摘要:挖掘五指山豬、巴馬豬、近交陸川豬和藏香豬中全基因組SSR,比較分析4個豬種中SSR分布特性并進行功能性SSR注釋,為小型豬種質(zhì)資源的保存及利用提供分子標記。選取4個品種豬各15頭,分別構(gòu)建全基因組SSR文庫并進行測序,結(jié)合生物信息學分析方法,統(tǒng)計不同類型SSR(雙、三、四、五、六核苷酸)的數(shù)量、SSR重復單元的分布模式、SSR的長度多態(tài)性并對功能性SSR進行注釋,比較分析4個小型豬品種中全基因組的SSR特性。對豬參考基因組和4個豬種全基因組SSR統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),五指山豬中SSR的數(shù)量最多,巴馬豬和近交陸川豬其次,藏香豬中最少,且每個品種中雙、三、四核苷酸SSR的數(shù)量占比最多,與豬參考基因組中不同類型SSR的占比結(jié)果相似。SSR重復單元的分布模式顯示,4個豬種中雙、五核苷酸SSR中重復單元的分布模式相同,藏香豬中三、四核苷酸SSR中重復單元的分布模式與其他3個豬種不同,而六核苷酸SSR中重復單元的分布模式在4個豬種中完全不同。SSR的長度多態(tài)性分析表明,五指山豬、巴馬豬、近交陸川豬和藏香豬中分別有19 957、14 099、20 671、14 120個長度多態(tài)性gt;1的SSR定位到豬參考基因組,其中,有2 518個SSR共同存在于4個品種中,而特異存在于4個豬種中的SSR分別有 5 173、2 802、5 969、4 463個。此外,對SSR進行注釋發(fā)現(xiàn),多態(tài)性SSR可能影響FGF23、MYF6、IGF1R和LEPROT等與豬的生長發(fā)育相關(guān)基因的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)。本試驗首次構(gòu)建豬全基因組SSR文庫并測序,在全基因組水平上比較分析4個小型豬品種的SSR,揭示了不同小型豬品種間SSR重復單元的分布模式存在差異,并對品種間共有及特異的SSR進行挖掘和注釋,發(fā)現(xiàn)了可能與小型豬的生長發(fā)育相關(guān)具有長度多態(tài)性的SSR。本研究挖掘得到的SSR補充了豬基因組遺傳變異信息和小型豬分子標記,建立的SSR分析方法可為不同物種、品種間SSR分析及鑒定工作提供參考。
關(guān)鍵詞:微衛(wèi)星;重復單元;長度多態(tài)性;小型豬;分子標記
中圖分類號:S828.2" 文獻標志碼:A
文章編號:1002-1302(2024)23-0174-07
涂尾龍,張鶯鶯,黃" 濟,等. 小型豬微衛(wèi)星標記的遺傳多樣性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2024,52(23):174-181.
doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.024
收稿日期:2023-09-19
基金項目:上海市科技興農(nóng)技術(shù)創(chuàng)新項目(編號:X2022-02-08-00-12-F01106)。
作者簡介:涂尾龍(1983—),男,江西撫州人,博士研究生,高級畜牧師,主要從事動物遺傳育種研究。E-mail:tuweilong@saas.sh.cn。
通信作者:王洪洋,博士,副研究員,主要從事動物遺傳育種研究。E-mail:wanghongyang@saas.sh.cn。
簡單序列重復(simple sequence repeat,SSR)是由2~6個堿基組成的重復單元以串聯(lián)的方式形成,其具有廣泛存在性和高度多態(tài)性,而位于基因上(編碼區(qū)和非編碼區(qū))的多態(tài)性SSR具有很強的功能性[1]。此外,小型豬具有獨特的生長發(fā)育規(guī)律,其體型小的特點可用于骨骼、肌肉發(fā)育等研究,而本研究中的巴馬豬、藏香豬又分別具有肉質(zhì)鮮美、抗逆性強等特點,因此對于小型豬基因組SSR的挖掘可為豬的經(jīng)濟性狀研究提供條件。由此可見,對全基因組SSR的研究可為豬的遺傳育種研究提供分子標記,進而應用于群體遺傳多樣性及進化等。此外,功能性SSR的分析對豬生長發(fā)育等性狀的研究至關(guān)重要。目前,大部分關(guān)于SSR的研究僅限于應用單個或多個SSR進行群體遺傳多樣性及種間鑒定方面[2-5],而其在豬中的應用往往需要借鑒于其他物種中的SSR序列[6-7],由于不同物種間的SSR具有很大的多態(tài)性差異,常導致試驗復雜性和結(jié)果的不準確性。隨著組學技術(shù)的發(fā)展,使基于表達序列標簽(EST)和高通量測序數(shù)據(jù)挖掘SSR成為可能,如石甜甜等對144個EST-SSR標記進行糜子遺傳資源評估[8],魏丹丹等采用磁珠富集法建立SSR文庫并挖掘序列,結(jié)合EST-SSR分子標記驗證了可以穩(wěn)定擴增的SSR引物[9]。Liu等首次分析了豬參考基因組(Sus scrofa 10.2)中SSR的特性,并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫中的102個重測序個體(源于國內(nèi)外17個豬種)數(shù)據(jù)進行SSR分型,發(fā)現(xiàn)了與疾病發(fā)生相關(guān)的功能性SSR位點[10],但該研究中的SSR源于對豬參考基因組的掃描,而多態(tài)性SSR來自于多個品種的個體進行分析,并不能全面反映豬基因組層面的SSR特性?;赟SR在分子標記方面的應用和功能性SSR的重要性,以及豬基因組SSR的不全面性,本研究擬從全基因組水平對4個小型豬的SSR進行全面挖掘和比較分析。利用選擇雜交法構(gòu)建4個豬種的SSR文庫,結(jié)合生物信息學比較分析4個豬種中SSR的分布模式及差異,對SSR進行注釋并分析功能性SSR。
1" 材料與方法
1.1" 試驗材料
試驗材料包括170頭小型豬的耳組織樣品,來源于上海市農(nóng)業(yè)科學院封閉繁育20年的近交陸川豬(LC)53頭、上海交通大學的巴馬豬(BM)16頭、南方醫(yī)科大學動物科技學院的藏香豬(ZX)50頭和海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所的五指山豬(WZS)51頭。耳組織采集后保存于裝有75%乙醇的EP管中,帶回實驗室置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。試驗時間為2019年6—12月及2020年6—12月。
1.2" 基因組DNA提取
采用酚三氯甲烷方法對所有樣品進行基因組DNA提取,分別利用NanoDrop 2000、1% 瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像(Newbio Gi-1)檢測DNA濃度、D值及DNA質(zhì)量。
1.3" 微衛(wèi)星及其引物的篩選
基于4個品種小型豬的全基因組微衛(wèi)星(simple sequence repeat,SSR)測序數(shù)據(jù),獲得 2 518 個品種間共有的SSR,從中選取11個位于基因上的SSR進行引物設(shè)計及多態(tài)性片段檢測,用于評估4個品種小型豬的遺傳多樣性。其中,正向引物的5′端連接熒光標記,本研究共用到3種熒光標記,6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)、六氯熒光素(hexachloro fluorescein,HEX)和羧基四甲基羅丹明(carboxytetramethylrhodamine,TAMRA)分別顯示藍光、綠光和橙色熒光,反向引物為普通引物,均由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。
