摘要： 本研究通過(guò)對(duì)腹瀉犢牛腸道內(nèi)容物中分離到的牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）毒株進(jìn)行分析，首次確認(rèn)該毒株為BVDV-2d亞型，命名為22-Gansu-F3。通過(guò)病毒分離、鑒定及全基因組測(cè)序，本研究不僅探討了腹瀉犢牛腸道的病理變化，還分析了其同義密碼子使用模式的遺傳特征。結(jié)果表明，在開(kāi)放閱讀框中，CpG二核苷酸的使用頻率顯著降低，并且在選擇同義密碼子的過(guò)程中，精氨酸對(duì)含CpG同義密碼子的使用具有顯著抑制作用。為了進(jìn)一步明確不同功能性蛋白質(zhì)編碼序列的同義密碼子使用模式的遺傳學(xué)特征，本研究比較了不同編碼序列的同義密碼子使用差異，發(fā)現(xiàn)N^pro和NS4A的編碼區(qū)在同義密碼子使用上與其他蛋白質(zhì)顯著不同。此外，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株的不同蛋白質(zhì)編碼區(qū)在適應(yīng)豬、羊和駱駝的同義密碼子使用模式上表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，為這些動(dòng)物體內(nèi)病毒蛋白的翻譯提供了潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為中國(guó)BVDV-2型的進(jìn)化動(dòng)態(tài)提供了新的理論依據(jù)，并為預(yù)防該亞型成為中國(guó)主要流行亞型提供了早期預(yù)警。

關(guān)鍵詞： 牛病毒性腹瀉病毒；BVDV-2d；病理變化；同義密碼子；遺傳

中圖分類號(hào)： S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2024）11-2111-11

Isolation， identification and analysis of synonymous codon usage patterns of BVDV-2d strain

YANG Xuanye^1，2， GAO Mingyang^1，2， HU Xinyan^1，2， WANG Jinqian^1，2， WANG Huihui^1，3， DING Yulin⁴， CAO Xiaoan³， MA Xiaoxia^1，2

（1.Biomedical Research Center/Key Laboratory of Biotechnology and Bioengineering of State Ethnic Affairs Commission， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China；2.School of Life Sciences and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730010， China；3.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046， China；4.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease， College of Veterinary Medicine， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot" 010018， China）

Abstract： This study analyzed a bovine viral diarrhea virus （BVDV） strain isolated from the intestinal contents of diarrheic calves， and classified it as subtype BVDV-2d for the first time and designated it as 22-Gansu-F3. Through viral isolation， identification， and whole-genome sequencing， this study not only explored the pathological changes in the intestines of diarrheic calves， but also analyzed the genetic characteristics of their synonymous codon usage pattern. Our findings revealed a significant reduction in the usage frequency of CpG dinucleotides within open reading frames. Besides， arginine showed notable suppression of synonymous codon usage containing CpG during the selection process for synonymous codon. To elucidate the genetic features of synonymous codon usage patterns among various functional protein-coding sequences， we compared the usage differences of synonymous codons in different coding sequences and found significant differences in the synonymous codon usage of the N^pro and NS4A encoding regions compared to other proteins. Furthermore， the different protein-coding regions of the BVDV-2d strain 22-Gansu-F3 exhibited good adaptability for synonymous codon usage pattern in pigs， sheep， and camels， and provided a potential material basis for the translation of viral proteins in these hosts. The research results offer new theoretical insights into the evolutionary dynamics of BVDV subtype 2 in China and serve as an early warning to prevent this subtype from becoming the predominant circulating subtype.

Key words： bovine viral diarrhea virus；BVDV-2d；pathological change；synonymous codon；heredity

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）給中國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的破壞。根據(jù)侵染細(xì)胞后引起的不同的病變效應(yīng)，將BVDV分為2種生物表型，即致細(xì)胞病變型（CP）和非致細(xì)胞病變型（NCP）^[1]。由于BVDV基因組的高突變率，易感動(dòng)物感染后通常導(dǎo)致不同的臨床癥狀^[2]。BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬的一員，擁有長(zhǎng)度約12 kb的單股正鏈RNA基因組。病毒基因組編碼1個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），能夠編碼1個(gè)多聚蛋白質(zhì)^[3]，該多聚蛋白質(zhì)由N^pro、capsid、E0、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B組成^[4]。目前，在世界范圍內(nèi)已鑒定出3種BVDV基因型：BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3（也稱為HoBi樣瘟病毒）^[5]。隨著中國(guó)集約化養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，BVDV感染引起的重要流行傳染病越來(lái)越被重視，其中1b、1c、1m、1q、1v和2a型在中國(guó)最常見(jiàn)^[6-9]。

