摘要：挖掘五指山豬、巴馬豬、近交陸川豬和藏香豬中全基因組SSR，比較分析4個豬種中SSR分布特性并進行功能性SSR注釋，為小型豬種質(zhì)資源的保存及利用提供分子標記。選取4個品種豬各15頭，分別構(gòu)建全基因組SSR文庫并進行測序，結(jié)合生物信息學分析方法，統(tǒng)計不同類型SSR（雙、三、四、五、六核苷酸）的數(shù)量、SSR重復單元的分布模式、SSR的長度多態(tài)性并對功能性SSR進行注釋，比較分析4個小型豬品種中全基因組的SSR特性。對豬參考基因組和4個豬種全基因組SSR統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，五指山豬中SSR的數(shù)量最多，巴馬豬和近交陸川豬其次，藏香豬中最少，且每個品種中雙、三、四核苷酸SSR的數(shù)量占比最多，與豬參考基因組中不同類型SSR的占比結(jié)果相似。SSR重復單元的分布模式顯示，4個豬種中雙、五核苷酸SSR中重復單元的分布模式相同，藏香豬中三、四核苷酸SSR中重復單元的分布模式與其他3個豬種不同，而六核苷酸SSR中重復單元的分布模式在4個豬種中完全不同。SSR的長度多態(tài)性分析表明，五指山豬、巴馬豬、近交陸川豬和藏香豬中分別有19 957、14 099、20 671、14 120個長度多態(tài)性gt;1的SSR定位到豬參考基因組，其中，有2 518個SSR共同存在于4個品種中，而特異存在于4個豬種中的SSR分別有 5 173、2 802、5 969、4 463個。此外，對SSR進行注釋發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性SSR可能影響FGF23、MYF6、IGF1R和LEPROT等與豬的生長發(fā)育相關(guān)基因的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)。本試驗首次構(gòu)建豬全基因組SSR文庫并測序，在全基因組水平上比較分析4個小型豬品種的SSR，揭示了不同小型豬品種間SSR重復單元的分布模式存在差異，并對品種間共有及特異的SSR進行挖掘和注釋，發(fā)現(xiàn)了可能與小型豬的生長發(fā)育相關(guān)具有長度多態(tài)性的SSR。本研究挖掘得到的SSR補充了豬基因組遺傳變異信息和小型豬分子標記，建立的SSR分析方法可為不同物種、品種間SSR分析及鑒定工作提供參考。

關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星；重復單元；長度多態(tài)性；小型豬；分子標記

中圖分類號：S828.2" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0174-07

涂尾龍，張鶯鶯，黃" 濟，等. 小型豬微衛(wèi)星標記的遺傳多樣性［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2024，52（23）：174-181.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.024

