摘要：為尋找信陽(yáng)地區(qū)促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的有益菌，提高煙草產(chǎn)量，為信陽(yáng)地區(qū)煙草種植中促生菌的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，從信陽(yáng)市7種不同土壤樣品中分離純化出390株細(xì)菌，通過(guò)微生物-植物平板共培養(yǎng)方法和盆栽復(fù)篩試驗(yàn)，得到1株促生效果顯著的細(xì)菌LSyc30，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬，將其命名為Bacillus sp.LSyc30。在盆栽試驗(yàn)中，LSyc30菌株處理的煙草鮮重是空白對(duì)照的3倍多，須根數(shù)比空白組多62%，根長(zhǎng)是空白的1.5倍，莖長(zhǎng)比空白多54%，根系活力提高了24%，促生效果明顯；煙草酶活檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)組PPO（多酚氧化酶）和PAL（苯丙氨酸解氨酶）活力顯著高于對(duì)照組，試驗(yàn)組POD（過(guò)氧化物酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）、SOD（超氧化物歧化酶）活力和MDA（丙二醛）含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，結(jié)果表明促生菌LSyc30對(duì)煙草生長(zhǎng)無(wú)不良影響。LSyc30菌株具有溶磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體的功能，無(wú)固氮能力。在大田試驗(yàn)中，細(xì)菌組和商用菌劑組的農(nóng)藝性狀均優(yōu)于對(duì)照組，細(xì)菌組的各項(xiàng)指標(biāo)略高于商用菌劑組，其中細(xì)菌促生菌的株高、葉長(zhǎng)和葉寬都顯著高于對(duì)照組，3個(gè)處理組葉片數(shù)和莖圍沒有顯著性差異；煙草生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，還原糖含量提高了44.30%、總糖含量提高了50.00%、鉀含量提高了14.67%，促生作用優(yōu)于商用菌劑。綜合結(jié)果表明細(xì)菌LSyc30可以改善土壤環(huán)境促進(jìn)煙草對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高產(chǎn)量，是開發(fā)微生物菌劑的優(yōu)良菌株。

關(guān)鍵詞：煙草；信陽(yáng)；細(xì)菌；篩選；促生菌

中圖分類號(hào)：S182；S572.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）23-0230-08

謝久鳳，張" 森，崔光周，等. 煙草促生細(xì)菌的篩選鑒定及促生效果［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：230-237.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.031

收稿日期：2023-12-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21908044）；信陽(yáng)優(yōu)質(zhì)煙土壤微生態(tài)調(diào)控菌劑的開發(fā)和應(yīng)用項(xiàng)目（編號(hào)：30802153）。

作者簡(jiǎn)介：謝久鳳（1983—），女，遼寧阜新人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事微生物研究。E-mail：xiejiufeng@henau.edu.cn。