在病毒與宿主長(zhǎng)期共同進(jìn)化的過(guò)程中，BVDV進(jìn)化出多種策略來(lái)逃避宿主的先天免疫和適應(yīng)性免疫，從而促進(jìn)病毒的生存和復(fù)制^[3，10-11]。在BVDV自身很強(qiáng)的遺傳變異率的推動(dòng)下，其基因組在同義密碼子使用模式上表現(xiàn)出較大的遺傳差異，這有助于病毒完成感染并適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境^[3，12]。以往中國(guó)BVDV流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果表明，BVDV-1型感染引起的陽(yáng)性牛比例較高，BVDV-2型感染引起的陽(yáng)性牛比例較低^[13-15]。此外，BVDV-2型毒株也與現(xiàn)有的BVDV-1型疫苗株存在抗原差異。相關(guān)生物學(xué)特征可能導(dǎo)致BVDV-2型在基因組結(jié)構(gòu)上與BVDV-1型具有不同的遺傳模式，特別是在同義密碼子使用模式上表現(xiàn)出更明顯的差異^{[3，7，12，16-17]}。由于病毒蛋白質(zhì)的同義密碼子使用模式可以在很大程度上反映病毒本身對(duì)宿主適應(yīng)的進(jìn)化動(dòng)態(tài)，對(duì)BVDV-2型不同病毒蛋白質(zhì)的同義密碼子使用模式的研究可以為BVDV-2型的進(jìn)化途徑提供新的參考。本研究成功地從有明顯臨床癥狀（急性腹瀉）牛腸道內(nèi)容物中分離出BVDV-2d毒株，命名為22-Gansu-F3。為了闡明BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株的遺傳特性，本研究擬利用同義密碼子使用模式相關(guān)的分析方法對(duì)分離毒株基因組中不同編碼序列（N^pro、capsid、E0、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）進(jìn)行遺傳特性分析。

1 材料與方法

1.1 腹瀉牛腸道組織的采集

按照《中華人民共和國(guó)動(dòng)物倫理審查指南》的相關(guān)要求，并經(jīng)西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，本研究對(duì)出現(xiàn)急性腹瀉臨床癥狀的犢牛尸體進(jìn)行十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織樣品的收集，并將收集到的組織樣品放置于10%的福爾馬林中性緩沖液中進(jìn)行固定處理，而后通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。對(duì)犢牛腸道內(nèi)容物進(jìn)行采集后，通過(guò)低溫冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃保存以備后續(xù)研究。

1.2 毒株的檢測(cè)和亞型分類

使用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品）從上述腸道內(nèi)容物樣本中提取總RNA。RNA提取后根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用本團(tuán)隊(duì)前期檢測(cè)BVDV的方法^[7]對(duì)本試驗(yàn)中的cDNA樣品進(jìn)行RT-PCR特異性條帶[5′非翻譯區(qū)（UTR）序列區(qū)～250 bp]擴(kuò)增。并對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)一步分析遺傳分類。基于目前已經(jīng)報(bào)道的不同基因亞型（BVDV1a-1u、BVDV2a-2d和BVDV3）的5′UTR序列（表1），利用MAGE 7.0軟件采用統(tǒng)計(jì)方法（鄰接進(jìn)化樹(shù)法）對(duì)所擴(kuò)增的5′UTR序列進(jìn)行基因亞型的遺傳分析。