收稿日期：2023-09-19

基金項目：上海市科技興農(nóng)技術(shù)創(chuàng)新項目（編號：X2022-02-08-00-12-F01106）。

作者簡介：涂尾龍（1983—），男，江西撫州人，博士研究生，高級畜牧師，主要從事動物遺傳育種研究。E-mail：tuweilong@saas.sh.cn。

通信作者：王洪洋，博士，副研究員，主要從事動物遺傳育種研究。E-mail：wanghongyang@saas.sh.cn。

簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR）是由2～6個堿基組成的重復單元以串聯(lián)的方式形成，其具有廣泛存在性和高度多態(tài)性，而位于基因上（編碼區(qū)和非編碼區(qū)）的多態(tài)性SSR具有很強的功能性［1］。此外，小型豬具有獨特的生長發(fā)育規(guī)律，其體型小的特點可用于骨骼、肌肉發(fā)育等研究，而本研究中的巴馬豬、藏香豬又分別具有肉質(zhì)鮮美、抗逆性強等特點，因此對于小型豬基因組SSR的挖掘可為豬的經(jīng)濟性狀研究提供條件。由此可見，對全基因組SSR的研究可為豬的遺傳育種研究提供分子標記，進而應用于群體遺傳多樣性及進化等。此外，功能性SSR的分析對豬生長發(fā)育等性狀的研究至關(guān)重要。目前，大部分關(guān)于SSR的研究僅限于應用單個或多個SSR進行群體遺傳多樣性及種間鑒定方面［2-5］，而其在豬中的應用往往需要借鑒于其他物種中的SSR序列［6-7］，由于不同物種間的SSR具有很大的多態(tài)性差異，常導致試驗復雜性和結(jié)果的不準確性。隨著組學技術(shù)的發(fā)展，使基于表達序列標簽（EST）和高通量測序數(shù)據(jù)挖掘SSR成為可能，如石甜甜等對144個EST-SSR標記進行糜子遺傳資源評估［8］，魏丹丹等采用磁珠富集法建立SSR文庫并挖掘序列，結(jié)合EST-SSR分子標記驗證了可以穩(wěn)定擴增的SSR引物［9］。Liu等首次分析了豬參考基因組（Sus scrofa 10.2）中SSR的特性，并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫中的102個重測序個體（源于國內(nèi)外17個豬種）數(shù)據(jù)進行SSR分型，發(fā)現(xiàn)了與疾病發(fā)生相關(guān)的功能性SSR位點［10］，但該研究中的SSR源于對豬參考基因組的掃描，而多態(tài)性SSR來自于多個品種的個體進行分析，并不能全面反映豬基因組層面的SSR特性?；赟SR在分子標記方面的應用和功能性SSR的重要性，以及豬基因組SSR的不全面性，本研究擬從全基因組水平對4個小型豬的SSR進行全面挖掘和比較分析。利用選擇雜交法構(gòu)建4個豬種的SSR文庫，結(jié)合生物信息學比較分析4個豬種中SSR的分布模式及差異，對SSR進行注釋并分析功能性SSR。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

試驗材料包括170頭小型豬的耳組織樣品，來源于上海市農(nóng)業(yè)科學院封閉繁育20年的近交陸川豬（LC）53頭、上海交通大學的巴馬豬（BM）16頭、南方醫(yī)科大學動物科技學院的藏香豬（ZX）50頭和海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所的五指山豬（WZS）51頭。耳組織采集后保存于裝有75%乙醇的EP管中，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。試驗時間為2019年6—12月及2020年6—12月。

1.2" 基因組DNA提取

采用酚三氯甲烷方法對所有樣品進行基因組DNA提取，分別利用NanoDrop 2000、1% 瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像（Newbio Gi-1）檢測DNA濃度、D值及DNA質(zhì)量。

1.3" 微衛(wèi)星及其引物的篩選

基于4個品種小型豬的全基因組微衛(wèi)星（simple sequence repeat，SSR）測序數(shù)據(jù)，獲得 2 518 個品種間共有的SSR，從中選取11個位于基因上的SSR進行引物設(shè)計及多態(tài)性片段檢測，用于評估4個品種小型豬的遺傳多樣性。其中，正向引物的5′端連接熒光標記，本研究共用到3種熒光標記，6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein，6-FAM）、六氯熒光素（hexachloro fluorescein，HEX）和羧基四甲基羅丹明（carboxytetramethylrhodamine，TAMRA）分別顯示藍光、綠光和橙色熒光，反向引物為普通引物，均由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。

1.4" 熒光引物PCR擴增

PCR反應體系（20 μL）包括30 ng/μL的模板DNA 1 μL、Mg2+含量25 mmol/L 10×buffer 2 μL、10 mmol/L 的dNTP 0.5 μL、5 U/L的Taq聚合酶0.5 μL、1 mmol/L的正向熒光引物和反向普通引物各 1 μL 及ddH2O 14 μL。PCR擴增在ABI-2720擴增儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）上進行，程序為 94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，不同退火溫度退火30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若條帶清晰，無明顯引物二聚體和雜帶，可判定為擴增到目的片段。

