關(guān)鍵詞 無機(jī)汞；腎臟毒性；質(zhì)譜成像；代謝物；毒性機(jī)理

在環(huán)境中，汞主要以元素汞（Hg0）、無機(jī)汞（Hg（Ⅱ））和有機(jī)汞（如甲基汞）的化學(xué)形態(tài)存在[1-2]。汞經(jīng)呼吸、飲食或皮膚暴露等途徑進(jìn)入機(jī)體后，過量的汞累積可能會導(dǎo)致汞中毒或其它潛在的健康危害[3]。這主要是由于汞易在體內(nèi)蓄積，難以被機(jī)體排出。據(jù)Farris 等[4]報道，人體經(jīng)一次性靜脈注射0.6～2.8 μg的放射性Hg（Ⅱ），暴露70 d 后，僅有約30%和25%的汞可分別通過糞便和尿液排出，其體內(nèi)半衰期可達(dá)49～120 d。因此， Hg（Ⅱ） 暴露會對腎臟、神經(jīng)、心血管、血液、免疫和生殖系統(tǒng)造成不同程度的損傷[5]。

大量研究已證實，腎臟是無機(jī)汞（Hg（Ⅱ））的主要靶器官之一[6]。Hg（Ⅱ）經(jīng)體循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)腎臟后，主要在腎皮質(zhì)以及外髓質(zhì)區(qū)域累積，特別是近曲小管段[7]。這是由于腎小管膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了Hg（Ⅱ）的轉(zhuǎn)運(yùn)[8]，包括近端小管基底外側(cè)膜上的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和管腔膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9]。最終，Hg（Ⅱ）的局部累積會對腎臟的近端小管、遠(yuǎn)端小管和腎小球膜造成破壞，并導(dǎo)致刷狀邊界膜的損傷和壞死[6]。

目前，臨床診斷汞中毒引起的腎功能異常主要依賴于監(jiān)測血尿素氮（Blood urea nitrogen， BUN）和血清肌酐（Serum creatinine， Scr）等常規(guī)生化指標(biāo)。然而，在實際應(yīng)用中，利用這些生化指標(biāo)評價腎功能仍具有一定的局限性。通常，只有當(dāng)患者的腎臟功能損傷較為嚴(yán)重時上述指標(biāo)才會發(fā)生顯著性變化，因此難以進(jìn)行早期診斷[10]。另一方面，質(zhì)譜成像（Mass spectrometry imaging， MSI）技術(shù)可用于原位解析生物組織中分子的空間分布規(guī)律，對生物分子進(jìn)行定性、定量和定位分析，并且無需復(fù)雜的樣本前處理即可實現(xiàn)生物標(biāo)志物的快速和精準(zhǔn)識別[11]。例如，基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像（MALDI-MSI）和解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（DESI-MSI）已被成功地應(yīng)用于腎臟研究[12-13]。Irie 等[14]報道，經(jīng)1 mg/mL 順鉑腹腔注射3 h 后，利用MALDI-MSI即可觀察到腎臟內(nèi)的代謝異常，但傳統(tǒng)方法只能在給藥72 h 后檢出BUN 的升高。因此，應(yīng)用MSI 技術(shù)能夠揭示早期或亞臨床的腎臟損傷特征，為汞暴露的腎臟毒性研究提供了一種有效手段。

近年來，在DESI-MSI 的基礎(chǔ)上， He 等[15]開發(fā)了一種具有覆蓋范圍廣、靈敏度高和動態(tài)范圍寬等特點的空氣動力輔助解吸電噴霧質(zhì)譜成像（AFADESI-MSI）技術(shù)。為探究Hg（Ⅱ）暴露造成腎臟損傷的主要特征及潛在機(jī)理，本項研究采用AFADESI-MSI 技術(shù)，考察了飲用水Hg（Ⅱ）暴露造成的小鼠腎臟損傷特征。同時，結(jié)合組織病理分析，解析了Hg（Ⅱ）對腎臟尿素循環(huán)與谷胱甘肽代謝途徑的關(guān)鍵代謝物的影響（圖1），初步探究了Hg（Ⅱ）的腎臟毒性效應(yīng)與潛在的作用機(jī)理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AFAI-MSI 系統(tǒng)（北京維科托科技有限公司）和Orbitrap Exploris120 靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher Scientific 公司）用于MSI 分析；Microm HM525 冰凍切片機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）用于制備腎臟冷凍切片樣本；XS-37C 三目倒置生物顯微鏡（上海蒲柘光電儀器有限公司）用于腎組織切片的病理分析；EQ7000 純水儀（美國Millipore 公司）用于制備實驗用超純水。