通信作者：王明道，博士，教授，從事植物與微生物互作研究。E-mail：wmdbio@126.com。

河南省是最早引種烤煙的省份之一，煙草產(chǎn)業(yè)作為河南省的支柱產(chǎn)業(yè)之一，在河南省的種植面積占全國(guó)種植面積的10%左右。河南煙區(qū)常年種植烤煙面積為8.67萬(wàn)hm2，平均煙草產(chǎn)量為1 844.46 kg/hm2，煙草產(chǎn)量最高能達(dá)到2 100 kg/hm2，顯著高于全國(guó) 1 700 kg/hm2 的平均產(chǎn)量［1］。信陽(yáng)市地處河南省最南部，是我國(guó)南北優(yōu)質(zhì)煙區(qū)的過(guò)渡地帶，與湖北省毗鄰，是亞熱帶向暖溫帶的過(guò)渡地帶，光、熱、水資源豐富，是河南省煙草豫南產(chǎn)區(qū)的主要產(chǎn)區(qū)，也是烤煙生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)［2］。對(duì)該地區(qū)調(diào)查和查閱文獻(xiàn)資料報(bào)道可知，從1990—2015年，信陽(yáng)地區(qū)煙草產(chǎn)量長(zhǎng)期處于中低區(qū)，并且處于不斷下降的趨勢(shì)。信陽(yáng)產(chǎn)區(qū)煙草產(chǎn)量在河南省十大煙草產(chǎn)區(qū)排名倒數(shù)，產(chǎn)量一直低于河南省煙草的平均產(chǎn)量，嚴(yán)重影響河南省煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［3］。近幾年由于藥物、化肥的使用，煙草產(chǎn)量有所提升，煙草產(chǎn)量最高為2018年的1 941.15 kg/hm2，但仍不及其他產(chǎn)區(qū)。長(zhǎng)期大量施用化學(xué)藥劑容易使病菌產(chǎn)生抗藥性，引起土壤質(zhì)地板結(jié)硬化，使煙草產(chǎn)量不增反降，2020年信陽(yáng)市煙草產(chǎn)量?jī)H為1 311.6 kg/hm2；造成的環(huán)境污染和藥劑殘留影響人體健康，嚴(yán)重制約著煙草的可持續(xù)發(fā)展［4］。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR）是一類可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類［5］。促生菌不僅可以提高作物產(chǎn)量，相對(duì)于化學(xué)藥劑也具有更高的經(jīng)濟(jì)效益，符合綠色環(huán)保的發(fā)展理念［6］。使用微生物菌劑可以改良土壤狀況，維持根際微生物區(qū)系平衡，提高土壤肥力，提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)［7］。有關(guān)PGPR的研究與應(yīng)用主要集中在水稻［8］、小麥［9］、玉米［10］等重要糧食作物上，煙草根際促生菌研究也有報(bào)道。鐘釧等從四川省煙草根際土中分離出產(chǎn)IAA和鐵載體能力的放線菌株，通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)煙草生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，促生菌對(duì)常見煙草病害有拮抗作用［11］。高丹丹從貴州省煙區(qū)健康煙株根際土壤樣品中分離出耐低溫的優(yōu)良菌株不僅能顯著促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，還能提高土壤酸性磷酸酶、蔗糖酶和脲酶的活力［12］。目前PGPR的研究主要在實(shí)驗(yàn)室和溫室中進(jìn)行，在大田應(yīng)用中的技術(shù)還不夠成熟穩(wěn)定［13］。

據(jù)了解，迄今為止針對(duì)信陽(yáng)地區(qū)的煙草促生菌的研究還未見報(bào)道，在煙草種植中也未使用過(guò)任何的促生菌劑。本研究以信陽(yáng)煙草種植區(qū)土壤樣品為材料進(jìn)行煙草促生菌的篩選與鑒定，并進(jìn)行盆栽與大田試驗(yàn)，找出促進(jìn)信陽(yáng)煙草生長(zhǎng)的有益菌，為微生物菌肥的開發(fā)提供菌種資源，改善土壤性質(zhì)，提高信陽(yáng)煙草產(chǎn)量，解決信陽(yáng)煙草產(chǎn)量低的實(shí)際問題，探究促生菌對(duì)煙草的促生機(jī)制，為開發(fā)優(yōu)質(zhì)的煙草促生菌劑和菌肥奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 煙草促生菌的篩選與鑒定

1.1.1" 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

（1）培養(yǎng)基：MS、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、微生物-植物共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基200 mL與PDA培養(yǎng)基100 mL混合，補(bǔ)加瓊脂6 g，添加去離子水定容至1 L）、解磷培養(yǎng)基［14］、解鉀培養(yǎng)基［15］、固氮培養(yǎng)基［16］、產(chǎn)鐵載體檢測(cè)培養(yǎng)基［17］、細(xì)菌基因組提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］。（2）試驗(yàn)材料：云煙87品種，哈茨木霉菌劑（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院）。（3）儀器設(shè)備：立式高壓蒸汽滅菌鍋（100 L，山東博科消毒設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（LRH-350F 上海左樂儀器有限公司）、恒溫?fù)u床（TS-280C，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）、智能人工氣候培養(yǎng)箱（RQH-250，鄭州生元儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）。

1.1.2" 煙草根際土壤樣品采集

根據(jù)信陽(yáng)煙草種植特點(diǎn)，選取信陽(yáng)市羅山縣水稻—煙草輪作的煙草田、信陽(yáng)平橋區(qū)小麥/玉米—煙草輪作的煙草田、前茬作物為油菜紅薯的煙草田、煙草常年連作煙田、第1次種植煙草的煙田土壤等7塊區(qū)域進(jìn)行樣品采集。

采用五點(diǎn)取樣法對(duì)煙草根際土壤進(jìn)行采集，取樣時(shí)去除表面5 cm的表層土，向下取5～10 cm深的煙草根際土壤（附著于煙草根系1 mm之內(nèi)的一層土壤），通過(guò)篩子快速篩除土壤中植物組織和石子等異物，將土壤樣品裝入無(wú)菌袋中，4 ℃低溫保存，用于微生物的分離純化。