1.5" 毛細管電泳及等位基因分型

毛細管電泳可以精確地區(qū)分SSR片段的大小。取10 μL熒光PCR產(chǎn)物，加入冷的70%乙醇至終體積50 μL，振蕩充分混勻后3 700 r/min、4 ℃離心 30 min，靜置15 min待乙醇揮發(fā)干凈后加入GS-500LIZ分子內(nèi)標和HiDi，瞬離樣品至PCR儀進行95 ℃ 4 min變性后，于ABI 3730XL（美國應用生物系統(tǒng)公司）中進行毛細管電泳，利用GeneMapper軟件對電泳結(jié)果進行微衛(wèi)星片段大小和信號值的分析，確定每個微衛(wèi)星位點的等位基因型。

1.6" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Cervus 3.0.7軟件計算每個SSR的等位基因數(shù)（Na）、等位基因頻率、基因型頻率、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC），同時檢驗4個品種豬的Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。采用PopGen 1.32進行4個品種間遺傳相似性及遺傳距離分析。采用MEGA 7.0.26構(gòu)建Neighbour-Joining聚類圖及Structure 2.2分析群體遺傳結(jié)構(gòu)。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 4個品種小型豬SSR的獲得

筆者所在課題組前期建立4個品種小型豬的全基因組SSR文庫并進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)4個品種中共有的多態(tài)性SSR位點有2 518個，對其進行注釋發(fā)現(xiàn)大部分SSR位于基因間區(qū)（63.0%～65.4%），而位于基因區(qū)域的SSR中，有80、357和436個SSR分別位于5′UTR、3′UTR和編碼區(qū)域。對位于基因區(qū)域上的SSR，在不同染色體上隨機選取11個進行4個品種小型豬的遺傳多樣性分析。11個SSR在基因組上的位置及相應引物信息見表1。

2.2" 毛細管電泳檢測SSR的目的片段

圖1僅列出2個SSR在相應個體中的檢測結(jié)果，其中，A圖是ZX的35號個體在SYW7上的等位基因峰值，其2個峰值表明該等位基因是雜合子，其片段大小分別為208、232 bp；B圖是WZS的1號個體在SYW9上的等位基因峰值，僅有1個峰值，表明該等位基因是純合子，其片段大小是164 bp。

2.3" 等位基因數(shù)及品種間等位基因

采用11對SSR引物對170頭個體進行熒光PCR，獲得等位基因數(shù)和等位基因大小的統(tǒng)計結(jié)果，由表2可知， 在4個品種小型豬的170頭個體中檢

測到122個等位基因，每個位點檢測到的等位基因數(shù)為8～17個，平均為11.1個；其中，SYW5和SWY8的等位基因數(shù)最多（17個），SYW10、SYW13和SWY19的等位基因數(shù)最少（8個）。此外，11個SSR在4個品種中擴增到的等位基因數(shù)不同，WZS、BM、LC和ZX中的等位基因數(shù)分別為76、66、76、81個，平均等位基因數(shù)分別為6.909 1、6.000 0、6.909 1、7.363 6個。

在4個品種豬中，分別計算每個SSR的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF），保留MAFgt;0.01的等位基因，通過計算每個品種內(nèi)的等位基因頻率和基因型頻率挖掘種間特有的等位基因和基因型。由表3可知，在11個SSR座位中，檢測到WZS特有等位基因和基因型分別有4、6個，BM特有等位基因和基因型分別有3、11個，LC特有等位基因和基因型均有9個，ZX特有等位基因和基因型分別有13、10個。以SYW5座位為例，在4個品種中共檢測到17個等位基因，其中，172 bp的等位基因為BM特有，122、134、160 bp的等位基因為LC特有，138、144、146 bp 的等位基因為ZX特有，由148 bp組成的純合基因型在WZS中特有，由 130 bp 和158 bp組成的雜合基因型、132 bp和 158 bp 組成的雜合基因型在BM中特有；其余SSR座位中品種特有的等位基因及基因型見表3。

