目的：建立一種快速、高效的雞精調(diào)味料中雞源性成分的提取和分析方法，并應(yīng)用于雞精調(diào)味料真?zhèn)舞b別的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。方法：對(duì)比CTAB法、磁珠法和硅膠柱法提取雞精調(diào)味料中DNA，通過(guò)后期實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)確定DNA的提取效果，建立一整套完善的雞精調(diào)味料中雞源性成分的檢測(cè)方法，并基于建立的方法進(jìn)行雞精調(diào)味料的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。結(jié)果：相比CTAB法，磁珠法和硅膠柱法的提取效果更好，更適合用于雞精調(diào)味料的DNA提取。磁珠法在高通量、快速、操作簡(jiǎn)便方面優(yōu)于硅膠柱法，適合樣品的大批量檢測(cè)，但在DNA破壞較為嚴(yán)重時(shí)，建議結(jié)合硅膠柱法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)，以防誤判?；诮⒌姆椒▽?duì)雞精調(diào)味料產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，30批次樣品發(fā)現(xiàn)2批次未檢出雞源性成分，問(wèn)題發(fā)現(xiàn)率為6.67%。結(jié)論：基于磁珠法建立了高通量、快速及簡(jiǎn)便的雞精調(diào)味料中雞源性成分的檢測(cè)方法，為政府監(jiān)管部門的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞

雞精調(diào)味料 雞源性成分 真?zhèn)舞b別 風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)

基金項(xiàng)目：廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技項(xiàng)目（2022CZ03）；拱北海關(guān)科研項(xiàng)目（2021GK014）

█ Risk Monitoring and Identification of Chicken Derived Material in Chicken Essence Seasoning

ZHUANG Yixie1， ZHANG Juan1*， YAO Lifeng2，Yan Jiajun1， SHE Zhiyun1/1. Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision， China National Quality Supervision and Testing Center for Foods （Guangdong）； 2. Technical Center of Gongbei Customs

Abstract

Objective： To establish an rapid and efficient method for the extraction and analysis of chicken derived material in chicken essence seasoning， and apply to study the risk monitoring for the authenticity identification of chicken essence seasoning. Methods： Compared the CTAB method， magnetic bead method and silica gel column method to extract DNA from chicken essence seasoning， the effect of DNA extraction was determined by real-time PCR. A complete detection method for chicken derived components in chicken essence seasoning was established and the risk monitoring of chicken essence seasoning was carried out based on the established methods. Results： Compared with CTAB method， magnetic bead method and silica gel column method had better extraction effect， and the latter two methods were more suitable for DNA extraction of chicken essence seasoning. Magnetic bead method is superior to silica gel column method in terms of high-throughput， rapid speed and simple operation， which is suitable for mass detection of samples. However， when DNA is seriously damaged， it is recommended to further confirm the amplification results with silica gel column method to prevent misjudgment. Based on the established method， the risk monitoring of chicken essence seasoning products was carried out. It was found that no chicken-derived components were detected in 2 batches of 30 samples， and the problem detection rate was 6.67%. Conclusion： Based on magnetic bead method， a high throughput， rapid and simple method for the detection of chicken-derived components in chicken essence seasoning was established， which provided technical support for the risk monitoring of government supervision departments.

Key words

chicken essence seasoning， chicken derived material， authenticity identification， risk monitoring