1.3 毒株的分離及毒價(jià)測(cè)定

使用10%（質(zhì)量體積比）無(wú)鈣鎂磷酸鹽緩沖液將腸道內(nèi)容物進(jìn)行重懸，高速離心后，用0.22 μm微濾膜過(guò)濾上清液并進(jìn)行除菌。用杜氏改良Eagle（DMEM）培養(yǎng)基與除菌后的上清液進(jìn)行等體積混合后，將2 mL混合液加入?yún)R合度約為50%的牛腎細(xì)胞系（MDBK）細(xì)胞培養(yǎng)物中，在5% CO₂和37 ℃的環(huán)境中孵育。2 h后棄掉上清液，并用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)物洗滌3次，最后加入含有1%血清的DMEM病毒維持液培養(yǎng)細(xì)胞5 d。每天觀察細(xì)胞病變情況，連續(xù)盲傳5代。若犬腎細(xì)胞系（MDBK）細(xì)胞發(fā)生病變，則利用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID₅₀）法進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)^[18]。

1.4 分離毒株基因組測(cè)序

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的不同BVDV-2毒株的全基因組序列信息，按照BVDV不同毒株基因組中保守區(qū)設(shè)計(jì)出能夠覆蓋病毒全基因組的特異性引物序列（表2）。設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增覆蓋BVDV分離物全基因組的重疊區(qū)域（表2）。分別將RT-PCR擴(kuò)增出來(lái)的特異性PCR產(chǎn)物利用DNA純化方法進(jìn)行提取，而后插入pMD-18T（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）克隆載體上構(gòu)成重組載體，并將鑒定為陽(yáng)性的克隆載體送擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNASTAR軟件中的EdiSeq程序進(jìn)行編輯和裁剪，以組成完整的BVDV基因組。

1.5 分析分離毒株基因組的同義密碼子使用遺傳特征

基于分離毒株全基因組的核苷酸信息，利用相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）來(lái)評(píng)估目標(biāo)編碼序列的同義密碼子使用偏嗜性^[19]。根據(jù)用RSCU判定同義密碼子使用偏嗜性的標(biāo)準(zhǔn)，RSCU越高，相應(yīng)的同義密碼子使用的頻次越高；反之，使用頻次就越低。同義密碼子使用頻次越高或越低均表現(xiàn)出明顯的使用偏嗜性。為了界定59種同義密碼子使用偏嗜的程度，將RSCU值大于1.6和小于0.6的同義密碼子分別定義為優(yōu)勢(shì)密碼子和劣勢(shì)密碼子。

分離毒株基因組中不同蛋白質(zhì)編碼序列，分別利用RSCU計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，并利用主成分分析法（PCA）將代表59個(gè)維度的59種同義密碼子的RSCU數(shù)據(jù)降維后，制作2維散點(diǎn)圖，進(jìn)行可視化處理^[20]。2維散點(diǎn)圖由PCA獲得的第1主成分參數(shù)（f′₁）和第2主成分參數(shù)（f′₂）構(gòu)成，通過(guò)散點(diǎn)所表現(xiàn)出來(lái)的群體特征來(lái)展現(xiàn)目標(biāo)編碼序列在同義密碼子使用模式上遺傳相似性的差異。此外，采用有效密碼子指數(shù)（ENC）分析突變壓力和自然選擇壓力對(duì)分離毒株不同編碼區(qū)同義密碼子使用模式的影響程度^[21]。根據(jù)ENC值的值域定義，當(dāng)ENC值為61時(shí)，目標(biāo)編碼序列的所有同義密碼子使用頻率是平均和隨機(jī)的（同義密碼子使用偏嗜性最弱）；當(dāng)ENC值為20時(shí)，目標(biāo)序列所編碼的氨基酸只選擇一種特定的同義密碼子來(lái)進(jìn)行編碼（同義密碼子使用偏嗜性最強(qiáng)）。由編碼序列密碼子第3位的G+C含量（GC3）以及ENC值組成的散點(diǎn)圖能更明了地展示編碼序列結(jié)構(gòu)與同義密碼子使用偏嗜性之間的相關(guān)性。

1.6 分析分離毒株不同編碼區(qū)對(duì)不同宿主同義密碼子使用模式的相似度

利用同義密碼子使用模式相似性指數(shù)的分析方法^[22]，分析病毒基因組中不同編碼序列同義密碼子使用模式與目標(biāo)宿主同義密碼子使用模式之間的相似度。計(jì)算公式如下：

