靈芝（Ganoderma lucidum）是一種多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體，主要分布于浙江、福建、廣東、吉林、黑龍江等地。靈芝富含多種活性成分，包括多糖、三萜、生物堿、氨基酸、核苷、呋喃、甾醇等，具有提高免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗衰老等功效。2021年，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)、國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布公告，把靈芝列入既是食品又是中藥材的物質(zhì)進(jìn)行試點(diǎn)管理，這意味著靈芝的保健價(jià)值進(jìn)一步被認(rèn)可，市場需求進(jìn)一步增大。

麗水是浙江省的靈芝核心區(qū)，擁有“中華靈芝第一鄉(xiāng)”的稱號(hào)，2010年、2011年，“龍泉靈芝”“龍泉靈芝孢子粉”分別被列為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。因市場準(zhǔn)入門檻低、摻假成本低、獲利高等原因，在生產(chǎn)銷售規(guī)模不斷擴(kuò)大的同時(shí)，麗水市的靈芝產(chǎn)業(yè)面臨著產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、以次充好、缺乏有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)等問題。因此，建立科學(xué)、有效的靈芝質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類方法，使評(píng)判可量化、易操作、更科學(xué)，對(duì)靈芝產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)步發(fā)展具有重要的意義。

近年來，對(duì)靈芝開展質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類研究漸成熱點(diǎn)，主成分分析、因子分析、聚類分析等統(tǒng)計(jì)手段已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品品質(zhì)關(guān)鍵指標(biāo)篩選和質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究。比如，姜濤等利用主成分分析比較了靈芝中5種重金屬元素的差異，從而進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)；袁曉艷等基于HPLC圖譜共有峰，利用聚類分析進(jìn)行了分類；范蕾等基于UPLC-MS/MS開展了靈芝三萜類多指標(biāo)成分測定并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)；林冬梅等利用主成分分析，基于水溶性浸出物、靈芝多糖肽、靈芝酸、靈芝甾醇、單糖組成開展了質(zhì)量評(píng)價(jià)；鞠瑞鑫等利用熵權(quán)逼近理想解排序法，對(duì)不同來源靈芝中的多糖、甾醇、三萜類等9種成分開展了綜合評(píng)價(jià)。目前來看，尚無基于多糖、三萜、氨基酸含量的靈芝質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類的相關(guān)報(bào)道。

本研究以多糖、三萜、氨基酸含量為指標(biāo)，利用因子分析和聚類分析建立了一套靈芝的質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類模型，為靈芝的資源評(píng)價(jià)、品種選育提供了參考和思路。

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器與試劑。U-3900紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司；AL104萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司；Milli-Q Integral 5超純水機(jī)，美國密理博公司；FD-53烘箱，德國BINDER；HH-4恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SD46-1智能電熱板，天津拓至明實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；3-30K高速低溫離心機(jī)，德國Sigma公司。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，C30H48O3，純度96.5%，壇墨質(zhì)檢科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，C6H12O6，純度99.99%，上海麥克林生化科技股份有限公司；氨基酸混標(biāo)，TPE5586，包括天冬氨酸Asp、蘇氨酸Thr、絲氨酸Ser、谷氨酸Glu、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、纈氨酸Val、甲硫氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、組氨酸His、賴氨酸Lys、精氨酸Arg、半胱氨酸Cys共17種，濃度均為2.50μmol/mL，日本日立公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醇、硫酸、蒽酮、鹽酸，均為分析純；MCI緩沖溶液；L-8500-pH試劑盒、茚三酮顯色液試劑盒，日本日立公司。

1.1.2 樣品。采集麗水地產(chǎn)靈芝8份共6個(gè)品種，其中“滬農(nóng)1號(hào)”分別采集了3個(gè)不同產(chǎn)地的樣品，該6個(gè)品種基本涵蓋了麗水地區(qū)的所有靈芝品類。選取當(dāng)季已成熟待采收的靈芝為樣品，每份樣品以梅花布點(diǎn)法在大棚中選取采集點(diǎn)，采集4-5個(gè)大棚，每份樣品采集5kg，具體信息見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理。將采集到的新鮮靈芝洗凈，于50℃烘箱中干燥48h。每份干燥后的樣品用研磨儀充分碾磨，混勻后制成混合樣，過40目尼龍篩，采用四分法縮分至500g左右備用。