0 引言

隨著生活水平不斷提高，消費(fèi)者在選擇調(diào)味品時(shí)越來(lái)越注重其營(yíng)養(yǎng)、健康與安全狀況，現(xiàn)有的味精的鮮度已不能滿足人們對(duì)鮮味的追求[1-3]。雞精作為調(diào)味料行業(yè)的后起之秀發(fā)展迅速，在餐飲行業(yè)被廣泛使用[4-6]。雞精是一種具有鮮味、雞肉味的復(fù)合增鮮調(diào)味料，含有多種氨基酸與蛋白質(zhì)，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7-9]。雞精調(diào)味料中雞肉原料在提高產(chǎn)品的特征風(fēng)味的同時(shí)，還可以提升產(chǎn)品的品質(zhì)，其中雞肉的添加量和加工工藝直接影響到產(chǎn)品的成本和利益[10-13]。SB/T 10371—2003《雞精調(diào)味料》和SB/T 10415—2007 《雞粉調(diào)味料》中均規(guī)定，以雞肉/雞骨的粉末或其濃縮提取物為原料加工而成的復(fù)合調(diào)味料，即明確規(guī)定了“雞精中必須含有雞源性成分”。標(biāo)準(zhǔn)希望通過(guò)測(cè)定雞精中總氮及其他氮的含量來(lái)作為衡量雞精中是否含有雞肉的標(biāo)準(zhǔn)，但含氮量可以通過(guò)其他添加物來(lái)實(shí)現(xiàn)，所以并不能體現(xiàn)雞肉成分的有無(wú)[14-16]。基于上述問(wèn)題的存在，尚無(wú)明確的針對(duì)雞精調(diào)味料中是否存在雞源性成分的檢測(cè)方法。然而目前市場(chǎng)上，雞精產(chǎn)品紛繁多樣，質(zhì)量參差不齊，甚至存在“雞精無(wú)雞”的問(wèn)題，嚴(yán)重侵害消費(fèi)者的利益[17，18]。如何快速甄別真假雞精調(diào)味料成為亟待解決的問(wèn)題。以基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象的實(shí)時(shí)熒光PCR方法已廣泛應(yīng)用于物種成分鑒定，具有特異性好和靈敏度高的特點(diǎn)[19-21]?，F(xiàn)階段政府風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)任務(wù)推薦可以借鑒的檢測(cè)方法為GB/T 38164—2019《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》中雞源性成分的檢測(cè)，然而雞精中的成分復(fù)雜且加工工藝繁瑣，對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR的干擾因子較多，能否高效地獲取深加工產(chǎn)品中殘留的DNA成為制約該檢測(cè)方法成功與否的關(guān)鍵問(wèn)題[22-24]。為驗(yàn)證該檢測(cè)方法對(duì)于雞精調(diào)味料中雞源性成分檢測(cè)的有效性及可行性，本研究基于該檢測(cè)方法檢測(cè)雞精調(diào)味料中的雞源性成分，重點(diǎn)解決DNA的提取和富集問(wèn)題，同時(shí)基于該檢測(cè)方法對(duì)市面上的雞精調(diào)味料中雞源性成分真?zhèn)螌傩赃M(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，以期為雞精調(diào)味料的安全監(jiān)管提供技術(shù)支持和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞精調(diào)味料：市售

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、蛋白酶K（均為分析純）、食品基因組提取試劑盒（Food DNA Kit）、核酸提取試劑、Premix Taq DNA聚合酶、引物。

1.2 儀器與設(shè)備

QuantStudio 7 Flex 熒光PCR儀；Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)；3-30K高速冷凍離心機(jī)；Thermomixer comfort恒溫混勻儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取方法

樣品前處理：取500 mg樣品于適宜離心管中，加入2 mL無(wú)菌水，50℃溫育1 h，待樣品重復(fù)溶解后，12000g 離心5 min，棄濾液，沉淀物用于后續(xù)DNA提取。CTAB法參考GB/T 38164的方法，同時(shí)需另外加入20 μL 20 mg/mL蛋白酶K；磁珠法和硅膠柱法分別依據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 DNA濃度和純度的測(cè)定

通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA在260 nm和280 nm處的吸光值，通過(guò)OD260/OD280比值判斷提取的DNA的純度。該比值在1.7 ～ 2.1之間，說(shuō)明DNA純度較高。DNA濃度根據(jù)1 OD260=50 μg/mL雙鏈DNA估算。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

依據(jù)GB/T 38164—2019《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》對(duì)雞源性成分進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)液12.5 μL，引物各0.5 μL，探針0.5 μL，DNA模板5 μL，雙蒸水6.0 μL，總體積為25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、40 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 雞源性成分風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)

基于前期建立的檢測(cè)方法，對(duì)從市場(chǎng)上抽檢的30批次雞精調(diào)味料產(chǎn)品進(jìn)行是否含有雞源性成分的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，摸查現(xiàn)有雞精調(diào)味料產(chǎn)品的質(zhì)量情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果判定依據(jù)循環(huán)數(shù)（Ct）值，原則如下：