1.4" 熒光引物PCR擴增
PCR反應體系(20 μL)包括30 ng/μL的模板DNA 1 μL、Mg2+含量25 mmol/L 10×buffer 2 μL、10 mmol/L 的dNTP 0.5 μL、5 U/L的Taq聚合酶0.5 μL、1 mmol/L的正向熒光引物和反向普通引物各 1 μL 及ddH2O 14 μL。PCR擴增在ABI-2720擴增儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)上進行,程序為 94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,不同退火溫度退火30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 7 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,若條帶清晰,無明顯引物二聚體和雜帶,可判定為擴增到目的片段。
1.5" 毛細管電泳及等位基因分型
毛細管電泳可以精確地區(qū)分SSR片段的大小。取10 μL熒光PCR產(chǎn)物,加入冷的70%乙醇至終體積50 μL,振蕩充分混勻后3 700 r/min、4 ℃離心 30 min,靜置15 min待乙醇揮發(fā)干凈后加入GS-500LIZ分子內(nèi)標和HiDi,瞬離樣品至PCR儀進行95 ℃ 4 min變性后,于ABI 3730XL(美國應用生物系統(tǒng)公司)中進行毛細管電泳,利用GeneMapper軟件對電泳結(jié)果進行微衛(wèi)星片段大小和信號值的分析,確定每個微衛(wèi)星位點的等位基因型。
1.6" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
采用Cervus 3.0.7軟件計算每個SSR的等位基因數(shù)(Na)、等位基因頻率、基因型頻率、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、多態(tài)信息含量(PIC),同時檢驗4個品種豬的Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。采用PopGen 1.32進行4個品種間遺傳相似性及遺傳距離分析。采用MEGA 7.0.26構(gòu)建Neighbour-Joining聚類圖及Structure 2.2分析群體遺傳結(jié)構(gòu)。
2" 結(jié)果與分析
2.1" 4個品種小型豬SSR的獲得
筆者所在課題組前期建立4個品種小型豬的全基因組SSR文庫并進行高通量測序,發(fā)現(xiàn)4個品種中共有的多態(tài)性SSR位點有2 518個,對其進行注釋發(fā)現(xiàn)大部分SSR位于基因間區(qū)(63.0%~65.4%),而位于基因區(qū)域的SSR中,有80、357和436個SSR分別位于5′UTR、3′UTR和編碼區(qū)域。對位于基因區(qū)域上的SSR,在不同染色體上隨機選取11個進行4個品種小型豬的遺傳多樣性分析。11個SSR在基因組上的位置及相應引物信息見表1。
2.2" 毛細管電泳檢測SSR的目的片段
圖1僅列出2個SSR在相應個體中的檢測結(jié)果,其中,A圖是ZX的35號個體在SYW7上的等位基因峰值,其2個峰值表明該等位基因是雜合子,其片段大小分別為208、232 bp;B圖是WZS的1號個體在SYW9上的等位基因峰值,僅有1個峰值,表明該等位基因是純合子,其片段大小是164 bp。
2.3" 等位基因數(shù)及品種間等位基因
采用11對SSR引物對170頭個體進行熒光PCR,獲得等位基因數(shù)和等位基因大小的統(tǒng)計結(jié)果,由表2可知, 在4個品種小型豬的170頭個體中檢
測到122個等位基因,每個位點檢測到的等位基因數(shù)為8~17個,平均為11.1個;其中,SYW5和SWY8的等位基因數(shù)最多(17個),SYW10、SYW13和SWY19的等位基因數(shù)最少(8個)。此外,11個SSR在4個品種中擴增到的等位基因數(shù)不同,WZS、BM、LC和ZX中的等位基因數(shù)分別為76、66、76、81個,平均等位基因數(shù)分別為6.909 1、6.000 0、6.909 1、7.363 6個。