2.4" 基于SSR分析小型豬的遺傳多樣性

利用Cervus 3.0.7軟件計算4個品種豬在11個SSR座位的雜合度、PIC和Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，進而分析4個品種豬的遺傳多樣性。由表4可知，在11個SSR座位中，4個群體的平均期望雜合度在0.687 9～0.771 9之間，SYW9座位最小為0.286 3；平均觀察雜合度在0.688 5～0.803 8間，SYW9座位最小為0.3 125。在WZS、BM和ZX中，平均觀察雜合度均高于平均期望雜合度，而LC的平均觀察雜合度低于平均期望雜合度。

WZS在SYW 5、7、10、16、20、23和25座位均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（Plt;0.01）；BM在所有SSR座位上均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（Pgt;0.01）；LC在SYW5、8、9、10、13、16、20和25座位均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（Plt;0.01）；ZX在SYW8、9、10、13和16座位均處于 Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（Plt;0.01）。

11個SSR座位的PIC值為0.262 0（SYW9）～0.877 5（SYW20），WZS和ZX在11個SSR座位上均表現(xiàn)為高度多態(tài)（PICgt;0.5）；BM在SYW9座位上表現(xiàn)為中度多態(tài)（PIC=0.262 0），其余10個座位上為高度多態(tài)（PICgt;0.5）；LC在SYW7座位上表現(xiàn)為中度多態(tài)（PIC=0.435 7），其余10個座位上為高度多態(tài)（PICgt;0.5）。表明4個品種豬均具有較豐富的遺傳多樣性，而ZX的平均PIC最高（0.731 2），BM的平均PIC最低（0.623 4），說明ZX的遺傳多樣性最高，LC和WZS次之，BM的遺傳多樣性最低。

2.5" 4個品種小型豬的遺傳距離及系統(tǒng)進化樹

由表5可知，4個品種豬的遺傳一致度為 0.951 3～0.968 7（平均為0.962 1），遺傳距離為0.031 8～0.049 9（平均為0.038 7）。WZS與LC的遺傳一致度最高，遺傳距離最??；BM與LC的遺傳一致度最低，遺傳距離最大。

由圖2可知，WZS與LC聚類到一個分支，再與藏香豬聚類到一個分支，說明WZS與LC的親緣關(guān)系較近。

3" 討論與結(jié)論

3.1" 全基因組SSR分析方法的確定

本研究參考MISA軟件的最佳分析參數(shù)［11-13］，以豬參考基因組（Sus scrofa 11.1）為例進行全基因組范圍SSR分析方法的初探， 通過比較SSR中重復單元的分布趨勢證實本研究分析方法的可靠性。Liu等對豬參考基因組（Sus scrofa 10.2）的研究表明，Di-SSR中AC/GT重復單元占比最多，其次為AT/TA、AG/CT，最少為CG/GC，占比分別為45.91%、30.09%、23.64%和0.36%；Tri-SSR中AAC/GTT所占比例（30.46%）最多，其次為AAT/ATT（26.91%）、AAG/CTT（11.82%），最少為ACG/CGT（0.13%）；Tetra-SSR中重復比例最多的3個是AAAT/ATTT（27.57%）、AAAG/CTTT（14.86%）和AAAC/GTTT（17.91%）［14］，本研究結(jié)果與以上結(jié)果相似，進一步證實本研究分析方法的可行性，保證了其應用于后續(xù)4個豬種中全基因組SSR的分析的可靠性。