當(dāng)Ct值≤35.0，則判定被檢樣品為陽(yáng)性；

當(dāng)Ct值≥40.0，則判定被檢樣品為陰性；

當(dāng)35.0

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取效率

為提高DNA的提取效率，在加大取樣量的前提下，對(duì)比樣品處理前后提取DNA的效果（以2個(gè)不同樣品為例，分別標(biāo)記為S1和S2）。經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定，3種DNA提取方法所獲得的DNA濃度和純度結(jié)果如表1所示，每個(gè)樣品均作平行。由表1可知，3種方法在樣品前處理之后，DNA濃度均有所提高，表明該前處理方法有提高雞精DNA濃度的效果。本次對(duì)2個(gè)樣品分別進(jìn)行3種不同方法的DNA提取，2個(gè)樣品的DNA提取濃度有較大差異，推測(cè)與雞精的不同生產(chǎn)工藝有較大關(guān)系；S2樣品的生產(chǎn)工藝相對(duì)S1樣品對(duì)DNA的破壞較為嚴(yán)重，從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，尚不能滿足后續(xù)熒光PCR檢測(cè)需求。對(duì)比樣品處理后3種提取方法的提取效果，S1樣品中硅膠柱法的提取效果最好，在DNA濃度差異不大的情況下，DNA純度在1.7 ～ 2.1的范圍內(nèi)，表明該方法去除雜質(zhì)效果最好；磁珠法提取的DNA純度去除雜質(zhì)效果也較好，在1.68 ～ 1.78范圍內(nèi)；CTAB法提取的DNA濃度雖然相比其他2種方法較高，但DNA純度較低（1.28 ～ 1.33），去雜質(zhì)效果較弱。S2樣品中3種方法的DNA提取濃度雖然不高，但硅膠柱法和磁珠法的DNA純度較好，基本符合要求。綜合上述結(jié)果分析，硅膠柱法和磁珠法提取純度和效率優(yōu)于CTAB法，更適合用于雞精的DNA提取，與這2種方法分別具有純化過(guò)程和特異性富集過(guò)程有較大關(guān)系。提取純度決定后續(xù)熒光PCR的擴(kuò)增效果和靈敏度，提取效率決定后續(xù)檢測(cè)方法的便利性。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

雞精調(diào)味料S1和S2基因組DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1 ～ 圖4。從圖1和圖3可以看出，3種提取方法獲得的2個(gè)雞精調(diào)味料樣品的基因組DNA均能擴(kuò)增出內(nèi)參基因（18S rRNA基因），循環(huán)數(shù)（Ct）值介于19 ～ 23之間，呈現(xiàn)典型的“S”形曲線，其中S1的熒光強(qiáng)度明顯高于S2的熒光強(qiáng)度，與2個(gè)樣品的起始濃度相對(duì)應(yīng)。如圖2所示，3種提取方法獲得S1的基因組DNA均能擴(kuò)增出雞特異性基因ND1，Ct值介于20 ～ 25之間，呈現(xiàn)典型的“S”形曲線，其中硅膠柱法和磁珠法的熒光強(qiáng)度明顯高于CTAB法的熒光強(qiáng)度，且Ct值小于后者，與2.1中3種方法DNA的提取效率相對(duì)應(yīng)。雞精調(diào)味料S2樣品因基因組DNA提取效果一般（見(jiàn)表1），導(dǎo)致其熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果熒光信號(hào)相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照較弱（見(jiàn)圖4），其中CTAB法提取的DNA未出現(xiàn)有效擴(kuò)增。硅膠柱法和磁珠法的Ct值分別為23和29，相對(duì)S1樣品的擴(kuò)增Ct值偏大。綜上所述，對(duì)比DNA提取效率和熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果分析，硅膠柱法和磁珠法更加適合于雞精調(diào)味料的DNA提取和擴(kuò)增，在S2樣品DNA提取效果不佳的情況下（考慮該結(jié)果由生產(chǎn)工藝造成），上述2種提取方法獲得的DNA仍能進(jìn)行有效擴(kuò)增，滿足后續(xù)雞源性成分結(jié)果判定的要求。硅膠柱法相比磁珠法，DNA提取效率和熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果均優(yōu)于后者，考慮到DNA提取過(guò)程的繁瑣程度，在實(shí)際操作中可先用磁珠法（全自動(dòng)提?。┻M(jìn)行快速提取檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果難以進(jìn)行判定時(shí)，再用硅膠柱法進(jìn)行下一步的確認(rèn)，在不影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，有效提高檢測(cè)工作效率。