在4個品種豬中,分別計算每個SSR的最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF),保留MAFgt;0.01的等位基因,通過計算每個品種內(nèi)的等位基因頻率和基因型頻率挖掘種間特有的等位基因和基因型。由表3可知,在11個SSR座位中,檢測到WZS特有等位基因和基因型分別有4、6個,BM特有等位基因和基因型分別有3、11個,LC特有等位基因和基因型均有9個,ZX特有等位基因和基因型分別有13、10個。以SYW5座位為例,在4個品種中共檢測到17個等位基因,其中,172 bp的等位基因為BM特有,122、134、160 bp的等位基因為LC特有,138、144、146 bp 的等位基因為ZX特有,由148 bp組成的純合基因型在WZS中特有,由 130 bp 和158 bp組成的雜合基因型、132 bp和 158 bp 組成的雜合基因型在BM中特有;其余SSR座位中品種特有的等位基因及基因型見表3。
2.4" 基于SSR分析小型豬的遺傳多樣性
利用Cervus 3.0.7軟件計算4個品種豬在11個SSR座位的雜合度、PIC和Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài),進而分析4個品種豬的遺傳多樣性。由表4可知,在11個SSR座位中,4個群體的平均期望雜合度在0.687 9~0.771 9之間,SYW9座位最小為0.286 3;平均觀察雜合度在0.688 5~0.803 8間,SYW9座位最小為0.3 125。在WZS、BM和ZX中,平均觀察雜合度均高于平均期望雜合度,而LC的平均觀察雜合度低于平均期望雜合度。
WZS在SYW 5、7、10、16、20、23和25座位均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(Plt;0.01);BM在所有SSR座位上均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(Pgt;0.01);LC在SYW5、8、9、10、13、16、20和25座位均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(Plt;0.01);ZX在SYW8、9、10、13和16座位均處于 Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(Plt;0.01)。
11個SSR座位的PIC值為0.262 0(SYW9)~0.877 5(SYW20),WZS和ZX在11個SSR座位上均表現(xiàn)為高度多態(tài)(PICgt;0.5);BM在SYW9座位上表現(xiàn)為中度多態(tài)(PIC=0.262 0),其余10個座位上為高度多態(tài)(PICgt;0.5);LC在SYW7座位上表現(xiàn)為中度多態(tài)(PIC=0.435 7),其余10個座位上為高度多態(tài)(PICgt;0.5)。表明4個品種豬均具有較豐富的遺傳多樣性,而ZX的平均PIC最高(0.731 2),BM的平均PIC最低(0.623 4),說明ZX的遺傳多樣性最高,LC和WZS次之,BM的遺傳多樣性最低。
2.5" 4個品種小型豬的遺傳距離及系統(tǒng)進化樹
由表5可知,4個品種豬的遺傳一致度為 0.951 3~0.968 7(平均為0.962 1),遺傳距離為0.031 8~0.049 9(平均為0.038 7)。WZS與LC的遺傳一致度最高,遺傳距離最??;BM與LC的遺傳一致度最低,遺傳距離最大。
由圖2可知,WZS與LC聚類到一個分支,再與藏香豬聚類到一個分支,說明WZS與LC的親緣關(guān)系較近。
3" 討論與結(jié)論
3.1" 全基因組SSR分析方法的確定
本研究參考MISA軟件的最佳分析參數(shù)[11-13],以豬參考基因組(Sus scrofa 11.1)為例進行全基因組范圍SSR分析方法的初探, 通過比較SSR中重復單元的分布趨勢證實本研究分析方法的可靠性。Liu等對豬參考基因組(Sus scrofa 10.2)的研究表明,Di-SSR中AC/GT重復單元占比最多,其次為AT/TA、AG/CT,最少為CG/GC,占比分別為45.91%、30.09%、23.64%和0.36%;Tri-SSR中AAC/GTT所占比例(30.46%)最多,其次為AAT/ATT(26.91%)、AAG/CTT(11.82%),最少為ACG/CGT(0.13%);Tetra-SSR中重復比例最多的3個是AAAT/ATTT(27.57%)、AAAG/CTTT(14.86%)和AAAC/GTTT(17.91%)[14],本研究結(jié)果與以上結(jié)果相似,進一步證實本研究分析方法的可行性,保證了其應用于后續(xù)4個豬種中全基因組SSR的分析的可靠性。