1.2.2 多糖檢測。精密稱取約1.0g樣品粉末于圓底燒瓶中，加入50mL超純水，稱重，沸水浴加熱回流提取5h，放冷，用水補(bǔ)足減少的重量，搖勻、過濾。取5.0mL續(xù)濾液，加入無水乙醇45mL，搖勻，冷藏沉淀過夜。10000r/min離心20min，棄去上清液，加入80%乙醇5.0mL渦旋震散，10000r/min離心10min，棄去上清液，沉淀用熱水溶解定容至20.0mL。精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水配置成0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，加入1g/L蒽酮硫酸溶液6.0mL，搖勻，在沸水浴中加熱10min后取出，立即置于冰浴冷卻15min，取出，于625nm比色測量。

1.2.3 三萜檢測。精密稱取約2.0g樣品粉末于具塞錐形瓶中，加乙醇50.0mL，超聲處理45min。過濾后，將濾液置于100.0mL容量瓶中，用適量乙醇分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，混勻。精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配置成0.20mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，置于15mL具塞試管中，揮干、放冷。精密加入新配制的50g/L香草醛冰乙酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15min，立即置冰浴中冷卻5min，取出，精密加入乙酸乙酯4.0mL混勻，于546nm比色測量。

1.2.4 氨基酸檢測。精密稱取約0.20g樣品粉末于水解管中，加入6.0mol/L的HCl溶液5.0mL，氮吹維持8min，管口密封后于110℃水解22h，取出冷卻至室溫，用超純水定容至100.0mL，混勻。取1.0mL濾液于10mL比色管中，真空干燥，加入1.0mL超純水復(fù)溶，過0.22μmPTFE濾膜后，用氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

1.2.5 質(zhì)量控制。每份樣品均進(jìn)行平行雙樣檢測，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并隨機(jī)挑選1份樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類模型的建立方法

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。

采用SPSS 22.0進(jìn)行描述性分析、非參數(shù)檢驗(yàn)、相關(guān)性分析、因子分析和聚類分析。利用因子分析，以多糖、三萜和16種氨基酸為變量指標(biāo)，探索變量指標(biāo)之間的相關(guān)性，提取出少數(shù)幾個(gè)關(guān)鍵、獨(dú)立又可反映變量之間內(nèi)部關(guān)系的公因子，并按照各因子的權(quán)重計(jì)算出綜合得分，建立質(zhì)量評(píng)價(jià)方法模型。利用聚類分析，以多糖、三萜和16種氨基酸為變量指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)自動(dòng)分類，建立品種分類模型。

2. 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

多糖在0.02-0.15mg時(shí)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9994，低（0.02mg）、中（0.05mg）、高（0.10mg）3種加標(biāo)水平下，樣品的加標(biāo)回收率為94.2%-106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%-4.8%（n=6）。三萜在0.02-0.10mg時(shí)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9990，低（0.01mg）、中（0.03mg）、高（0.06mg）3種加標(biāo)水平下，樣品的加標(biāo)回收率為89.1%-102.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%-6.8%（n=6）。16種氨基酸（半胱氨酸除外）在0.02-0.25μmol/mL時(shí)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，低（0.02μmol/mL）、中（0.08μmol/mL）、高（0.15μmol/mL）3種加標(biāo)水平下，樣品的加標(biāo)回收率為80.5%-105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%-5.7%（n=6）。

8份樣品的多糖、三萜和氨基酸檢測結(jié)果見表2和表3。對(duì)8份麗水地產(chǎn)靈芝的多糖、三萜、氨基酸結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，其中三萜、Glu、Met、Ile、Phe、Lys、His7個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布（P＜0.05）。采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)對(duì)8份樣品的18個(gè)指標(biāo)開展非參數(shù)檢驗(yàn)，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)開展兩兩比較。Kruskal-Wallis結(jié)果顯示，除Asp（P=0.075）、Leu（P=0.100）、Phe（P=0.060）外，其余15個(gè)指標(biāo)在樣本間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

多糖的含量范圍為0.234-2.60g/100g，變異系數(shù)為54.88%，樣品間差異明顯。8份樣品中，7號(hào)樣品“滬農(nóng)1號(hào)”和2號(hào)樣品“龍芝2號(hào)”的多糖含量最高，5號(hào)樣品紫芝最低，與姜濤等得出的赤芝多糖含量高于紫芝這一結(jié)論一致。

