā)現(xiàn)存在，這說明H2是高原環(huán)境的優(yōu)勢單倍型。高海拔對楊樹群體結(jié)構(gòu)有重要影響，Li J等人對圓葉楊（Populus rotundifolia Griff.）和XiangX等人對青葉楊（Populus cathayana Rehder）的研究證明，高海拔環(huán)境可以通過選擇壓力加速物種和群體分化。推測，云貴高原和青藏高原的特殊環(huán)境同樣促進(jìn)了西南山楊群體的適應(yīng)性進(jìn)化，塑造了其獨(dú)特的單倍型特征。

4結(jié)論

本研究基于HSFB1基因CDS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，銀白楊、響葉楊和中國山楊在物種水平上分化顯著，中國山楊具有更高的遺傳多樣性，說明其具有較廣泛的適生范圍。不同楊樹不同群體的單倍型數(shù)量、優(yōu)勢單倍型和特有單倍型不盡相同，說明各楊樹群體為適應(yīng)我國復(fù)雜多變的地理環(huán)境和氣候條件而經(jīng)歷了不同的演化過程，特別是響葉楊的特異性變異可能是其獲得對高溫高濕良好耐受性的關(guān)鍵原因。目前我國黑楊派楊樹栽培品種，北方品種移植至南方栽培，會(huì)逐漸表現(xiàn)出不適應(yīng)，甚至死亡的情況。在全球變暖的大背景下，未來研究還需要擴(kuò)寬到更多的楊屬類群，對楊樹的耐熱機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探究，并對植物耐熱性基因展開更多挖掘和分析，為楊屬物種遺傳多樣性保護(hù)和利用提供理論支持。