1.1.3" 煙草根際土壤微生物的分離及純化

在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中將土壤樣品進(jìn)行梯度稀釋，吸取10-4、10-5、10-6等3個(gè)梯度的稀釋液涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)1～2 d，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行劃線純培養(yǎng)獲取純菌株，菌株編號(hào)及土壤來(lái)源見表1。

1.1.4" 微生物-煙草共培養(yǎng)篩選促生菌

1.1.4.1" 無(wú)菌煙草苗培養(yǎng)" 將云煙87種子用0.1%氯化汞浸泡殺菌5 min，用無(wú)菌蒸餾水沖洗3遍，再用有效氯為2.5%的次氯酸鈉溶液浸泡 15 min，最后用無(wú)菌水沖洗3遍，獲得無(wú)菌的煙草種子。用鑷子和牙簽將無(wú)菌煙草種子點(diǎn)種在MS培養(yǎng)基中，并用封口膜封口。將種子培養(yǎng)皿在4 ℃暗環(huán)境中放置24 h后，再置于人工氣候培養(yǎng)箱中，以 28 ℃、光照度1 500～2 000 lx、濕度60%、光照12 h的條件培養(yǎng)14 d，獲得株高2～3 cm的無(wú)菌煙草苗。

1.1.4.2" 細(xì)菌菌液制備" 將分離純化的菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中 37 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，獲得菌液備用。

1.1.4.3" 煙草平板生測(cè)試驗(yàn)" 將培養(yǎng)好的無(wú)菌煙草苗轉(zhuǎn)接到微生物-植物共培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)（28 ℃、光照度1 500～2 000 lx、濕度60%、光照 12 h 的條件培養(yǎng)）7 d后，在距離煙草根系中間部位1 mm處接種細(xì)菌菌液10 μL，以不加菌液的煙草平板作空白對(duì)照，再置于人工氣候培養(yǎng)箱中，以28 ℃、光照度1 500～2 000 lx、濕度60%、光照12 h的條件培養(yǎng)至14 d，統(tǒng)計(jì)不同菌株對(duì)煙草鮮重、根分支數(shù)、株高和根長(zhǎng)的影響，篩選能促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的微生物菌株。

1.1.5" 煙草促生菌盆栽試驗(yàn)

1.1.5.1" 促生菌發(fā)酵液制備" 將共培養(yǎng)中對(duì)煙苗有促生作用的細(xì)菌接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，檢測(cè)活菌量達(dá)到1×108 CFU/mL，備用。

1.1.5.2" 促生盆栽試驗(yàn)煙苗制備" 盆栽培養(yǎng)基質(zhì)主要為營(yíng)養(yǎng)土和蛭石，使用前將營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)在121 ℃高壓蒸汽滅菌90 min。將營(yíng)養(yǎng)土、蛭石、水按照質(zhì)量比為1 ∶1 ∶2的比例混合均勻裝入7 cm×7 cm×7 cm 的方形塑料盆中，移種培養(yǎng)好的無(wú)菌煙草苗（株高2～3 cm），放置于溫度28 ℃、濕度60%、光照時(shí)間12 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待煙草苗長(zhǎng)至4～6張真葉，選取生長(zhǎng)一致的健康煙草苗進(jìn)行接菌處理。

1.1.5.3" 促生盆栽試驗(yàn)接菌處理" 按照每盆2 mL接種量添加菌液，每個(gè)處理20盆，以只添加等量培養(yǎng)基的處理為空白對(duì)照，商用菌劑哈茨木霉為陽(yáng)性對(duì)照。接種菌液后繼續(xù)培養(yǎng)，待煙草生長(zhǎng)至第20天時(shí)，將煙草根系進(jìn)行清洗，去除培養(yǎng)基質(zhì)，統(tǒng)計(jì)煙草的鮮重、根重、株高和根長(zhǎng)指標(biāo)，分析菌株對(duì)煙草的促生效果。

1.1.6" 促生菌株的鑒定

1.1.6.1" 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察" 將對(duì)煙草生長(zhǎng)有促生作用的細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上劃線分離單菌落，觀察菌株形態(tài)，挑取少量菌體進(jìn)行革蘭氏染色，顯微觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.1.6.2" 細(xì)菌基因序列分析" 細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組，對(duì)細(xì)菌的16S核糖體基因進(jìn)行PCR，對(duì)PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)NCBI進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，并利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定細(xì)菌促生菌株的種屬。