HgCl₂（99.7%，中國化工進(jìn)出口公司）；磷酸鹽緩沖液（北京索來寶科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；OCT包埋粘合劑（美國Sakura Finetek公司）；水合氯醛溶液（10%， m/V，上海源葉生物科技有限公司）；正電荷防脫載玻片（4951 PLUS-001E，美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 動物實驗

雌性BALB/c 小鼠（7～8周齡，體重（18±1） g）購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。對小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組5 只，飼養(yǎng)于12 h 光照/黑暗循環(huán)的環(huán)境中，保持溫度為（21±2） ℃，濕度為50%±5%。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d 后，對暴露組小鼠進(jìn)行飲用水Hg（Ⅱ）暴露。美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）規(guī)定，飲用水中汞的最高限值為0.02 mg/L[16]。依據(jù)人類和小鼠的暴露劑量換算方法[17]，該限值換算后相當(dāng)于小鼠0.25 mg/L 暴露劑量。此外，在汞的污染和極端污染地區(qū)，地下水中汞的濃度可達(dá)0.16～0.23 mg/L 和0.78～12.40 mg/L[18-19]，換算后的暴露劑量為1.98～2.82 mg/L和9.59～152.52 mg/L。因此，選擇0.3、3.0和60.0 mg/L作為暴露劑量，開展為期28 d的飲用水Hg（Ⅱ）暴露實驗。

在暴露期間，每2 d 對小鼠體重進(jìn)行測量并記錄。在暴露第28 天，使用水合氯醛溶液對小鼠進(jìn)行麻醉后，斷頸處死，收集腎臟樣本。腎臟樣本經(jīng)稱重后，立即置于液氮中冷凍，并放置于–80 ℃冰箱中保存。本研究已獲得中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心動物倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號AEWC-RCEES-2024041）。

1.3 血液生化分析

Scr采用肌酐氧化酶法測定，BUN采用尿素酶法測定，所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。分析過程按試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.4 質(zhì)譜成像

將腎臟樣本從–80 ℃冰箱取出后，置于–20 ℃冰箱過夜解凍。利用OCT 包埋膠將腎臟樣本橫向固定在冰凍切片機(jī)的切割臺上，對組織進(jìn)行連續(xù)切片，并將厚度為12 mm 的組織切片置于載玻片上，保存于–80 ℃冰箱中。進(jìn)行MSI 前，將切片樣本從–80 ℃冰箱轉(zhuǎn)移至–20 ℃冰箱進(jìn)行過夜解凍。在開始MSI實驗前30 min， 將干燥器置于–20 ℃冰箱中預(yù)冷，繼而轉(zhuǎn)移切片樣本至干燥器內(nèi)，并在室溫條件進(jìn)行真空干燥。之后，將干燥后的切片樣本固定在電移動臺上，分別采用正、負(fù)離子模式， x 軸方向以0.15 mm/s的速率進(jìn)行連續(xù)掃描， y 軸方向以0.15 mm/s 的垂直臺階式分開，掃描范圍設(shè)置為100～1000 Da。最大注入時間為200 ms，正離子模式下噴霧電壓為4500 V， 負(fù)離子模式下噴霧電壓為4000 V，離子傳輸管電壓為±3000 V，溫度為350 ℃。以乙腈-水（8∶2，V/V）為溶劑，流速設(shè)置為5 μL/min；以氮氣（0.5 MPa）為載氣，流量設(shè)置為45 L/min。為扣除背景信號，選擇載玻片上的空白區(qū)域作為對照，設(shè)置質(zhì)荷比容差Δm/z=0.05，讀取離子類型、相對強(qiáng)度和空間位置等信息。使用Xcalibur 軟件（版本4.6.0.100，美國Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Xcalibur 4.6.0.100軟件將數(shù)據(jù)原始文件轉(zhuǎn)換為cdf 格式，使用Mass Imager Pro 1.0 軟件進(jìn)行成像分析，并采用Origin 2021軟件繪制質(zhì)譜圖。暴露組與對照組之間的差異采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）檢驗。當(dāng)plt;0.05 時，為顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 Hg（Ⅱ）經(jīng)口暴露致腎臟損傷的組織病理特征