三萜的含量范圍為0.538-0.917g/100g，變異系數(shù)為22.48%，樣品間存在較大差異。8份樣品中，3號(hào)樣品“113”和7號(hào)、8號(hào)、6號(hào)樣品“滬農(nóng)1號(hào)”的三萜含量最高，4號(hào)樣品“佳寶2號(hào)”最低，與姜濤等得出的三萜含量范圍基本一致。

16種氨基酸的總量范圍為2.92-5.10g/100g，其中，Tyr的變異系數(shù)最大，為66.72%，是本次檢測的所有指標(biāo)中的最大值，說明其在樣品間差異顯著。8份樣品中，5號(hào)樣品紫芝的氨基酸含量最高，8號(hào)樣品“滬農(nóng)1號(hào)”含量最低。

2.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)模型

采用Spearman相關(guān)系數(shù)對(duì)18個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。由表4可知，各指標(biāo)之間均存在一定的相關(guān)關(guān)系。18個(gè)指標(biāo)中，Gly的相關(guān)性最廣，除多糖外，與其他16個(gè)指標(biāo)均存在顯著相關(guān)性，其次為Pro、Glu、Asp、His。多糖的相關(guān)性最少，與其他17個(gè)指標(biāo)均不存在相關(guān)性。相關(guān)性較高的指標(biāo)包括Glu-Ala、Glu-Lys、Glu-His、Gly-Ala、Gly-Pro、Lys-His以及Lys-Arg（r＞0.8，P＜0.01）。

相關(guān)性結(jié)果表明，8份樣品的原始數(shù)據(jù)存在信息重疊，KMO=0.530（＞0.5），Bartlett球形度檢驗(yàn)X2=499.790，P＜0.001，故可選擇因子分析對(duì)上述18個(gè)指標(biāo)進(jìn)行簡化降維，將各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱標(biāo)準(zhǔn)化處理后，篩選出具有代表性的綜合變量，得出質(zhì)量評(píng)價(jià)模型。

為更準(zhǔn)確地開展分析，以特征值大于1且方差貢獻(xiàn)率累計(jì)大于85%的標(biāo)準(zhǔn)，共提取出6個(gè)有效成分，具體結(jié)果見表5。其中，第1公因子F1主要反映Ser、Met、His、Lys、Glu、Gly、Leu、Ala等8項(xiàng)指標(biāo)，方差貢獻(xiàn)率為36.643%，起主導(dǎo)作用，正向作用指標(biāo)占多數(shù)；第2公因子F2主要反映三萜、Arg和Phe，方差貢獻(xiàn)率為16.916%，三萜呈較大的負(fù)向載荷權(quán)數(shù)，但整體正向作用指標(biāo)多于負(fù)向作用指標(biāo)；第3公因子F3主要反映Asp和Ile，正向作用指標(biāo)占多數(shù)，方差貢獻(xiàn)率為9.241%；第4公因子F4主要反映多糖，方差貢獻(xiàn)率為9.214%，雖然多糖呈較大的負(fù)向載荷權(quán)數(shù)，但整體正向作用指標(biāo)多于負(fù)向作用指標(biāo)；第5公因子F5主要反映表Thr，方差貢獻(xiàn)率為8.811%；第6公因子F6主要反映Tyr，方差貢獻(xiàn)率為8.639%。

由成分得分系數(shù)矩陣表可得出6個(gè)公因子的成分得分方程：

F1=0.118X1+0.030X2-0.019X3-0.104X4+0.312X5+0.078X6+0.107X7+0.085X8+0.062X9+0.260X10-0.070X11+0.108X12+0.012X13-0.215X14+0.112X15+0.113X16+0.006X17+0.103X18

F2=-0.525X1+0.032X2-0.215X3-0.094X4-0.285X5+0.073X6-0.037X7+0.052X8+0.203X9-0.215X10+0.001X11+0.003X12-0.016X13+0.288X14+0.091X15+0.042X16+0.253X17-0.085X18

F3=0.246X1+0.060X2+0.609X3-0.097X4-0.274X5+0.170X6+0.165X7-0.187X8-0.325X9+0.150X10+0.486X11-0.170X12-0.253X13+0.226X14-0.127X15+0.133X16+0.126X17+0.099 X18

F4=0.045X1-0.571X2+0.123X3+0.050X4-0.084X5+0.083X6+0.090X7+0.060X8+0.103X9+0.057 X10-0.232X11-0.175X12+0.113X13+0.276X14-0.093X15+0.043X16-0.186X17-0.210X18