1.2" 促生菌促生機(jī)制研究

1.2.1" 促生菌對(duì)煙草根系活力的影響

1.2.1.1" 氯化三苯基四氮唑（TTC）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作" TTC是一種脂溶性光敏感復(fù)合物，常用作氧化還原指標(biāo)劑。它可以與活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的三苯基甲臜（TTF），從而用于檢測(cè)細(xì)胞的活力或計(jì)數(shù)。首先配制0.06、0.07、0.09、0.12、0.15 g/L TTC不同濃度的溶液，各取1 mL上述不同濃度TTC溶液加入等量的連二亞硫酸鈉（Na2S2O4），使得TTC完全反應(yīng)。振蕩混合混勻，用乙酸乙酯定容至10 mL（多大體系），以乙酸乙酯作為空白對(duì)照，檢測(cè)485 nm下不同濃度TTC溶液的吸光度，記錄各值。橫坐標(biāo)為不同TTC的濃度，縱坐標(biāo)為其吸光度，繪制出TTC濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。TTC還原量=TTC濃度（g/L）× TTC溶液添加量（1 mL）。

1.2.1.2" 根系活力的檢測(cè)" 稱取盆栽處理后培養(yǎng)20 d的煙草根尖樣品0.5 g，放入小燒杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸緩沖液（pH值為7.0）各 5 mL，將根充分浸沒在溶液內(nèi)，在37 ℃下暗保溫 1～2 h，此后立即加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一空白試驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，37 ℃下暗保溫后不加硫酸，其溶液濃度、操作步驟同上）。把根取出，用濾紙吸干水分，放入研缽中，加乙酸乙酯3～4 mL，充分研磨，以提出TTF。把紅色提取液移入刻度試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈?～3次，皆移入刻度試管，最后加乙酸乙酯定容至10 mL，檢測(cè)D485 nm，以空白試驗(yàn)作參比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算消耗的TTC濃度，得到TTC的還原量。從而計(jì)算TTC還原強(qiáng)度，TTC還原強(qiáng)度表示根系酶活力：

TTC還原強(qiáng)度=TTC還原量（g）÷根系重（g）÷反應(yīng)時(shí)間（h）。

1.2.2" 促生菌株對(duì)煙草煙葉POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性和MDA含量的影響

促生盆栽試驗(yàn)20 d時(shí)，取各組煙草葉片進(jìn)行過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和丙二醛（MDA）含量的檢測(cè)，POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性和MDA含量的檢測(cè)方法按照江蘇科銘生物技術(shù)有限公司的酶活力檢測(cè)試劑盒，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)應(yīng)吸光度，計(jì)算相應(yīng)酶活力進(jìn)行分析。

1.2.3" 促生菌解磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體功能分析

將促生菌接種至解磷培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、固氮培養(yǎng)基和產(chǎn)鐵載體檢測(cè)培養(yǎng)基中，如菌株具備該功能，在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)透明圈，根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈以及透明圈的大小判斷菌株是否具備這些功能。

1.3" 煙草促生菌大田試驗(yàn)效果研究

促生菌篩選地域是信陽(yáng)市，因此在信陽(yáng)市進(jìn)行大田試驗(yàn)更符合生態(tài)學(xué)原理。2022年4月選取信陽(yáng)市平橋區(qū)煙草種植區(qū)正常小麥/玉米—煙草輪作地塊，檢測(cè)促生菌株在大田種植過(guò)程中的實(shí)際效果。

1.3.1" 菌劑的制備

將篩選得到的效果顯著的促生菌進(jìn)行發(fā)酵，添加量參照商用菌劑的1 kg/667 m2，細(xì)菌發(fā)酵液1 L/667 m2。

1.3.2" 煙苗菌劑添加

在4月初煙苗移栽時(shí)，將菌劑稀釋100倍，煙苗在菌劑中浸根30 min后移栽，然后進(jìn)行灌根處理；在6月初煙草進(jìn)入旺長(zhǎng)期，將菌劑稀釋1 000倍，對(duì)煙草進(jìn)行灌根處理。試驗(yàn)組為篩選的促生菌株，商用菌劑為陽(yáng)性對(duì)照，以添加等量的自然水為空白組。