其中，R（A，B）反映向量A（病毒編碼序列）與向量B（目標(biāo)宿主）在同義密碼子使用模式上呈現(xiàn)的矢量夾角的余弦值。a_i代表病毒編碼序列59個(gè)同義密碼子中密碼子i的RSCU值，b_i表示目標(biāo)宿主密碼子i的RSCU值。D（A，B）反映病毒編碼序列與宿主在同義密碼子使用模式上的相似度，即數(shù)值越小，相似度越高。此外，本研究中所涉及的宿主包括牛、羊、豬、小鼠、兔和駱駝，并且特定宿主的同義密碼子使用模式可以在已報(bào)道的密碼子數(shù)據(jù)中查詢獲得^[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV毒株的分離與鑒定

利用RT-PCR技術(shù)可從腹瀉犢牛腸道內(nèi)容物中擴(kuò)增出特異性PCR產(chǎn)物條帶，經(jīng)過(guò)測(cè)序獲得其5′UTR的序列信息。將獲得的序列信息與已知BVDV不同亞型5′UTR序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其與BVDV-2d亞型的遺傳距離接近（圖1），將分離毒株命名為22-Gansu-F3。該毒株能夠致MDBK細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變，使用TCID₅₀法測(cè)定毒價(jià)為10^-5.125/mL。

2.2 腹瀉犢牛腸道組織病變檢測(cè)

利用HE染色法，對(duì)所采集的腹瀉犢牛不同腸道組織進(jìn)行病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，十二指腸纖維化嚴(yán)重，黏膜層結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞并伴隨小腸絨毛脫落（圖2A）；空腸固有層大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集（圖2B）；回腸淋巴母細(xì)胞損傷導(dǎo)致淋巴細(xì)胞中心耗竭，腸上皮細(xì)胞腫脹、壞死、破裂（圖2C）；結(jié)腸上皮細(xì)胞大量脫落壞死并且伴隨纖維化（圖2D）。上述不同腸道組織的病變很可能是22-Gansu-F3毒株感染犢牛導(dǎo)致病毒性腹瀉的病理原因。

2.3 BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株同義密碼子使用偏嗜性

對(duì)BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株全基因組的RSCU值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，59種同義密碼子使用模式具有明顯的偏嗜性（表3）。具有2個(gè)同義密碼子的氨基酸在同義密碼子使用模式中是相對(duì)較平衡的，即RSCU數(shù)值在1.00左右波動(dòng)；然而具有2種以上同義密碼子家族的氨基酸在同義密碼子使用模式上表現(xiàn)出明顯的偏嗜性。在這些具有明顯使用偏嗜性的同義密碼子中，使用頻率偏高的同義密碼子為編碼絲氨酸的AGU，編碼脯氨酸的CCA，編碼蘇氨酸的ACA，編碼精氨酸的AGA和AGG；使用頻率偏低的同義密碼子為編碼亮氨酸的CUU和CUC，編碼異亮氨酸的AUU，編碼絲氨酸的UCG，編碼丙氨酸的GCG，編碼脯氨酸的CCG，編碼蘇氨酸的ACG，編碼精氨酸的CGU、CGC、CGA和CGG。從表3可知，含有CpG二核苷酸的同義密碼子的使用被相對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸顯著抑制，并且精氨酸的6種同義密碼子（CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG）使用模式均呈現(xiàn)出顯著的使用偏嗜性。這些結(jié)果表明BVDV-2d型 22-Gansu-F3毒株基因組在同義密碼子使用上受到遺傳選擇壓力的影響。

2.4 BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼序列具有不同的密碼子使用偏嗜性

根據(jù)ENC-GC3散點(diǎn)圖評(píng)判規(guī)則，散點(diǎn)越接近期望曲線，則其對(duì)應(yīng)的編碼序列在同義密碼子使用模式上越受到核苷酸突變選擇壓力的影響，反之，散點(diǎn)越偏離期望曲線，則其對(duì)應(yīng)的編碼序列在同義密碼子使用模式上越受到自然選擇壓力的影響^[21]。利用ENC-GC3散點(diǎn)圖對(duì)BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同編碼序列的密碼子使用模式具有差異性，并且所有編碼序列的ENC值均位于“倒鐘”形期望曲線下方（圖3）。除了N^pro和NS4A編碼序列外，其余非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的編碼序列具有相似的密碼子使用偏嗜性。此外，NS4A編碼序列的密碼子偏嗜性最強(qiáng)，而N^pro編碼序列的密碼子偏嗜性最弱。這些結(jié)果均表明，突變選擇壓力與自然選擇壓力對(duì)BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株基因組的不同蛋白質(zhì)編碼序列的影響是不均一的，且在N^pro和NS4A編碼序列上表現(xiàn)得更為突出。