據(jù)報道， Hg（Ⅱ）暴露可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死、無尿以及腎功能衰竭等癥狀[20]。實驗結(jié)果顯示，相較于對照組，經(jīng)28 d 飲用水Hg（Ⅱ）暴露后，小鼠的體重輕微降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性，表明高劑量飲用水Hg（Ⅱ）暴露在一定程度上影響了小鼠的生長（圖2A）。當(dāng)Hg（Ⅱ）暴露劑量為60 mg/L 時，腎體比升高了1.43 倍（圖2B），并且BUN（圖2C）與Scr（圖2D）分別升高了1.26 與1.30 倍。BUN和Scr是評價腎功能的重要指標(biāo)，可指示腎臟損傷的發(fā)生[21-22]。上述結(jié)果說明， 60 mg/L 飲用水Hg（Ⅱ）暴露可顯著破壞腎功能，造成腎臟損傷。然而，當(dāng)暴露低劑量Hg（Ⅱ）時，并未觀測到上述指標(biāo)的顯著變化，難以判斷腎臟的損傷程度，因此需要使用更靈敏和更準(zhǔn)確的評價方法。

蘇木精-伊紅（Hamp;E）染色法是一種經(jīng)典的組織損傷評價方法，常被應(yīng)用于毒理學(xué)和醫(yī)學(xué)研究，可對器官的組織結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。為揭示低劑量Hg（Ⅱ）暴露造成的腎臟損傷，首先采用Hamp;E 染色法對3 mg/L Hg（Ⅱ）暴露后的小鼠腎臟進(jìn)行組織病理檢查，如腎小管和腎小球等結(jié)構(gòu)的變化，為后續(xù)的MSI 分析提供依據(jù)。如圖3A～3H 所示，相較于對照組，暴露組的腎小球與髓質(zhì)區(qū)域均未發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)改變，但暴露組的腎小管上皮細(xì)胞變得扁平，有從基底膜上脫落的跡象，管腔輕微擴(kuò)張，腎小管較多刷狀緣脫落，局灶基底膜斷裂。此外，暴露組的腎間質(zhì)出現(xiàn)水腫，腎小管間質(zhì)血管發(fā)生擴(kuò)張充血，皮質(zhì)區(qū)域還出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤。進(jìn)一步，對皮質(zhì)區(qū)域損傷的組織形態(tài)進(jìn)行了定量分析（圖3I）。結(jié)果表明，相較于對照組，暴露組的腎臟損傷較大，具有統(tǒng)計學(xué)意義（plt;0.05），詳細(xì)的評分標(biāo)準(zhǔn)見電子版文后支持信息表S1。據(jù)文獻(xiàn)報道， Hg（Ⅱ）的腎臟毒性主要表現(xiàn)為近端小管直段的損傷，嚴(yán)重時可擴(kuò)展至近端小管彎曲段以及遠(yuǎn)端小管[23]。早期病變伴隨著近端小管刷狀邊界膜喪失，并導(dǎo)致尿中出現(xiàn)堿性磷酸酶和谷酰轉(zhuǎn)肽酶。當(dāng)近端小管損傷嚴(yán)重時，丙氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基酸葡萄糖苷酶也會隨尿液排出。此外，隨腎小球濾過率的下降，還會發(fā)生蛋白尿[6]。

綜上，飲用水Hg（Ⅱ）暴露會造成腎小管及間質(zhì)的輕微病變，可能與Hg（Ⅱ）導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡等多種機(jī)制相關(guān)[6]。此外，腎小管管腔擴(kuò)張和間質(zhì)水腫亦可能與Hg（Ⅱ）對腎臟代謝途徑的干擾有關(guān)，這種管腔擴(kuò)張和間質(zhì)水腫會破壞腎臟功能，影響腎臟的濾過和排泄能力。