1.3.3" 煙草農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)

煙草移栽后，分別在第90天時(shí)統(tǒng)計(jì)煙草的株高、莖圍、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、葉片數(shù)，分析不同菌劑處理對(duì)煙草生長(zhǎng)農(nóng)藝指標(biāo)的影響。

1.3.4" 煙葉理化指標(biāo)檢測(cè)

將不同處理的煙葉烘烤后進(jìn)行隨機(jī)抽樣，每個(gè)處理抽取6個(gè)煙葉樣本，混合粉碎，作為該處理煙草的樣本。在中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測(cè)，對(duì)照國(guó)家煙草品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分析不同處理煙草的品質(zhì)。數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 促生菌的篩選和鑒定

2.1.1" 微生物-煙草共培養(yǎng)篩選細(xì)菌促生菌

對(duì)信陽(yáng)地區(qū)7種不同類型的土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌分離純化，按照微生物-煙草共培養(yǎng)的方法篩選煙草細(xì)菌促生菌。每個(gè)菌株進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)，觀察煙草的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)14 d后，對(duì)菌株處理的煙草鮮重、須根數(shù)、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析菌株的促生效果。煙草平板結(jié)果見表2，可以得出樣品2中LSys37和樣品6中LSyc30、LSyc52這3株細(xì)菌促生效果良好。3株細(xì)菌的鮮重都顯著高于空白組，其中細(xì)菌LSyc30的鮮重顯著高于另2株細(xì)菌，是空白組的3倍多；須根數(shù)只有細(xì)菌LSyc30與空白組有顯著性差異，比空白組多62%；3株細(xì)菌的根長(zhǎng)都顯著高于空白組，且3株細(xì)菌之間沒有顯著差異，細(xì)菌LSyc30根長(zhǎng)是空白組的1.5倍；莖長(zhǎng)只有細(xì)菌LSyc30顯著高于空白組54%，綜合所有結(jié)果得出細(xì)菌LSyc30促生效果最顯著。

2.1.2" 細(xì)菌促生菌的盆栽驗(yàn)證

對(duì)篩選得到的最優(yōu)的3株細(xì)菌促生菌LSys37、LSyc30和LSyc52進(jìn)行盆栽驗(yàn)證，每個(gè)菌株處理20盆，以商用菌劑哈茨木霉作為陽(yáng)性對(duì)照。由圖2可知，所有煙苗都正常生長(zhǎng)，3株細(xì)菌處理的煙苗沒有病害或者生長(zhǎng)減緩等不良現(xiàn)象，可以確定3株細(xì)菌處理不會(huì)影響煙草的正常生長(zhǎng)，對(duì)煙草無(wú)害。與空白對(duì)照比較，3株細(xì)菌促生菌處理的煙草長(zhǎng)勢(shì)旺盛，表明3株細(xì)菌都可以促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)。

在加菌處理后20 d將盆栽煙草根部進(jìn)行清洗，統(tǒng)計(jì)煙草的鮮重、根重、根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)生長(zhǎng)指標(biāo)，結(jié)果見表3。在處理后20 d，LSyc30、LSys37和LSyc52 3株菌株處理的煙草鮮重、根重和根長(zhǎng)都優(yōu)于空白對(duì)照，莖長(zhǎng)只有LSyc30菌株優(yōu)于空白對(duì)照；LSyc52和LSys37各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照沒有顯著性差異，LSyc30菌株處理的煙草鮮重和根重顯著優(yōu)于空白對(duì)照，分別是空白對(duì)照的2.47、5.43倍，并且各項(xiàng)指標(biāo)也都優(yōu)于其他2株細(xì)菌。3株細(xì)菌中只有LSyc30的各項(xiàng)指標(biāo)與商用菌劑無(wú)顯著性差異（圖3），且鮮重、根重和莖長(zhǎng)數(shù)值略高于商用菌劑。

2.1.3" 細(xì)菌促生菌LSyc30的菌種鑒定

由圖3可知，通過(guò)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察，菌株生長(zhǎng)呈圓形，乳白色，表面光滑具有光澤，有時(shí)中間會(huì)出現(xiàn)褶皺，如白色蠟滴，挑取黏稠； 染色后顯微鏡觀察呈桿狀（圖3-A），革蘭氏染色確定菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌。通過(guò)菌落細(xì)菌通用引物對(duì)該菌的16S DNA進(jìn)行PCR測(cè)序，得到該菌株序列，通過(guò)NCBI比對(duì)和MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定細(xì)菌促生菌LSyc30是芽孢桿菌屬，將其命名為Bacillus sp.LSyc30；并將其保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為：CGMCC NO：25678。