基于ENC-GC3散點(diǎn)圖所反映出的密碼子使用偏嗜性（圖3），進(jìn)一步利用主成分分析（PCA）法將BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株基因組中的不同編碼序列區(qū)與開(kāi)放閱讀框（ORF）進(jìn)行同義密碼子使用模式遺傳差異性的分析。結(jié)果（圖4）表明，NS2蛋白[第1主成分參數(shù)（f′₁）=0.19，第2主成分參數(shù)（f′₂）=0.10]與ORF（f′₁=0.21， f′₂=0.22）在同義密碼子使用模式方面具有極高的相似性，其他病毒編碼序列均不同程度地與ORF同義密碼子使用模式存在遺傳差異（圖4）。此外，NS5A（f′₁=0.40， f′₂=0.08）和NS5B（f′₁=0.42， f′₂=0.15）二者在同義密碼子使用模式上具有極高的遺傳相似性；而N^pro（f′₁=1.37， f′₂=-0.60）、P7（f′₁=-0.73， f′₂=-3.04）、NS3（f′₁=0.03， f′₂=0.51）、NS4A（f′₁=-2.91， f′₂=0.80）和NS4B（f′₁=-0.26， f′₂=-0.16）作為非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在同義密碼子使用模式上表現(xiàn)出明顯的遺傳差異。與非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼序列相比，雖然4種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在同義密碼子使用模式上的遺傳相似性較高，但是彼此之間也存在同義密碼子使用模式上的顯著遺傳差異，即C（f′₁=0.64， f′₂=0.36）、E0 （f′₁=0.46， f′₂=0.68）、E1（f′₁=-0.01， f′₂=-0.01）和E2 （f′₁=0.18， f′₂=0.98）。上述結(jié)果說(shuō)明，生物學(xué)功能在特定病毒區(qū)域的同義密碼子使用模式中起著重要作用。

2.5 BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼區(qū)對(duì)宿主同義密碼子使用模式的差異性

鑒于BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼序列在突變選擇壓力與自然選擇壓力共同作用下所表現(xiàn)出來(lái)的同義密碼子使用的遺傳多樣性，相應(yīng)的編碼序列在不同宿主細(xì)胞中的翻譯適應(yīng)性的差異可以通過(guò)評(píng)估其與特定宿主同義密碼子使用模式的相似程度來(lái)展示。如圖5所示，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株的NS5B編碼區(qū)對(duì)6種宿主的密碼子使用適應(yīng)性最高，而P7編碼區(qū)對(duì)這些宿主的密碼子使用適應(yīng)性最低。除P7編碼區(qū)外，NS4A編碼區(qū)對(duì)宿主的密碼子使用適應(yīng)性明顯較弱。由于BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株是牛源病毒株，我們建立了BVDV對(duì)牛密碼子使用適應(yīng)性相關(guān)的參考（圖5B），以進(jìn)一步評(píng)估該毒株在密碼子使用時(shí)對(duì)其他敏感宿主的適應(yīng)程度。除此之外，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼序列與豬、羊和駱駝在同義密碼子使用模式的相似度方面十分接近（圖5A、5C、5F）。此外，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株所有蛋白質(zhì)編碼區(qū)域與小鼠的同義密碼子使用模式的相似度是最高的（圖5D），而其與家兔的同義密碼子使用模式的相似度最低（圖5E）。上述病毒不同編碼序列對(duì)宿主同義密碼子使用模式的適應(yīng)性可以為今后深入研究BVDV-2d型22-Gansu-F3在其他宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)提供一些參考依據(jù)。