2.3 雞精調(diào)味料風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果

基于上述的DNA提取和擴(kuò)增結(jié)果比較，風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)采用硅膠柱法和磁珠法同時(shí)進(jìn)行雞精調(diào)味料產(chǎn)品的DNA提取，并對(duì)比2種提取方法的熒光PCR結(jié)果進(jìn)行最終結(jié)果的判定。結(jié)果表明，2種提取方法獲得較為一致的擴(kuò)增結(jié)果，其中磁珠法極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間且人工依賴程度低，有效提高了檢測(cè)效率。本次監(jiān)測(cè)雞精調(diào)味料類產(chǎn)品共計(jì)30批次，檢出雞源性成分的產(chǎn)品有28批次，未檢出雞源性成分的產(chǎn)品有2批次，問(wèn)題發(fā)現(xiàn)率為6.67%。其中未檢出雞源性成分的產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)含有雞油，檢出雞源性成分的產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)含有雞肉、雞肉粉、雞肉蛋白粉及雞膏等（見(jiàn)表2）。不同類型的雞精調(diào)味料產(chǎn)品雖然因生產(chǎn)工藝的不同對(duì)DNA造成不同程度的破壞，加之配方的不同增加了提取DNA的干擾成分，造成熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果的很多不確定性，但風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，針對(duì)該類特殊產(chǎn)品，現(xiàn)有的監(jiān)測(cè)方法可有效地提取雞精調(diào)味料中DNA，熒光PCR擴(kuò)增效果可滿足日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的需求。

3 結(jié)論

食品及其加工產(chǎn)品基因組DNA的提取效果是影響后續(xù)分子生物學(xué)檢測(cè)的重要因素之一[24-27]。雞精調(diào)味料是利用肉雞加工中的副產(chǎn)品進(jìn)行深加工，采用高溫高壓等烹飪工藝，DNA分子易受到破壞[28]。從DNA提取效率和熒光PCR的擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，不同產(chǎn)品類型DNA破壞程度有所不同，但均能獲取可滿足結(jié)果判定的DNA，其中硅膠柱法和磁珠法提取效果優(yōu)于CTAB法，考慮到便利性的前提下，優(yōu)先推薦磁珠法提取雞精調(diào)味料產(chǎn)品的DNA。但當(dāng)遇到雞精調(diào)味料產(chǎn)品的DNA提取效果不佳時(shí)，建議結(jié)合磁珠法進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果，以防誤判。

本研究對(duì)雞精調(diào)味料中的雞源性成分檢測(cè)進(jìn)行方法驗(yàn)證和優(yōu)化，可滿足該類產(chǎn)品中雞源性成分的檢測(cè)，解決了標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)雞肉成分是否存在的問(wèn)題，對(duì)打擊假冒偽劣雞精調(diào)味料產(chǎn)品提供技術(shù)支撐。因真正的雞精調(diào)味料勢(shì)必會(huì)比僅添加香精的產(chǎn)品成本高，而目前現(xiàn)行的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)雞精調(diào)味料中雞源性成分檢測(cè)做出相應(yīng)規(guī)定，勢(shì)必會(huì)造成某些商家為了節(jié)約成本而欺騙消費(fèi)者。國(guó)內(nèi)關(guān)于雞精調(diào)味料中雞源性成分的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)研究較少[29-30]，現(xiàn)有研究證實(shí)確實(shí)存在假冒偽劣產(chǎn)品，本研究為后續(xù)該類產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)管提供可行的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)方案。█

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