2.2" 促生菌促生機(jī)制研究

2.2.1" 促生菌對(duì)煙草生長(zhǎng)和防御抗性相關(guān)酶活力的影響

2.2.1.1" 促生菌對(duì)煙草根系活力的影響

由圖4可知，細(xì)菌促生菌LSyc30菌株處理煙草根系活力高于空白對(duì)照24%，結(jié)果表明促生菌的處理提高了煙草的根系活力，能促進(jìn)煙草更好地吸收營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)。

2.2.1.2" 促生菌對(duì)煙草酶活性的影響

盆栽試驗(yàn) 30 d 時(shí)取煙草葉片進(jìn)行酶活性檢測(cè)，由表4可知，試驗(yàn)組的POD、CAT、SOD活性和MDA含量與對(duì)照組相比沒有顯著性差異，試驗(yàn)組的PPO和PAL活性顯著高于對(duì)照組。

2.2.2" 細(xì)菌促生菌LSyc30促生機(jī)制解析

為探究促生菌促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的機(jī)制， 本試驗(yàn)通過(guò)平板透明

圈法定性檢測(cè)菌株的溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體能力。由表5可知，細(xì)菌促生菌LSyc30菌株檢測(cè)出具有溶磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體的能力，無(wú)固氮能力。

2.3" 促生菌促生效果研究

2.3.1" 促生菌處理煙草大田情況

為探究本試驗(yàn)篩選菌株在煙草實(shí)際種植中的促生效果，在信陽(yáng)市羅山縣設(shè)置試驗(yàn)田對(duì)篩選得到的促生菌進(jìn)行田間試驗(yàn)，選取商用菌劑哈茨木霉作為陽(yáng)性對(duì)照。

由圖5可知，使用促生菌的煙草明顯比空白對(duì)照的煙草生長(zhǎng)旺盛。在煙草生長(zhǎng)的前期，細(xì)菌促生菌LSyc30和商用菌劑長(zhǎng)勢(shì)一致，都比空白對(duì)照的長(zhǎng)勢(shì)齊整、旺盛；在煙草成熟期，細(xì)菌促生菌LSyc30處理的煙草生長(zhǎng)植株長(zhǎng)勢(shì)齊整，比商用菌劑和空白對(duì)照生長(zhǎng)旺盛。

2.3.2" 促生菌處理對(duì)煙草生長(zhǎng)性狀的影響

在大田試驗(yàn)第90天，對(duì)煙草生長(zhǎng)的農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表6結(jié)果顯示促生菌在煙草生長(zhǎng)過(guò)程中有顯著促進(jìn)作用。細(xì)菌促生菌LSyc30和商用菌劑組各項(xiàng)指

標(biāo)均優(yōu)于空白組，細(xì)菌促生菌LSyc30各項(xiàng)指標(biāo)略高于商用菌劑組。試驗(yàn)組的株高顯著高于對(duì)照組 25%，與商用菌劑相比提高了18%，商用菌劑組與對(duì)照組相比沒有顯著性差異；試驗(yàn)組的葉長(zhǎng)顯著高于對(duì)照組15%，高于商用菌劑組8%；試驗(yàn)組和商用菌劑組的葉寬與對(duì)照組相比都有顯著性差異，3個(gè)處理組葉片數(shù)和莖圍沒有顯著性差異。

2.3.3" 促生菌處理對(duì)煙葉理化指標(biāo)的影響

煙葉理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表7，與空白對(duì)照比較，細(xì)菌促生菌LSyc30顯著提高了煙葉還原糖含量（提高了44.30%）、總糖含量（提高了50.00%）和鉀含量（提高了14.67%），和商用菌劑的煙草理化指標(biāo)結(jié)果相近。