3 討論

當(dāng)前中國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)處于高速發(fā)展的階段，這也為BVDV這種高突變率的病毒在易感動(dòng)物中迅速傳播以及不斷產(chǎn)生新的突變亞型提供了極好的條件^{[8，9，24-25]}。針對(duì)由BVDV感染引起的腹瀉臨床病例，最快速有效的鑒定方法就是利用RT-PCR擴(kuò)增5′UTR序列，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析亞型分類；另外，病理切片也是深入了解BVDV感染導(dǎo)致腸道病理變化最直接的手段。本研究從中國(guó)甘肅省1頭急性腹瀉犢牛中分離到1株BVDV-2d基因型的田間毒株（22-Gansu-F3），并且通過(guò)病理切片分析發(fā)現(xiàn)腹瀉犢牛腸道組織的病變特征。當(dāng)前，在中國(guó)分離的BVDV毒株基因型主要為1a～1d、1m～1n、1o～1q、1u、2a和2b^{[9，26-27]}。本研究在甘肅省養(yǎng)牛場(chǎng)分離并鑒定出來(lái)的BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株是該地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)的田間毒株。與一些已經(jīng)分離并定型的BVDV田間毒株不同，22-Gansu-F3毒株能夠引起犢牛的嚴(yán)重腹瀉，甚至造成犢牛死亡。這一致病特征不同于其他基因亞型（例如BVDV-1b和BVDV-1d）對(duì)犢牛致病力輕的特征，需防范其流行于中國(guó)不同地域^[28-29]。BVDV感染易感動(dòng)物后通常會(huì)造成動(dòng)物體內(nèi)淋巴細(xì)胞的極速衰竭，最終導(dǎo)致患病動(dòng)物免疫力降低，加重臨床癥狀^[30]。22-Gansu-F3毒株侵染犢牛后可引發(fā)腸道不同部位發(fā)生病理變化，可見(jiàn)空腸淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)增強(qiáng)，回腸淋巴細(xì)胞耗竭。鑒于病毒作為一種必須在活細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和快速進(jìn)化的生物體^[31-32]， BVDV感染可影響宿主代謝網(wǎng)絡(luò)的正常狀態(tài)及補(bǔ)體系統(tǒng)的抗病毒狀態(tài)等^[33]，最終導(dǎo)致種類繁多的BVDV基因亞型對(duì)宿主的致病性也呈現(xiàn)出多樣性。