F5=0.127X1+0.000X2+0.098X3+0.822X4+0.046 X5-0.141X6-0.175X7+0.129X8+0.036X9-0.307X10-0.205X11+0.341X12-0.108X13+0.150X14+0.053X15-0.112X16-0.142X17+0.107X18

F6=-0.141X1-0.096X2-0.168X3-0.097X4+0.237X5-0.133X6+0.108X7+0.064X8+0.091X9+0.010X10+0.237 X11-0.169X12+0.776X13-0.216X14-0.019X15-0.191X16-0.063X17+0.101X18

根據(jù)6個(gè)公因子的方差貢獻(xiàn)率，確定靈芝的質(zhì)量評(píng)價(jià)模型為：F=0.4096F1+0.1891F2+0.1033 F3+0.1033 F4+0.0985F5+0.0966F6

以8份樣品的多糖、三萜和16種氨基酸檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱標(biāo)準(zhǔn)化處理后，代入公因子綜合評(píng)價(jià)模型計(jì)算得分，結(jié)果見表6。綜合排名最高的為5號(hào)樣品紫芝，綜合排名最低的為8號(hào)樣品“滬農(nóng)1號(hào)”。不以產(chǎn)孢子粉為主的靈芝綜合得分均大于0，排名高于產(chǎn)粉靈芝，說明該模型可區(qū)分出不同靈芝品種間的質(zhì)量差異。同為“滬農(nóng)1號(hào)”的6號(hào)、7號(hào)和8號(hào)樣品，得分也存在差異，說明該模型可區(qū)分同品種不同靈芝樣本間的質(zhì)量差異。綜上所述，以多糖、三萜、氨基酸含量為指標(biāo)進(jìn)行靈芝的質(zhì)量評(píng)價(jià)符合預(yù)期。

2.3 品種分類模型

圖1：8份麗水地產(chǎn)靈芝聚類分析結(jié)果

將多糖、三萜和16種氨基酸的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱標(biāo)準(zhǔn)化處理后，使用系統(tǒng)聚類（Q型）對(duì)8份樣品進(jìn)行分析，聚類方法采用組間聯(lián)接法，以平方歐式距離為區(qū)間判定樣品間的相似度，結(jié)果見圖1。以歐氏距離5為判定臨界點(diǎn)，8份樣品聚集為3類，其中5號(hào)樣品紫芝單獨(dú)為一類，1號(hào)樣品“龍芝1號(hào)”和4號(hào)樣品“佳寶2號(hào)”聚為一類，其余5份產(chǎn)粉靈芝樣品聚為一類；在歐式距離為10時(shí)，5號(hào)樣品紫芝為一類，其他赤芝樣品聚為一類，說明以多糖、三萜、氨基酸含量為指標(biāo)進(jìn)行靈芝的分類判別符合預(yù)期。

3. 結(jié)論

多糖、三萜和氨基酸都是靈芝的主要活性物質(zhì)和功效成分，是靈芝營養(yǎng)價(jià)值的重要體現(xiàn)。多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抑制腫瘤、保肝護(hù)肝等功效；三萜具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血脂血糖等功效；氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，具有維持機(jī)體正常代謝、補(bǔ)充營養(yǎng)、提高免疫力等功效。因此，選擇以多糖、三萜和氨基酸作為靈芝的質(zhì)量指標(biāo)構(gòu)建評(píng)價(jià)模型和分類模型，具有科學(xué)性和可靠性。

傳統(tǒng)方法中，對(duì)靈芝整芝和切片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類時(shí)，皆以形、色、氣、味、質(zhì)地等感官指標(biāo)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，主觀性較強(qiáng)，其準(zhǔn)確度完全取決于檢驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)判斷。本研究以多糖、三萜和氨基酸為指標(biāo)，建立了一套客觀的可量化的靈芝質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種分類的方法模型，可以準(zhǔn)確區(qū)分出不同品種以及同品種不同產(chǎn)地樣本之間的質(zhì)量差異，并得出正確的品種分類，結(jié)果符合預(yù)期，為綜合評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量和品種鑒定提供了新途徑和新思路。

基金項(xiàng)目：麗水市科學(xué)技術(shù)局公益性技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2022GYX37）；麗水市科學(xué)技術(shù)局自籌類公益性技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2023SJZC047）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023KY1379）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（22076072）。

作者簡介：紀(jì)律（1983-），女，漢族，浙江麗水人，副主任技師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槔砘瘷z驗(yàn)。