3" 結(jié)論與討論

3.1" 結(jié)論

本試驗(yàn)從信陽(yáng)市煙植土壤中共篩選出390株細(xì)菌，通過(guò)微生物-植物共培養(yǎng)方法篩選得到最優(yōu)的3株細(xì)菌促生菌LSyc30、LSyc52和LSys37進(jìn)行盆栽驗(yàn)證，結(jié)果顯示試驗(yàn)組煙草都正常生長(zhǎng)，無(wú)生長(zhǎng)緩慢或病害現(xiàn)象，表明所篩選菌株對(duì)煙草生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。盆栽試驗(yàn)中細(xì)菌LSyc30處理組的鮮重和根重顯著高于空白組，生長(zhǎng)指標(biāo)也優(yōu)于另外2個(gè)試驗(yàn)組，細(xì)菌LSyc30組煙草各項(xiàng)指標(biāo)與商用菌劑無(wú)顯著差別，且整體數(shù)值略高于商用菌劑，說(shuō)明細(xì)菌LSyc30更具研究?jī)r(jià)值。對(duì)細(xì)菌LSyc30進(jìn)行菌種鑒定，確定為芽孢桿菌屬，將其命名為Bacillus sp.LSyc30。盆栽試驗(yàn)中促生菌可提高煙草根系活力，顯著提高煙PPO和PAL活力，試驗(yàn)組POD、CAT、SOD活力和MDA含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。為進(jìn)一步確定細(xì)菌LSyc30的促生效果和穩(wěn)定性，在信陽(yáng)市進(jìn)行了大田應(yīng)用，細(xì)菌促生菌LSyc30和商用菌劑組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于空白組，細(xì)菌促生菌LSyc30各項(xiàng)指標(biāo)（除根長(zhǎng)外）略高于商用菌劑組，促生菌處理下煙草的株高顯著高于空白組和商用菌劑組，葉長(zhǎng)和葉寬顯著高于空白組，3個(gè)處理組葉片數(shù)和莖圍沒有顯著性差異。煙葉理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)菌促生菌LSyc30和商用菌劑的煙草理化指標(biāo)結(jié)果相近，與對(duì)照相比顯著提高了煙葉還原糖含量（提高44.30%）、總糖含量（提高50.00%）和鉀含量（提高14.67%）。LSyc30菌株具有溶磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體的功能，可以改善土壤環(huán)境，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。綜合結(jié)果顯示，無(wú)論是盆栽試驗(yàn)還是大田應(yīng)用促生菌對(duì)煙草的促生作用都優(yōu)于商用菌劑，表明促生菌LSyc30極具開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

3.2" 討論

常見的促生菌篩選方法是通過(guò)溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體篩選或者針對(duì)病害菌篩選拮抗菌尋找有益菌株，吳翔等從四川省5個(gè)煙草主栽區(qū)根際土壤樣品中通過(guò)檢測(cè)菌株產(chǎn)IAA、鐵載體和HCN的能力分離出923株微生物，再通過(guò)種子萌發(fā)試驗(yàn)從中篩選促生菌，最后結(jié)果顯示有5株細(xì)菌能提高煙草種子發(fā)芽率［18］。但這種篩選方法存在一個(gè)弊端，那就是得到的菌株本身可能對(duì)植物有害，還需通過(guò)盆栽試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，此方法篩菌工作量大，效率低，實(shí)際應(yīng)用效果欠佳。

本試驗(yàn)建立了微生物-植物平板共培養(yǎng)生物檢測(cè)方法，針對(duì)具體的作物與菌株進(jìn)行共培養(yǎng)篩選，可以直接觀察微生物對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，篩選效率高，結(jié)果更準(zhǔn)確。本試驗(yàn)從土壤樣品中篩選出390株細(xì)菌，通過(guò)共培養(yǎng)生物檢測(cè)方法篩選出3株促生效果好的細(xì)菌，再通過(guò)盆栽試驗(yàn)復(fù)篩出1株促生效果最佳的細(xì)菌，結(jié)果證明，通過(guò)這種方法得到的菌株，在盆栽試驗(yàn)和大田應(yīng)用中，促生結(jié)果與平板共培養(yǎng)生物檢測(cè)方法結(jié)果一致。該菌株從油菜-水稻茬口后種植的煙草根際土中分離得到，經(jīng)鑒定屬于芽孢桿菌屬，菌株所在原生態(tài)環(huán)境種植的煙草生長(zhǎng)較好，篩選出該菌株也顯著促進(jìn)了煙草的生長(zhǎng)，可以確定LSyc30菌株是一株非常好的煙草促生細(xì)菌。此方法效率高，結(jié)果直觀明了，可操作性強(qiáng)，可為篩選植物共生目的菌株提供參考借鑒。