此外，對(duì)分離毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化的相關(guān)性分析，有助于研究被新型BVDV感染的犢牛器官組織發(fā)生的病理變化以及引起的特異性免疫應(yīng)答。22-Gansu-F3毒株的基因組在密碼子使用模式上顯著抑制了多種同義密碼子的選擇使用，尤其是含有CpG二核苷酸的同義密碼子。由于CpG和UpA二核苷酸能夠在一定程度上刺激宿主的免疫反應(yīng)，大多數(shù)感染哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物的RNA病毒對(duì)UpA和CpG二核苷酸有很大的抑制作用^[34-35]。此外，CpG二核苷酸可以顯著誘導(dǎo)由干擾素（IFN）激活的抗病毒活性^[36-37]。22-Gansu-F3毒株低頻率選擇含有CpG二核苷酸的同義密碼子，從而抑制IFN激活的抗病毒作用。22-Gansu-F3毒株除了在密碼子使用模式上抑制一些同義密碼子外，還依賴于具有特定密碼子使用模式的N^pro和 NS4A蛋白來(lái)成功維持其在宿主中的復(fù)制。N^pro蛋白作為一種獨(dú)特的蛋白酶，其在BVDV生命周期中發(fā)揮著多種生物學(xué)活性，例如水解酶活性和拮抗干擾素的活性等^[38-39]。NS4A可以作為NS3蛋白酶輔助因子、復(fù)制酶組分和病毒粒子成熟的輔助因子^[40]。同義密碼子使用模式的特殊性對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)在翻譯、空間構(gòu)象形成以及生物學(xué)活性方面均具有影響力^[41]。BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株N^pro和 NS4A蛋白同義密碼子使用模式表現(xiàn)出來(lái)的遺傳特異性與其具有多種生物學(xué)功能是相關(guān)的。除此之外，雖然與BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株ORF相比，P7編碼區(qū)具有明顯不同的同義密碼子使用模式，但P7編碼區(qū)在核苷酸成分限制介導(dǎo)的突變選擇壓力主導(dǎo)下形成的同義密碼子使用模式與病毒ORF的使用模式相似度較高。BVDV P7蛋白在感染性病毒顆粒的形成中起著重要作用，并協(xié)助病毒有效釋放^[42]。P7區(qū)密碼子的整體使用也可能在一定程度上受到P7蛋白生物學(xué)功能的影響。這種遺傳特征可能反映了P7蛋白的整體密碼子使用需要適應(yīng)病毒多聚蛋白質(zhì)的密碼子使用。除了形成不同病毒蛋白質(zhì)的密碼子使用模式外，這些蛋白質(zhì)對(duì)宿主的密碼子使用適應(yīng)程度也影響其在不同源性細(xì)胞中的翻譯。值得注意的是，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株蛋白對(duì)不同宿主表現(xiàn)出高度的密碼子使用適應(yīng)能力，表明該毒株具有在上述宿主細(xì)胞中正常翻譯表達(dá)的潛在能力。已有研究結(jié)果表明，BVDV-2毒株能夠采用與BVDV-1相似的翻譯動(dòng)力學(xué)在豬源細(xì)胞中正常翻譯表達(dá)，并且導(dǎo)致豬相關(guān)組織發(fā)生病變^[43-44]。雖然尚無(wú)BVDV-2侵染駱駝的相關(guān)報(bào)道，但是BVDV-1能夠在駱駝體內(nèi)完成復(fù)制的研究已有報(bào)道^[45]。Qi等^[46]指出BVDV不同毒株對(duì)宿主的感染范圍已經(jīng)從牛擴(kuò)大到了包括羊、豬和駱駝在內(nèi)的其他偶蹄類動(dòng)物。研究人員也注意到，兔子能夠作為BVDV的一種自然疫源性中間宿主來(lái)感染野外放養(yǎng)的牛群，只是兔子對(duì)于BVDV傳播流行方面的作用目前還不是很強(qiáng)^[47]。小鼠已經(jīng)能夠作為一種BVDV試驗(yàn)感染模型來(lái)研究BVDV侵染對(duì)宿主免疫系統(tǒng)抗病毒方面的分子機(jī)制^[48-49]。BVDV在小鼠體內(nèi)順利增殖的生物學(xué)特性同時(shí)也為野外嚙齒類動(dòng)物感染或者攜帶BVDV進(jìn)而感染野外散養(yǎng)牛群增加了潛在風(fēng)險(xiǎn)。鑒于BVDV2d型22-Gansu-F3毒株在本研究中涉及到不同宿主的同義密碼子使用模式的良好適應(yīng)性，有必要加強(qiáng)對(duì)其傳播擴(kuò)散的監(jiān)測(cè)，從而降低BVDV-2d型22-Gansu-F3的傳播流行對(duì)易感動(dòng)物健康的影響。

4 結(jié)論

在本研究中，從具有急性腹瀉癥狀的犢牛腸道內(nèi)容物中成功分離出1株細(xì)胞病變型的田間毒株BVDV-2d型22-Gansu-F3。5′UTR的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果顯示，BVDV-2d型22-Gansu-F3為中國(guó)甘肅省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的BVDV-2d基因亞型田間毒株。雖然BVDV-2d型22-Gansu-F3不是中國(guó)主要流行的BVDV毒株，但該毒株可導(dǎo)致牛急性腹瀉癥狀，并對(duì)牛腸道不同部位造成不同程度的病理?yè)p傷。進(jìn)一步分析該毒株基因組在同義密碼子使用模式方面的遺傳特性，發(fā)現(xiàn)BVDV-2d型22-Gansu-F3對(duì)不同種屬宿主表現(xiàn)出良好的密碼子使用模式上的適應(yīng)性，這有助于今后深入研究BVDV-2亞型毒株在不同宿主體內(nèi)復(fù)制的相關(guān)機(jī)制。同時(shí)，本研究建議將BVDV-2d毒株在國(guó)內(nèi)的傳播流行納入監(jiān)測(cè)范疇，防止其成為國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)流行毒株。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）