2.2 Hg（Ⅱ）暴露對腎臟中尿素代謝物的空間分布的影響

腎臟是機(jī)體的主要代謝器官之一，而內(nèi)源性分子的代謝紊亂在多種腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有不可忽視的作用，因此，研究腎臟組織中內(nèi)源性代謝物的變化對揭示腎臟損傷的機(jī)制及病變過程具有重要的參考價值。尿素循環(huán)是維持體內(nèi)氨平衡的關(guān)鍵代謝途徑（圖4A），其中間產(chǎn)物的變化能夠反映腎臟功能狀態(tài)[24]。尿素和肌酐常被視為評價腎臟功能的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，如腎臟的過濾、重吸收及排泄能力，反映腎小球濾過率的變化等[6]。機(jī)體還通過尿素循環(huán)生成精氨酸（Arginine）、瓜氨酸（Citrulline）和鳥氨酸（Ornithine）等內(nèi)源氨基酸，用于蛋白合成、代謝調(diào)節(jié)和信號調(diào)控等生物過程。例如，精氨酸是尿素循環(huán)過程的重要中間產(chǎn)物，可通過精氨酸脫酸酶的水解作用代謝為尿素（Urea）和鳥氨酸，后者在精氨酸琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂解酶的共同作用下轉(zhuǎn)化為肌酸（Creatine）。繼而，肌酸在肌酸激酶活性的作用下轉(zhuǎn)化為肌酐（Creatinine）。當(dāng)腎臟功能受損時，腎小球的濾過能力下降，會導(dǎo)致血液的肌酐水平上升[25]。同時，作為亞精胺（Spermidine）的主要前體，精氨酸在精氨酸酶的催化作用下，會被轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素，隨后鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為腐胺（Putrescine），最終腐胺通過ATP 活化反應(yīng)生成亞精胺。

在Hamp;E 染色法分析組織病理的基礎(chǔ)上，MSI 法可進(jìn)一步解析腎臟內(nèi)關(guān)鍵代謝物的空間分布特征，在分子水平上提供更豐富的腎臟損傷信息。本研究基于AFADESI-MSI 技術(shù)對Hg（Ⅱ）暴露影響尿素循環(huán)的規(guī)律進(jìn)行了初步探究。如圖4B 所示，在正常小鼠的腎臟中，精氨酸主要分布于皮質(zhì)及腎盂區(qū)域，而Hg（Ⅱ）暴露導(dǎo)致髓質(zhì)區(qū)域的精氨酸含量顯著升高，其中，髓質(zhì)、皮質(zhì)和腎盂區(qū)域的信號強(qiáng)度分別升高了2.74、1.12 和1.69 倍（表1 和電子版文后支持信息圖S2）。亞精胺主要分布于皮質(zhì)及外髓質(zhì)區(qū)域，Hg（Ⅱ）暴露引起皮質(zhì)區(qū)域亞精胺的含量增加，其中，皮質(zhì)、腎盂、內(nèi)髓質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域分別增加5.33、4.35、1.64 和1.75 倍。肌酸和肌酐均主要分布在皮質(zhì)和腎盂區(qū)域， Hg（Ⅱ）暴露引起兩者的空間分布變化類似，主要為腎盂和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域的含量增加。相較于對照組， Hg（Ⅱ）暴露后，在皮質(zhì)、腎盂和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域的肌酸含量分別增加1.30、3.57 和4.42 倍，而肌酐分別增加1.16、3.70 和4.56 倍。上述結(jié)果說明，腎臟中精氨酸水平升高會造成其下游代謝物亞精胺、肌酸和肌酐的腎臟累積。此結(jié)果與文獻(xiàn)[26-27]報道結(jié)果一致，即急性Hg（Ⅱ）暴露會引起尿素、肌酐等腎功能標(biāo)志物水平顯著升高。另有研究表明，經(jīng)1 mg/kg Hg（Ⅱ）暴露28 d后，大鼠體內(nèi)的肌酐、血清尿素和血尿素氮水平會顯著上升[25]。此外， Hg（Ⅱ）暴露還會抑制體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)移酶活性，這可能與鳥氨酸及亞精胺濃度升高有關(guān)，進(jìn)而影響腎臟功能[27]；Hg（Ⅱ）還可能作用于有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2 和多藥及毒素外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，造成腎臟的肌酐排出受限，導(dǎo)致其在體內(nèi)累積[26]。值得注意的是，盡管利用血生化法分析時， 3 mg/L 暴露組的血清肌酐濃度未顯著變化，但MSI 結(jié)果證實腎臟組織中肌酐的含量顯著上升，特別是在腎盂和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域。上述結(jié)果表明，相較于常用的血生化測試， MSI 法能夠更靈敏地檢測出腎臟損傷的生物標(biāo)志物變化，同時提供豐富的空間分布信息，有助于腎臟損傷的精準(zhǔn)診斷與健康風(fēng)險評價。