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，植物根系吸收運(yùn)輸水分和養(yǎng)料都需要消耗能量，這些能量由根部細(xì)胞的呼吸作用提供，呼吸作用越強(qiáng)，說(shuō)明根系的吸收作用越強(qiáng)，根系活力水平直接影響地上部的營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平［19］。盆栽試驗(yàn)中LSyc30試驗(yàn)組根系活力比對(duì)照組提高了24%，說(shuō)明這株促生菌能提高煙草根系活力，促進(jìn)煙草對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的吸收。

PPO能夠促進(jìn)植物傷口愈合，增加煙草對(duì)病原體的抗性［20］。促生菌LSyc30可顯著提高煙草PPO活力，增強(qiáng)煙草對(duì)病原體的抗性。

PAL是煙草新陳代謝過(guò)程連接初級(jí)代謝的第1步，是苯丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，涉及植物木質(zhì)化、色素形成、根瘤形成等過(guò)程，參與植保素的合成；PAL是煙草防止病原物侵染，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育非常重要的一種酶［20］。結(jié)果顯示在處理30 d時(shí)顯著促進(jìn)PAL酶活的表達(dá)，酶活力提高64.6%，刺激煙草的生長(zhǎng)和代謝。

在大田試驗(yàn)中促生菌LSyc30試驗(yàn)組煙草農(nóng)藝性狀株高、葉長(zhǎng)和葉寬顯著優(yōu)于空白組，煙葉理化指標(biāo)也優(yōu)于空白組，結(jié)合細(xì)菌促生菌對(duì)煙草促生效果和相關(guān)酶活力的影響，細(xì)菌促生菌在煙草生長(zhǎng)后期顯著促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，提高煙葉的鉀含量，煙草作為喜鉀植物，煙葉鉀含量的提升表明細(xì)菌可能具有解鉀能力從而促進(jìn)煙草生長(zhǎng)。與對(duì)照相比促生菌促進(jìn)了煙草生長(zhǎng)，提高了煙葉的產(chǎn)量，對(duì)煙葉品質(zhì)無(wú)明顯影響。由此推測(cè)細(xì)菌促生菌促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的促生作用主要是因?yàn)長(zhǎng)Syc30菌株具有溶磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體的功能，可以改善土壤環(huán)境，增強(qiáng)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的能力，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)。已有研究報(bào)道在煙草種植中接種微生物菌劑可以促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，提高煙草產(chǎn)量，改善土壤生態(tài)環(huán)境和煙葉品質(zhì)［21］。劉春菊等從山東濰坊煙區(qū)根際土壤中篩選出10株溶磷效果較好的細(xì)菌，選用溶磷、抑菌、促生效果最好的一株菌，經(jīng)鑒定為新洋蔥伯克霍爾德氏菌，進(jìn)行溫室和田間煙草種植試驗(yàn)，結(jié)果顯示這株菌能促進(jìn)煙草對(duì)磷的吸收，改善煙草農(nóng)藝性狀和煙葉品質(zhì)，提高煙草產(chǎn)量，本試驗(yàn)也得出類似結(jié)論［22］。通過(guò)平板共培養(yǎng)生測(cè)試驗(yàn)和盆栽復(fù)篩試驗(yàn)從信陽(yáng)市煙植根際土壤中篩選出1株促生效果較好的細(xì)菌，應(yīng)用到田間試驗(yàn)可以促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，減少化肥的使用，改善土壤環(huán)境，提高煙草產(chǎn)量和品質(zhì)，有推廣應(yīng)用價(jià)值，為微生物菌劑生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

植物-微生物-土壤之間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，促生菌在土壤中穩(wěn)定存在和發(fā)揮作用會(huì)受到土壤環(huán)境、土壤中微生物群落動(dòng)態(tài)變化、植物根系分泌物等多種因素影響［23-24］，本試驗(yàn)在信陽(yáng)地區(qū)大田驗(yàn)證篩選菌株可以促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，但在其他地域，微生物是否可以穩(wěn)定存在和發(fā)揮作用還需要進(jìn)行實(shí)地檢驗(yàn)。在植物-微生物-土壤的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，可能還存在其他促生機(jī)制，例如促生菌可以拮抗病原菌［25］，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加土壤微生物豐富度，提高其他促生菌的含量從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，或者通過(guò)復(fù)雜的植物-微生物-土壤調(diào)控影響機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)［26］，這些都值得更加深入的研究。

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