3.2" 基于SSR分型的種間遺傳多樣性研究
利用SSR的分型可進行物種的遺傳多樣性、品種的資源鑒定與分類、親緣關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建及動物標記輔助選育等方面的研究。但基于現(xiàn)有的研究報道發(fā)現(xiàn),不同物種間的SSR具有很大的多態(tài)性差異。何瑜林等利用貂、魚中的SSR進行豬品種的鑒定,其分別選取的34、55條SSR引物中僅有少數(shù)幾條可用于品種的鑒定[15-16]。此外,隨著基因組重測序技術(shù)的發(fā)展,Liu等以豬參考基因組中掃描的SSR為基礎(chǔ),并結(jié)合國內(nèi)外家豬及野豬的個體基因組重測序數(shù)據(jù)進行SSR的分型,首次從全基因組層面進行豬SSR的分析[14]。由于豬的參考基因組(Sus scrofa 10.2)源于國外的杜洛克豬,以此挖掘得到的SSR在我國家豬中進行分型具有品種的片面性,導致在豬參考基因組中挖掘得到的1 620 469個SSR中,僅有16 527個在測序個體中表現(xiàn)為高度多態(tài)性而作為遺傳標記。因此,利用種間的SSR信息進行品種的遺傳多樣性、品種鑒定等研究并不能很好地反映出研究對象的真實情況,在進行相應的研究過程中可能會費時費力。
為真實反映4個小型豬品種中的SSR特性,本研究直接針對4個待測小型豬品種進行全基因組SSR文庫構(gòu)建,通過8種生物素標記的探針雜交全基因組含有SSR的序列,獲得待測個體中更為準確的SSR,并依據(jù)其長度進行基因分型,在WZS、BM、LC及ZX中分別發(fā)現(xiàn)60 020、70 886、63 968、42 400個具有多態(tài)性的SSR(SSLP≥2),豐富了小型豬基因組中的SSR信息并可作為小型豬的遺傳標記而進一步應用。
3.3" SSR類型及組成的特點
據(jù)研究報道,在絕大多數(shù)真核生物中單核苷酸組成的SSR占有最多的比例,其次為雙核苷酸組成的SSR[17-19]。本研究在4個小型豬品種中發(fā)現(xiàn),SSR總數(shù)在WZS中最多,而在ZX中最少,但雙、三、四、五、六核苷酸SSR的含量呈現(xiàn)由多至少的變化。此外,4個豬種中不同類型SSR重復單元的分布模式卻存在差異,Hexa-SSR中重復單元在4個豬種中均表現(xiàn)不同的分布模式,而ZX中Tri-和Tetra-SSR重復單元的分布模式不同于其他3個豬種。因此,推測依據(jù)SSR中重復單元的分布模式可以用于區(qū)分4個小型豬品種,結(jié)合SSR的SSLP進行群體驗證,可應用于種間的鑒定。
現(xiàn)有研究認為,基因組重測序的建庫及測序過程中GC序列的偏好性可能是導致不同類型SSR中含有GC的重復單元(CG、CCG等)較少的原因[20],但本研究利用的寡核苷酸探針兼顧了4種核苷酸,包含(ACG)8及(AGG)8探針等對基因組的SSR序列進行雜交,保證更為全面地富集全基因組中SSR;此外,基于豬參考基因組的研究結(jié)果,均發(fā)現(xiàn)CG/GC、ACG/CGT等重復單元組成的SSR占據(jù)很少的比例,這結(jié)果與玉米等物種中的研究結(jié)果[21-24]相似。以上表明,GC重復單元的SSR占據(jù)少部分且具有較低的多態(tài)性,其可能是因為GC富集的序列常與功能性相關(guān)[25]。
本研究首次從全基因組水平進行4個小型豬種SSR的比較,分析了SSR重復單元的分布模式,并發(fā)現(xiàn)在4個豬種中,雙、三、四、五及六核苷酸組成的SSR中重復單元的分布模式截然不同,借此可用于區(qū)分和鑒別4個豬種。對品種間共有及特異的SSR進行挖掘和注釋,發(fā)現(xiàn)了具有長度多態(tài)性的SSR可能通過影響相關(guān)基因的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)進而影響基因功能,如FGF23、MYF6、IGF1R和LEPROT等基因,提示多態(tài)性SSR可能與小型豬的生長發(fā)育相關(guān)。
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