2.3 Hg（Ⅱ）暴露對腎臟的谷胱甘肽代謝的影響

在機(jī)體正常代謝過程中，含巰基（–SH）的生物分子（氨基酸、多肽和蛋白酶）發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、信號傳遞與調(diào)控和催化生化反應(yīng)等。例如，作為關(guān)鍵的抗氧化分子，還原性谷胱甘肽（GSH）可被谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），同時將過氧化氫（H2O2）還原成水（H2O），維持機(jī)體的氧化還原穩(wěn)態(tài)（圖5A）。半胱氨酸（Cys）是GSH 合成的主要來源[28-29]。在谷胱甘肽合成酶的作用下，Cys 可與谷氨酸（Glu）發(fā)生反應(yīng)，生成γ-谷氨酸半胱氨酸（γ-GCS），進(jìn)而在谷氨酰胺合成酶的作用下與甘氨酸（Gly）結(jié)合，最終形成GSH。由于汞具有較高的電子親和力，而巰基中的硫原子具有較高的電負(fù)性，兩者成鍵（–S–Hg–）的穩(wěn)定常數(shù)可達(dá)10²⁰～10³⁰[20，30-32]。在腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，Hg（Ⅱ）會與Cys 反應(yīng)生成Cys-Hg-Cys，還會與GSH 反應(yīng)生成GS-Hg-SG，這些復(fù)合物可通過腎小球過濾轉(zhuǎn)移至近端小管的管腔以及基底，參與Hg（Ⅱ）的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝過程[23，33]。因此，為揭示Hg（Ⅱ）的腎臟毒性機(jī)理，采用AFADESI-MSI 技術(shù)研究了Hg（Ⅱ） 暴露對谷胱甘肽及其主要代謝物的影響。

如圖5B所示，在正常小鼠的腎臟中，GSH 和GSSG 主要分布于腎髓質(zhì)區(qū)域。Hg（Ⅱ）暴露會引起GSH和GSSG含量分別增加1.38 和1.48 倍。同時，Hg（Ⅱ）暴露可能促進(jìn)GSH 被氧化為GSSG，這可能是GSSG水平增加高于GSH 的原因。據(jù)報道，Hg（Ⅱ）暴露可導(dǎo)致小鼠腎臟組織中GSH 的上升[34]。由于GSH 在抵抗ROS 介導(dǎo)的組織損傷過程中起重要作用，因此腎臟組織中GSH 水平升高可能對氧化損傷具有保護(hù)作用，以清除Hg（Ⅱ）誘導(dǎo)生成的ROS[35]。此外，Cys 主要分布在腎盂、皮質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域， Hg（Ⅱ）暴露后，這些區(qū)域的Cys 含量分別增加了2.36、1.31 和2.13 倍（表2）。據(jù)報道， Hg（Ⅱ）暴露能促進(jìn)Cys 的合成，可能是因為Hg（Ⅱ）可與Cys 中的巰基結(jié)合，造成蛋白酶失活，進(jìn)而破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)[35-36]。綜上，GSH、GSSG 和Cys 含量的增加可能是腎臟細(xì)胞對Hg（Ⅱ）暴露的一種氧化應(yīng)激響應(yīng)，證實Hg（Ⅱ）可通過擾亂氧化還原穩(wěn)態(tài)造成腎臟損傷。

3 結(jié)論

本研究利用MSI 技術(shù)解析了飲用水中Hg（Ⅱ）暴露對小鼠腎臟的尿素循環(huán)及谷胱甘肽相關(guān)代謝產(chǎn)物空間分布與含量的影響。Hamp;E 組織病理分析表明，經(jīng)3 mg/L Hg（Ⅱ）暴露28 d 后，腎小管管腔輕微擴(kuò)張，上皮細(xì)胞扁平，間質(zhì)中度擴(kuò)張充血，同時出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤等病變。進(jìn)一步采用AFADESI-MSI 分析發(fā)現(xiàn)， Hg（Ⅱ）暴露引起腎臟組織中精氨酸、亞精胺、肌酸和肌酐等腎損傷標(biāo)志代謝物水平顯著上升，干擾了谷胱甘肽的正常代謝。上述結(jié)果說明， Hg（Ⅱ）可通過造成氧化應(yīng)激損傷破壞腎臟功能，干擾正常的尿素循環(huán)。同時，相較于血生化分析，MSI 法可更靈敏地檢出腎臟損傷的生物標(biāo)志物變化，如肌酐。相較于以往的研究，本研究采用MSI 技術(shù)對典型代謝物進(jìn)行解析，有助于深入理解Hg（Ⅱ）的腎臟毒性特征與作用機(jī)理，為汞中毒的臨床診斷提供了新的視角。在后續(xù)研究中，將繼續(xù)采用MSI 技術(shù)識別Hg（Ⅱ）暴露的潛在生物標(biāo)志物，并揭示Hg（Ⅱ） 造成腎臟損傷可能的分子機(jī)制。