3.2" 基于SSR分型的種間遺傳多樣性研究

利用SSR的分型可進行物種的遺傳多樣性、品種的資源鑒定與分類、親緣關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建及動物標記輔助選育等方面的研究。但基于現(xiàn)有的研究報道發(fā)現(xiàn)，不同物種間的SSR具有很大的多態(tài)性差異。何瑜林等利用貂、魚中的SSR進行豬品種的鑒定，其分別選取的34、55條SSR引物中僅有少數(shù)幾條可用于品種的鑒定［15-16］。此外，隨著基因組重測序技術(shù)的發(fā)展，Liu等以豬參考基因組中掃描的SSR為基礎(chǔ)，并結(jié)合國內(nèi)外家豬及野豬的個體基因組重測序數(shù)據(jù)進行SSR的分型，首次從全基因組層面進行豬SSR的分析［14］。由于豬的參考基因組（Sus scrofa 10.2）源于國外的杜洛克豬，以此挖掘得到的SSR在我國家豬中進行分型具有品種的片面性，導致在豬參考基因組中挖掘得到的1 620 469個SSR中，僅有16 527個在測序個體中表現(xiàn)為高度多態(tài)性而作為遺傳標記。因此，利用種間的SSR信息進行品種的遺傳多樣性、品種鑒定等研究并不能很好地反映出研究對象的真實情況，在進行相應的研究過程中可能會費時費力。

為真實反映4個小型豬品種中的SSR特性，本研究直接針對4個待測小型豬品種進行全基因組SSR文庫構(gòu)建，通過8種生物素標記的探針雜交全基因組含有SSR的序列，獲得待測個體中更為準確的SSR，并依據(jù)其長度進行基因分型，在WZS、BM、LC及ZX中分別發(fā)現(xiàn)60 020、70 886、63 968、42 400個具有多態(tài)性的SSR（SSLP≥2），豐富了小型豬基因組中的SSR信息并可作為小型豬的遺傳標記而進一步應用。

3.3" SSR類型及組成的特點

據(jù)研究報道，在絕大多數(shù)真核生物中單核苷酸組成的SSR占有最多的比例，其次為雙核苷酸組成的SSR［17-19］。本研究在4個小型豬品種中發(fā)現(xiàn)，SSR總數(shù)在WZS中最多，而在ZX中最少，但雙、三、四、五、六核苷酸SSR的含量呈現(xiàn)由多至少的變化。此外，4個豬種中不同類型SSR重復單元的分布模式卻存在差異，Hexa-SSR中重復單元在4個豬種中均表現(xiàn)不同的分布模式，而ZX中Tri-和Tetra-SSR重復單元的分布模式不同于其他3個豬種。因此，推測依據(jù)SSR中重復單元的分布模式可以用于區(qū)分4個小型豬品種，結(jié)合SSR的SSLP進行群體驗證，可應用于種間的鑒定。

現(xiàn)有研究認為，基因組重測序的建庫及測序過程中GC序列的偏好性可能是導致不同類型SSR中含有GC的重復單元（CG、CCG等）較少的原因［20］，但本研究利用的寡核苷酸探針兼顧了4種核苷酸，包含（ACG）8及（AGG）8探針等對基因組的SSR序列進行雜交，保證更為全面地富集全基因組中SSR；此外，基于豬參考基因組的研究結(jié)果，均發(fā)現(xiàn)CG/GC、ACG/CGT等重復單元組成的SSR占據(jù)很少的比例，這結(jié)果與玉米等物種中的研究結(jié)果［21-24］相似。以上表明，GC重復單元的SSR占據(jù)少部分且具有較低的多態(tài)性，其可能是因為GC富集的序列常與功能性相關(guān)［25］。

本研究首次從全基因組水平進行4個小型豬種SSR的比較，分析了SSR重復單元的分布模式，并發(fā)現(xiàn)在4個豬種中，雙、三、四、五及六核苷酸組成的SSR中重復單元的分布模式截然不同，借此可用于區(qū)分和鑒別4個豬種。對品種間共有及特異的SSR進行挖掘和注釋，發(fā)現(xiàn)了具有長度多態(tài)性的SSR可能通過影響相關(guān)基因的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)進而影響基因功能，如FGF23、MYF6、IGF1R和LEPROT等基因，提示多態(tài)性SSR可能與小型豬的生長發(fā)育相關(guān)。

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